PLoS ONE: S100A6 Eiwit regelt Negatief CacyBP /SIP-gemedieerde remming van Gastric Cancer Cell proliferatie en Tumorigenesis

Abstract

Calcyclin-bindend eiwit (CacyBP /SIP), geïdentificeerd op basis van zijn vermogen om te communiceren met S100 eiwitten in een calcium-afhankelijke wijze, is eerder gevonden dat de proliferatie en tumorigenese van maagkanker cellen in ons laboratorium remmen. Belangrijk is dat de effecten van S100 eiwitten op het biologische gedrag van CacyBP /SIP bij maagkanker onduidelijk. Hierin melden wij de constructie van eukaryotische expressievectoren voor wild-type CacyBP /SIP en een afgeknotte mutant die de S100-eiwit bindende domein (CacyBP /SIPΔS100). De uitdrukking van de wild-type en afgeknotte recombinante eiwitten werden aangetoond door transfectie van MKN45 maagkanker cellen. Co-immunoprecipitatie assays aangetoond interactie tussen S100A6 en wild-type CacyBP /SIP in MKN45 cellen. Verwijdering van de S100-eiwit bindende domein drastisch verminderd de affiniteit van CacyBP /SIP voor S100 eiwitten zoals aangegeven door verminderde co-immunoprecipitatie van S100A6 door CacyBP /SIPΔS100. De MTT-test, FACS assay, klonogene assay en tumor xenograft experimenten werden uitgevoerd om het effect van CacyBP /SIP op de celgroei en het ontstaan ​​van tumoren In vitro Kopen en evalueren In vivo
. Overexpressie van CacyBP /SIP remde de proliferatie en tumorigenese van MKN45 maagkanker cellen; de proliferatie en tumorigenese snelheden werden nog verder verminderd door de expressie van CacyBP /SIPΔS100. We toonden ook aan dat S100 eiwitten negatief reguleren CacyBP /SIP-gemedieerde remming van de maag proliferatie kankercel, door een effect op β-catenine eiwitexpressie en transcriptionele activering van Tcf /LEF. Hoewel de onderliggende werkingsmechanisme nader onderzoek vereist, deze studie nieuwe inzicht in de wisselwerking tussen proteïnen en S100 CacyBP /SIP, die onze kennis S100 eiwitten kunnen verrijken en nuttig voor ons begrip van de ontwikkeling van maagkanker.

Citation: Ning X, Zon S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein negatief reguleert CacyBP /SIP-gemedieerde remming van Gastric Cancer Cell proliferatie en tumorigenese. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10.1371 /journal.pone.0030185

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italië

Ontvangen: 27 oktober 2011; Aanvaard: 15 december 2011; Gepubliceerd: 25 januari 2012

Copyright: © 2012 Ning et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Nature Science Foundation of China (nr 30872964, nr 30772461). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

S100 eiwitten zijn de grootste subgroep binnen de EF hand Ca ^{2 + bindende eiwit familie en worden gekenmerkt door hun cel- en weefsel-specifieke expressie patronen. Deze eiwitten zijn bekend intracellulaire processen reguleren de celcyclus overgang en celgroei, differentiatie en beweeglijkheid [1]. Een unieke eigenschap van deze eiwitten is dat individuele leden zijn gelokaliseerd in specifieke cellulaire compartimenten waarvan sommige kunnen verhuizen van Ca 2+ activering [2], [3]. Bij translocatie, kunnen deze eiwitten de Ca 2 + signaal in een tijd en ruimte wijze transduceren door interactie met verschillende S100 eiwit-specifieke doelen. Interessant is dat de meeste S100 genen in een gencluster menselijke chromosoom 1q21, een plaats van frequente chromosoomafwijkingen [4]. Deze vereniging suggereert een verband tussen chromosomale afwijkingen en de deregulering van de S100 genexpressie in verschillende tumoren. Tot op heden hebben veel leden van S100 familie geïdentificeerd geassocieerd met tumorgroei en metastase [5], [6]. Echter, de precieze rol en het belang van S100 eiwitten in de ontwikkeling en promotie van kanker slecht begrepen. Begrip van de biologische functie (s) van S100 eiwit is afhankelijk van de identificatie van S100 eiwit targets. Tot nu toe verschillende mogelijke eiwit doelwitten, waaronder glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase, annexine II, annexine VI, annexine XI, caldesmon en CacyBP /SIP, is aangetoond dat interactie met eiwitten S100 in vitro
in een Ca 2 + -afhankelijke wijze [5], [7].}

Calcyclin-bindend eiwit (CacyBP /SIP), een 30 kDa eiwit geïdentificeerd op basis van zijn vermogen tot interactie met S100A6 in een Ca ^{2 + -afhankelijke wijze Ehrlich ascites tumor (EAT) cellen [8], werd gedacht als een meervoudige-geneesmiddelresistentie (MDR) -gerelateerde moleculen bij maagkanker laboratoriumwaarden [9]. Door toepassing van een monoklonaal antilichaam tegen CacyBP /SIP [10], hebben we aangetoond dat overexpressie van CacyBP /SIP remt de proliferatie en tumorgenese van nierkanker cellen [11]. Nader onderzoek heeft gesuggereerd dat CacyBP /SIP onderdrukt de groei van maagkanker [12]. Ondanks deze vooruitgang, de effecten van de S100 eiwitten op CacyBP /SIP bij maagkanker blijven onduidelijk. Bovendien werd CacyBP /SIP ook gevonden op een onderdeel van een complex ubiquitinering via binding Siah1 en Skp1 [13]. En dit ligase werd beschreven om de afbraak van niet-gefosforyleerde β-catenine [13] te regelen.}

CacyBP /SIP kon S100, Siah1 en Skp1 binden door verschillende gebieden. De N-terminale regio (aa 1-80) van CacyBP /SIP is aangetoond affiniteit voor Siah1. Het C-terminale gebied van CacyBP /SIP (aa178-229) is bekend als een α-helix vormen; Dit domein kan interageren met S100 eiwitten, waaronder S100A6 [14]. Skp1 bindende domein niet overlappen met de S100 bindende regio en Skp1 bindt aan het middelste gedeelte (aa78-155) van CacyBP /SIP [15], [16]. Om de effecten van S100 eiwitten op het biologische gedrag van CacyBP /SIP bij maagkanker, eukaryote expressie vectoren voor wild-type CacyBP /SIP en de afgeknotte mutant zonder de S100 eiwitbindende domein (CacyBP /SIPΔS100) neemt met succes geconstrueerd en efficiënt uitgedrukt in MKN45 cellen. Een MTT assay FACS assay klonogene assay en tumor xenograft experimenten werden uitgevoerd om de effecten van CacyBP /SIP op celgroei evalueren en tumorigenese zowel in vitro Kopen en In vivo
. De resultaten van deze studies kunnen bijdragen tot de opheldering van de effecten van S100 eiwitten op het biologische gedrag van CacyBP /SIP bij maagkanker cellen.

Materialen en Werkwijzen

Cellijnen en dieren

de maagkanker cellijn MKN45, die werd gevonden aan de laagste uitdrukking van CacyBP /SIP in onze vorige studie [12], werd bewaard in ons laboratorium. De cellen werden in RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum, penicilline (100 U /ml) en streptomycine (100 ug /ml) in een CO _{2 incubator (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALB /c naakt muizen op 4-6 weken oud werden verstrekt door de Shanghai Cancer Institute voor de In vivo
tumorvorming studie. Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van de Vierde Militaire Medische Universiteit (Permit Nummer: 11016). Alle operatie werd uitgevoerd onder natriumpentobarbital verdoving, en alles in het werk werd gesteld om het lijden te minimaliseren.}

Immunofluorescentiekleuring

De cellen werden uitgeplaat op dekglaasjes gereinigd en met 95% alcohol vastgesteld voor 20 min bij kamertemperatuur temperatuur. De cellen op de dekglaasjes werden gewassen met PBS en permeablized gedurende 10 min met 0,5% Triton X-100 in PBS. De cellen werden geïncubeerd met anti-S100A6 antilichaam (verdund 1:2000) Na het blokkeren met 3% bovine serum albumine gedurende 1 uur. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met FITC-geconjugeerd anti-muis IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) en bevestigd op objectglaasjes met een mengsel van glycerol en polyvinylalcohol bevattende (1,4 diazobicylo- [2,2 DABCO , 2,] - octaan). Immunofluorescentie werd geanalyseerd met een MRC-1024 laser scanning confocale Imaging System (Bio-Rad).

Plasmid bouw en celtransfectie

Oligonucleotideprimers met de Eco
RI of Eco RV
restrictieplaats gesynthetiseerd, respectievelijk voor amplificatie van de sequentie van CDS CacyBP /SIP of een C-terminale deletie (aa178-229) mutant van CacyBP /SIP (toetreding AF_314752). De twee primers waren: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sense) en 5 'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3' (antisense); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sense) en 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (anti-sense), respectievelijk. De PCR-omstandigheden waren: 5 min bij 94 ° initiële denaturatie, gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 94 °, 45 seconden bij 60 ° en 60 sec bij 72 °, met een laatste verlenging van 10 min bij 72 °. De lengten van de PCR-producten werden 687 bp voor CDS, en 534 bp voor het C-terminale deletie. Elk PCR-product werd uitgesneden met EcoR
I en EcoR
V restrictie vertering en gekloond in evenzo verteerd pFLAG-CMV. De nieuwe vectoren werden genoemd pFLAG-CacyBP (wild-type) en pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). De insert sequenties werden bevestigd door DNA sequentiebepaling.

Celtransfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) zoals beschreven door de fabrikant. In het kort werden cellen uitgeplaat en gekweekt tot 70-90% confluentie zonder antibiotica. Zij werden vervolgens getransfecteerd met 1 ug pFLAG-CacyBP of pFLAG-ΔS100. Op 24 uur na transfectie werd G418 (350 mg /ml) werd toegevoegd aan het kweekmedium voor de selectie van getransfecteerde cellen. Gemengde klonen werden uitgebreid voor nog eens 6 weken. Cellen getransfecteerd met lege vector, pFLAG-CMV werd toegepast als een negatieve controle. Deze stabiele cellijnen werden genoemd MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 en MKN45-pFLAG voor het wildtype, afgeknotte en negatieve controle transfectanten, respectievelijk.

Co-immunoprecipitatie

De transfectanten werden MKN45 gewassen in PBS, geoogst en gelyseerd op ijs in een buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgClz _{2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, en 1% Nonidet P-40. De extracten werden gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 25 min bij 37 ° C in een microcentrifuge. De supernatanten werden gebruikt voor immunoprecipitatie analyse na de toevoeging van proteaseremmers (10 mg /L leupeptine, 5 mg /l aprotinine, 20 mg /l sojaboontrypsineremmer, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride) en gekwantificeerd door de Bradford methode. De supernatanten werden geïncubeerd met 30 pl proteïne A /G-Sepharose en 1 ug verbonden antilichaam gedurende 1-3 uur bij 37 ° (pre-klaring). De niet-gebonden fracties werden vervolgens geïncubeerd met serum bevattende antilichamen tegen CacyBP /SIP gedurende 1,5 uur bij 4 °. Het mengsel werd vervolgens geïncubeerd met extra proteïne A /G-Sepharose nacht bij 4 °. De hars werd vervolgens driemaal gewassen in een buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 150 mM NaCl, tweemaal in een buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 500 mM NaCI en tenslotte in 20 mM Tris -HCl bij pH 7,5. Alle buffers die werden gebruikt werden aangevuld met proteaseremmers. De hars en gebonden eiwitten werden opgelost in een SDS monsterbuffer gekookt gedurende 5 minuten bij 98 °, en aangebracht op een SDS polyacrylamidegel. De expressie van S100A6 werd geanalyseerd door Western blotting met antilichaam tegen S100A6.}

Western blot

De cellen werden verzameld en op ijs gelyseerd in een buffer die [50 mmol /L Tris-Cl (pH 7,5), 150 mmol /L NaCl, 0,2 mmol /L EDTA, 1 mmol /L PMSF en 1% NP 40], en vervolgens gekwantificeerd door de Bradford methode. Een maatregel van 100 ug lysaten werd geëlektroforeerd in 10% SDS-PAGE en geblot op een nitrocellulose membraan. De membranen werden geblokkeerd met 10% vetvrije melk bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en geïncubeerd met anti-CacyBP (1:1500) en anti-β-actine antilichaam (Sigma, 1:5000) bij 4 ° een nacht. Na drie wassingen gedurende 15 min elk in TBS dat was aangevuld met 0,1% Tween 20 (TBST) werd het membraan geïncubeerd met peroxidase-geconjugeerd geiten anti-muis /konijn-IgG-antilichaam (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, China) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur temperatuur. Versterkte chemiluminescentie (Amersham, Freiburg, Duitsland) werd gebruikt voor detectie.

methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) test

De cellen werden gezaaid op een 96-putjes plaat bij 2,5 x 10 ^{3 cellen /putje in RPMI 1640 medium dat 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum. Elk monster had drie herhalingen. Het medium werd vervangen 2 dagen, gedurende 6 dagen. De cellen werden geïncubeerd met 50 gl 0,2% MTT gedurende 4 uur bij 37 ° C in een 5% CO _{2 atmosfeer. Na MTT incubatie werd een 150 pi hoeveelheid van 100% DMSO aan elke kweek toegevoegd om de kristallen op te lossen. Levensvatbare cellen werden elke dag geteld door het lezen van de absorptie bij 490 nm met behulp van een 96-plate reader, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).}}

Cell cycle analysis

Subconfluente cellen werden gewassen met ijskoude PBS, gesuspendeerd in 0,5 ml ethanol en vervolgens gedurende 30 min bewaard bij 4 ° C. De suspensie werd gefiltreerd door een 50 pm nylon gaas en de DNA-inhoud van gekleurde kernen werd geanalyseerd met een stroomcytometer (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). De celcyclus profiel werd geanalyseerd met Multicycle-DNA celcyclus Geanalyseerd Software. De proliferatieve indices (PI) werden als volgt berekend:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

Klonale assay

Om te voorkomen dat tarief van een enkele cel te meten in vitro
, plaat klonogene en zachte agar klonogene testen werden uitgevoerd [17]. Voor de plaat klonogene test werden 1 x 10 ^{3 cellen gezaaid in een 9-cm schaal en gekweekt in RPMI 1640 medium gedurende twee weken om voor kolonievorming. De kolonies werden gefixeerd in 70% ethanol, gekleurd met Giemsa oplossing en geteld. Voor de zachte agar klonogene assay werden de cellen losgemaakt en uitgeplaat in 0,3% agarose met een 0,5% agarose onderlaag (1 x 10 3 /putje in een 24-wells plaat). Het aantal foei > 100 urn werd geteld na 20 dagen}

tumorgroei in naakt muizen

Logaritmisch groeiende cellen (1 x 10 ^{7-cellen) werden getrypsiniseerd, opnieuw gesuspendeerd in 0,1. D'ml Hanks oplossing en geïnjecteerd in de hals hypodermia van elke athymische naakt muis. De muizen werden vervolgens gecontroleerd op tumorvolume, algemene gezondheid, en het totale lichaamsgewicht. De grootte van de subcutane tumormassa werd gemeten met caliper gedurende vijf weken. Het tumorvolume werd berekend volgens de formule: 0,5 x lengte x breedte 2. Elke experimentele groep bestond uit vijf muizen.}

reportergentest

Om het effect van CacyBP /SIP en CacyBP /SIPΔS100 de transcriptionele activiteit van Tcf /LEF testen, het reportergen assay werd uitgevoerd zoals beschreven [18]. In het kort cellen in een 24-well plaat (50.000 cellen per putje) werden gecotransfecteerd met of zonder pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 en het reporterplasmide, pTOPFLASH gemaakt met wildtype Tcf /LEF bindingsplaatsen gebruikt Lipofectamine 2000; pRL-TK Renilla
luciferase reporter diende als controle voor transfectie-efficiëntie. De luciferaseactiviteit werd gemeten en gekwantificeerd in een luminometer met het Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Southampton, U.K.). Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en tweemaal herhaald. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde van de verhouding tussen de vuurvlieg luciferase activiteit en het Renilla luciferaseactiviteit.

Statistische analyse

Alle gegevens werden geanalyseerd met SPSS statistisch pakket (SPSS, Inc., Chicago, Illinois), en P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. De significantie van het verschil in frequentie van CacyBP /SIP-positieve kleuring tussen aangrenzende tumormonsters en tumoren werden geanalyseerd door het chikwadraattoets. Student's t Electronics Test en one-way analyse van de variantie gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijking tests werden gebruikt voor de analyse van andere gegevens.

Resultaten

Endogene expressie van S100A6 bij maagkanker cellijn MKN45

S100A6 werd gekozen als een model om het effect van S100 eiwitten mbt de biologische functie van CacyBP /SIP. De endogene expressie van S100A6 bij maagkanker cellijn MKN45 werd voor het eerst gedetecteerd door western blot en immunofluorescentie kleuring. Zoals getoond in Fig. 1A, S100A6 werd uitgedrukt in MKN45 cellen. Immunofluorescentiekleuring geeft aan dat S100A6 vooral werd verspreid in de nucleaire membraan met zeer weinig gevonden in de nucleaire plasma van de MKN45 cellen (Fig. 1B).

Interactie van S100A6 en CacyBP /SIP bij maagkanker cellen MKN45

in een vorig rapport CacyBP /SIP, die op een relatief laag niveau tot expressie werd gebracht in MKN45 cellen werd algemeen voor in verschillende soorten maagkanker cellijnen [12]. Om de interactie tussen S100A6 en CacyBP /SIP, wild-type en mutant (aa178-229) CacyBP /SIP cDNAs evalueren werden gekloneerd in de pFLAG-CMV vector en stabiel getransfecteerd in cellen MKN45. Wij hebben de uitdrukking van CacyBP /SIP in deze stabiele cellijnen door western blot. Zoals getoond in Fig. 2A, FLAG-tag CacyBP /SIP werd gedetecteerd in de wild-type en mutant CacyBP /SIP transfectanten met anti-Flag-antilichaam, terwijl er geen signaal werd gevonden in cellen getransfecteerd met lege vector.

De interactie tussen S100A6 en CacyBP /SIP in transfectant MKN45 cellen werd vervolgens geëvalueerd door co-immunoprecipitatie. Na incubatie met anti-CacyBP antilichaam werden immunologisch gedetecteerd door S100A6 antilichaam. Zoals getoond in Fig. 2B, een interactie tussen S100A6 en wild-type CacyBP /SIP werd waargenomen in MKN45-CacyBP cellysaten; echter mutant CacyBP /SIP die werd ingekort van de aa178-229 regio geproduceerd weinig signaal in de co-immunoprecipitatie-assay. Daarom werd de afgeknotte mutant CacyBP /SIP genoemd CacyBP /SIPΔS100 en biedt een nuttig instrument voor onderzoek naar de effecten van S100A6 op de biologische gedrag van CacyBP /SIP bij maagkanker cellen.

Effecten van S100A6 op celproliferatie geïnduceerd door CacyBP /SIP in maagkanker cellijn MKN45 in vitro

MTT en FACS testen werden uitgevoerd om de effecten van S100A6 op celproliferatie geïnduceerd door CacyBP /SIP in cellen te onderzoeken MKN45 in vitro
. In vergelijking met de lege vector transfectanten, MKN45-pFLAG, zowel wild-type en CacyBP /SIPΔS100 transfectanten vertoonden significant verminderde snelheden van celproliferatie door de MTT assay ( P
< 0,05) (fig. 3A). Echter, CacyBP /SIPΔS100 transfectanten vertoonden een significant verminderde groei in vergelijking met wild-type CacyBP /SIP transfectanten ( P Restaurant < 0,05).

De resultaten van de celcyclus analyse met FACS evenzo geven aan dat overexpressie van of wild of mutant CacyBP /SIP vermindert MKN45 proliferatie. De gemiddelde proliferatieve index (PI) van MKN45-ΔS100 cellen (0,19 ± 0,03) lager was dan die van MKN45-CacyBP cellen (0,29 ± 0,02) ( P
< 0,05) (fig. 3B) . Samen vormen deze gegevens een sterke aanwijzing dat de wild-type CacyBP /SIP remt de proliferatie van MKN45 cellen, terwijl CacyBP /SIPΔS100 versterkt deze remming van de proliferatie.

Effecten van S100A6 op het ontstaan ​​van tumoren geïnduceerd door CacyBP /SIP in de MKN45 maagkanker cellijn in vitro Kopen en in vivo

Anchorage-onafhankelijke groei is een belangrijk kenmerk van de in vitro
tumorgroei. Daarom hebben we onderzocht of opregulatie van CacyBP /SIP-expressie geremd MKN45 celgroei in de media en zachte agar. Zoals getoond in Fig. 4A en B, CacyBP /SIP expressie resulteerde in een duidelijke vermindering van MKN45 celgroei in een kolonievorming assay, met een gemiddelde daling van 32,1% in middelgrote en 62,0% in zachte agar ( P
< 0,05) . Echter, transfectie van CacyBP /SIPΔS100 resulteerde in een nog grotere afname van de groei, met een gemiddelde daling van de tarieven van 84,2% in middelgrote en 82,8% in zachte agar ( P Restaurant < 0,01).

om dit effect te bevestigen in vivo
, we subcutaan MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 en MKN45-pFLAG cellen in de nek hypodermia van naakt muizen. Na drie weken was de gemiddelde tumorvolume in elke groep was significant verschillend van die van de anderen. Voor deze 5 ^{e week, het gemiddelde tumorvolume in de MKN45-pFLAG groep 776,9 ± 90,9 mm 3, beduidend meer dan de MKN45-CacyBP groep (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P
< 0,05), en zelfs meer dan dat van de MKN45-ΔS100 groep (364,9 ± 71,9 mm 3) ( P
< 0,05) (Fig. 4C).}

Effecten van S100A6 op CayBP /SIP-gemedieerde β-catenine afbraak

Als onderdeel van ubiquitine ligase complex CacyBP /SIP is betrokken bij de afbraak van gefosforyleerde β catenine via bindend Skp1 en Siah1. Zodat expressie van β-catenine werd gedetecteerd om de invloed van S100 op Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase indirect evalueren. Ten eerste co-immunoprecipitatie assay toonde dat ingekorte mutant CacyBP /SIP binden zowel Skp1 en Siah1 (fig. 5A), wat suggereert S100A6 beïnvloedde de vorming van Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase complex. Ten tweede wordt β- catenine eiwit in MKN45-ΔS100 cellen significant gedaald in vergelijking met MKN45-CacyBP cellen, terwijl geen verandering opgetreden in het mRNA (Fig. 5B). Bovendien, omdat β-catenine nodig als cofactor voor de activering van de transcriptiefactor, Tcf /LEF, hebben we de effecten van CayBP /SIPΔS100 op Tcf /LEF transactie met transiënte transfectie reportergenassays. Expressie van CacyBP /SIPΔS100 resulteerde in lagere Tcf /LEF activiteit dan wild-type CacyBP /SIP (Fig. 5C). MG132, remmer van proteasoom, zou het effect van zowel wild-type CacyBP /SIP en CacyBP /SIPΔS100 op Tcf /LEF-activiteit te elimineren. Bij elkaar genomen, afgeleid we dat S100A6 van invloed kunnen zijn CayBP /SIP-gemedieerde β-catenine degradatie via interactie met CayBP /SIP.

Discussie

S100 familie eiwitten hebben opgedaan belangstelling vanwege hun differentiële expressie in tumor weefsels en hun betrokkenheid bij kanker en metastase [19] - [22]. S100 eiwitten interageren met sommige doeleiwitten calcium-afhankelijke of calcium-onafhankelijke wijze en verder reguleren van de functie van deze doelstellingen [5], [23]. CacyBP /SIP is een nieuw doeleiwit dat kan interageren met S100 eiwitten, waaronder S100A6, S100A1, S100B en S100P, maar niet S100A4, Calbindin D, parvalbumin of calmoduline [8], [16]. Eerdere werken in ons laboratorium toonden aan dat overexpressie van CacyBP /SIP de proliferatie en tumorigenese van maagkanker en niercelcarcinoom [11], [12] kan remmen. Ondanks deze vooruitgang, de effecten van de S100 eiwitten op CacyBP /SIP nog worden onderzocht.

Om de regulering van de S100 eiwitten op CacyBP /SIP-functie toe te lichten, gebouwd we de afgeknotte CacyBP /SIP-mutant zonder S100 eiwit bindend domein zodat mutante eiwit kon geen wisselwerking S100 eiwitten en behoudt vermogen tot interactie met Siah1 en Skp1. In deze studie werden eukaryote expressie vectoren voor wild-type CacyBP /SIP en de ingekorte mutant doeltreffend uitgedrukt in MKN45 cellen. Co-immunoprecipitatie toonde een interactie tussen S100A6 en wild-type CacyBP /SIP in MKN45 cellen. Echter, toonde CacyBP /SIPΔS100 weinig signaal door de co-immunoprecipitatie assay, wat wijst op een zwakke of geen interactie met S100A6. MTT assay, FACS assay klonogene assay en tumor xenograft experiment in naakt muizen werden uitgevoerd om het effect van wilde en mutante CacyBP /SIP op celgroei testen en tumorigenese zowel in vitro Kopen en in vitro
. Deze experimenten toonden aan dat overexpressie van CacyBP /SIP de proliferatie en tumorigenese van MKN45 maagkanker cellen kunnen remmen. Belangrijker cellen die met CacyBP /SIPΔS100 vertoonden meer intense effecten ten opzichte van wildtype transfectanten, wat suggereert dat eiwitten S100 negatief kan reguleren de remming van celproliferatie geïnduceerd door CacyBP /SIP bij maagkanker cellen.

Het mechanisme werkzaam door S100A6 moduleren CacyBP /SIP-functie zou kunnen liggen in eiwit interacties en functies. CacyBP /SIP wordt geïdentificeerd die betrokken zijn bij ubiquitinering en degradatie van β-catenine [24] - [28]. β- catenine werd gevonden dat overexpressie of geactiveerd prolifererende cellen en in veel tumoren [29] - [31]. Fukushima et al. [32] vonden dat CacyBP /SIP knockout cellen vertonen verminderde (P-catenine degradatie en een defecte G1 celcyclus, wat aangeeft dat de β-catenine afbraakroute gemedieerd door CacyBP /SIP definieert een essentieel ijkpunt voor thymocyten ontwikkeling en voortgang van de celcyclus. Onze eerdere studies toonden ook dat CacyBP /SIP remt groei en proliferatie van maag kankercellen deels via degradatie van β-catenine. of S100 regelt CacyBP /SIP-gemedieerde ubiquitine ligase blijft onbekend. Accumulerende bewijzen gebleken dat verschillende leden van de eiwitfamilie S100 kan regelen de activering van hun doeleiwitten [33], [34]. Een recent ontdekte gist homoloog van CacyBP /SIP, SGT1, niet alleen op plaatsen met S100 eiwitten calcium gereguleerde wijze, maar ook associeert met Skp1 tot Skp1 /cullin1 /F vormen -.. box ubiquitine ligase complex [35] Er is gevonden dat S100A6 de fosforylering van SGT1 kunnen remmen door caseïne kinase II om de activiteit beïnvloeden [36] In het onderhavige experiment hebben we vastgesteld dat CacyBP /SIPΔS100 behouden vermogen te associëren met Skp1 en Siah1, wat suggereert S100 molecule misschien geen invloed op de vorming van Siah1 /Skp1 /CacyBP ubiquitine ligase complex. Niettemin, β-catenine eiwit zonder een verandering van het mRNA-niveau in CacyBP /SIPΔS100 getransfecteerde cellen aanmerkelijk lager dan wild-type transfectant cellen. De transcriptie-activiteit van Tcf /LEF, een doelgen van β-catenine, werd afgenomen in combinatie met mutant CacyBP /SIP zonder S100 binding, in vergelijking met wild CacyBP /SIP. Accoding deze resultaten postuleren we dat S100 negatief eiwit de activiteit van Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitine ligase kan reguleren door interactie met CacyBP /SIP. Dus het blokkeren van de combinatie van S100 en CacyBP /SIP kan β-catenine afbraak bevorderen, leiden tot het remmen van de proliferatie van kankercellen. Deze speculatie kan gedeeltelijk worden ondersteund door Lee et al dat in cellen met verminderde hoogte van S100A6 de hoeveelheid β-catenine wordt verlaagd [26]. De resultaten zijn in overeenstemming met gegevens betreffende de up-regulatie van S100 eiwitten en gebrekkige degradatie van β-catenine in tumorcellen en prolifererende cellen [37]. Bovendien werd CacyBP /SIP getoond interactie met tubuline en ERK1 /2 en spelen een belangrijke rol bij herrangschikkingen van het cytoskelet, celdifferentiatie of degeneratie [38] -. [42]

Conclusies

S100A6 eiwit regelt negatief CacyBP /SIP-gemedieerde remming van de maag proliferatie van kankercellen, mede door invloed op de β-catenine degradatie en transcriptionele activering van Tcf /LEF. Echter, de onderliggende mechanismen voor de regulering van S100A6 op proteïne ubiquitinatie en andere functies via CacyBP /SIP-afhankelijke route vergen nader onderzoek.

• PLoS ONE: Activeren Transcription Factor 4 Verleent een multidrug resistance fenotype aan maagkanker cellen door transactivatie van SIRT1 Expression
• PLoS ONE: polymorfismen en een haplotype in Heparanase Gene Associaties met de progressie en prognose van maagkanker in een Noord-Chinese bevolking