PLOS ONE: Protein S100A6 Négativement CacyBP Régule /SIP-Mediated Inhibition du cancer gastrique prolifération cellulaire et Tumorigenesis

Résumé

Calcyclin-binding protein (CacyBP /SIP), identifiés sur la base de sa capacité à interagir avec protéines S100, d'une manière dépendante du calcium, a été précédemment trouvée pour inhiber la prolifération et la tumorigenèse des cellules cancéreuses gastriques dans notre laboratoire. Fait important, les effets des protéines S100 sur le comportement biologique de CacyBP /SIP dans le cancer gastrique restent floues. Ici, nous rapportons la construction de vecteurs d'expression eucaryotes pour type sauvage CacyBP /SIP et un mutant tronqué dépourvu du domaine de liaison de la protéine S100 (CacyBP /SIPΔS100). Les expressions du type sauvage et des protéines recombinantes tronquées ont été démontrées par transfection de cellules cancéreuses gastriques MKN45. dosages Co-immunoprécipitation ont montré l'interaction entre les S100A6 et de type sauvage CacyBP /SIP dans MKN45 cellules. L'élimination du domaine de liaison à la protéine S100 a considérablement réduit l'affinité de CacyBP /SIP pour les protéines S100, comme indiqué par la réduction de la co-immunoprécipitation de S100A6 par CacyBP /SIPΔS100. L'expérience test MTT, dosage FACS, essai clonogénique et xénogreffe de tumeur ont été réalisées pour évaluer l'effet de CacyBP /SIP sur la croissance cellulaire et la tumorigenèse in vitro
et in vivo
. La surexpression de CacyBP /SIP a inhibé la prolifération et la tumorigenèse des cellules de cancer de l'estomac MKN45; les taux de prolifération et de la tumorigenèse ont été encore réduits par l'expression de CacyBP /SIPΔS100. Nous avons également montré que les protéines S100 régulent négativement l'inhibition CacyBP /SIP à médiation gastrique prolifération des cellules cancéreuses, par un effet sur la β-caténine expression de la protéine et l'activation transcriptionnelle de TCF /LEF. Bien que le mécanisme sous-jacent de l'action nécessite une enquête plus approfondie, cette étude fournit de nouvelles informations sur l'interaction entre les protéines S100 et CacyBP /SIP, ce qui pourrait enrichir notre connaissance des protéines S100 et être utiles pour notre compréhension du développement du cancer gastrique.

Citation: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein Négativement CacyBP Régule /SIP-Mediated Inhibition du cancer gastrique prolifération cellulaire et la tumorigenèse. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10.1371 /journal.pone.0030185

Editeur: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italie

Reçu le 27 Octobre 2011; Accepté 15 Décembre 2011; Publié le 25 Janvier, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Ning et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenue par des subventions de national Nature science Foundation de Chine (n ° 30872964, n ° 30772461). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction protéines

S100 sont le plus grand sous-groupe au sein de l'EF-hand Ca ^{2 + liant le famille de protéines et sont caractérisés par leur cellules et des profils d'expression spécifiques des tissus. Ces protéines sont connues pour réguler les processus intracellulaires tels que la transition du cycle cellulaire et la croissance cellulaire, la différenciation et la motilité [1]. Une caractéristique unique de ces protéines est que les membres individuels sont localisés dans des compartiments cellulaires spécifiques dont certains sont en mesure de déménager sur Ca 2 + activation [2], [3]. Après translocation, ces protéines peuvent transduction du signal de 2+ Ca d'une manière temporelle et spatiale en interagissant avec des cibles différentes spécifiques de la protéine S100. Fait intéressant, la plupart des gènes S100 sont situés dans un groupe de gènes sur le chromosome humain 1q21, un site d'anomalies chromosomiques fréquemment [4]. Cette association suggère un lien entre les anomalies chromosomiques et la dérégulation de l'expression du gène S100 dans différentes tumeurs. Jusqu'à ce jour, de nombreux membres de la famille S100 ont été identifiés pour être associés au développement de la tumeur et les métastases [5], [6]. Cependant, les rôles précis et l'importance des protéines S100 dans le développement et la promotion du cancer sont mal comprises. La compréhension de la fonction biologique (s) de protéines S100 dépendra de l'identification des cibles protéiques S100. Jusqu'à présent, plusieurs protéines cibles possibles, y compris la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, l'annexine II, annexine VI annexine XI, et caldesmone CacyBP /SIP, se sont révélés interagir avec les protéines S100 in vitro dans un
Ca 2 + manière dépendante [5], [7].}

Calcyclin-binding protein (CacyBP /SIP), une protéine de 30 kDa identifiée sur la base de sa capacité à interagir avec S100A6 dans un Ca ^{2 + manière dépendante dans Ehrlich ascites tumeur (EAT) cellules [8], a déjà été pensé comme une résistance à plusieurs médicaments (MDR) molécule la PI dans le cancer gastrique dans notre laboratoire [9]. Grâce à l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre CacyBP /SIP [10], nous avons montré que la surexpression de CacyBP /SIP inhibe la prolifération et la tumorigenèse des cellules cancéreuses rénales [11]. D'autres études ont suggéré que CacyBP /SIP supprime la croissance du cancer gastrique [12]. Malgré ces progrès, les effets des protéines S100 sur CacyBP /SIP dans le cancer gastrique restent floues. En outre, CacyBP /SIP a également été trouvé pour être un composant d'un complexe de liaison par l'intermédiaire d'une ubiquitination et SIAH1 Skp1 [13]. Et ce ligase a été décrit pour réguler la dégradation des β-caténine non phosphorylée [13].}

CacyBP /SIP pourrait lier S100, SIAH1 et Skp1 par différentes régions. La région N-terminale (aa 1-80) de CacyBP /SIP a été démontré que l'affinité pour SIAH1. La région C-terminale de CacyBP /SIP (aa178-229) est connu pour former une hélice α-; ce domaine peut interagir avec des protéines S100, y compris S100A6 [14]. domaine de liaison Skp1 ne chevauche pas avec la région de liaison S100 et Skp1 se lie à la partie médiane (aa78-155) de CacyBP /SIP [15], [16]. Pour observer les effets des protéines S100 sur le comportement biologique de CacyBP /SIP dans le cancer gastrique, des vecteurs d'expression eucaryotes pour type sauvage CacyBP /SIP et son mutant tronqué dépourvu du domaine de liaison de la protéine S100 (CacyBP /SIPΔS100) ont été construits avec succès et efficacement exprimé dans les cellules MKN45. Un test MTT, le dosage FACS, essai clonogénique et xénogreffe de tumeur expérience ont été réalisées pour évaluer les effets de CacyBP /SIP sur la croissance cellulaire et la tumorigenèse fois in vitro
et in vivo
. Les résultats de ces études peuvent contribuer à l'élucidation des effets des protéines S100 sur le comportement biologique de CacyBP /SIP dans les cellules de cancer gastrique.

Matériel et méthodes

Les lignées cellulaires et animaux

la lignée cellulaire de cancer gastrique MKN45, qui a été trouvé pour être l'expression la plus basse de CacyBP /SIP dans notre précédente étude [12], a été préservée dans notre laboratoire. Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) additionné de 10% de sérum inactivé à la chaleur veau fœtal, de la pénicilline (100 U /ml) et de la streptomycine (100 pg /ml) dans un CO _{2 incubateur (Forma Scientique, Marjetta, OH, USA). BALB /c souris nude à 4-6 semaines d'âge ont été fournies par l'Institut du cancer de Shanghai pour la in vivo
étude de la tumorigenèse. Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l'éthique de l'expérimentation animale de la quatrième université médicale militaire (Numéro de permis: 11016). Toute chirurgie a été réalisée sous anesthésie pentobarbital de sodium, et tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances.}

Immunofluorescence

Les cellules ont été étalées sur des lamelles nettoyées et fixées avec 95% d'alcool pendant 20 min à la chambre température. Les cellules sur les lamelles couvre-objet ont été lavées avec du PBS et permeablized pendant 10 min avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS. Les cellules ont été incubées avec un anticorps anti-S100A6 (dilué 1:2000) après blocage avec 3% de sérumalbumine bovine pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été incubées avec du FITC conjugué IgG anti-souris (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) et montées sur des lames de verre avec un mélange de glycérol et d'alcool polyvinylique contenant de DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2] - octane). Immunofluorescence a été analysé avec une MRC-1024 confocal à balayage laser Imaging System (Bio-Rad).

Construction de plasmide et la transfection de cellules

Les amorces oligonucléotidiques contenant le Eco RI
ou Eco RV
site de restriction ont été synthétisés, respectivement, pour l'amplification de la séquence d'CacyBP /SIP ou une suppression (aa178-229) mutant C-terminale de CacyBP /SIP CDS (adhésion AF_314752). Les deux amorces sont: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sens) et 5 'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3' (anti-sens); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sens) et 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (anti-sens), respectivement. Les conditions de PCR étaient: 5 min à 94 ° pour la dénaturation initiale, suivie par 35 cycles de 45 sec à 94 °, 45 sec à 60 °, et 60 secondes à 72 °, avec une extension finale de 10 min à 72 °. Les longueurs des produits de PCR étaient 687 pb pour la CDS, et 534 pb pour C-terminal suppression. Chaque produit de PCR a été excisée avec EcoR
I et EcoR
restriction V digestion et clone dans également digéré pFLAG-CMV. Les nouveaux vecteurs ont été nommés pFLAG-CacyBP (type sauvage) et pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Les séquences d'insertion ont été confirmées par séquençage d'ADN.

Cellule de transfection a été effectuée avec de la lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) comme décrit par le fabricant. En bref, les cellules ont été étalées et cultivées jusqu'à une confluence de 70 à 90% sans antibiotiques. Ils ont ensuite été transfectées avec 1 pg pFLAG-CacyBP ou pFLAG-ΔS100. A 24 h après la transfection, G418 (350 mg /ml) a été ajouté au milieu de culture pour la sélection des cellules transfectées. clones mixtes ont été développés pour une période supplémentaire de 6 semaines. Les cellules transfectées avec le vecteur vide, pFLAG-CMV, ont été utilisés comme témoin négatif. Ces lignées cellulaires stables ont été nommés MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 et MKN45-pFLAG pour le type sauvage, transfectants de contrôle tronqués et négatifs, respectivement.

Co-immunoprécipitation

Les transfectants MKN45 étaient lavés dans du PBS, récoltées et lysées sur de la glace dans un tampon contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM de MgCl _{2, 150 mM de NaCl, 0,2 mM d'EGTA et 1% de Nonidet P-40. Les extraits ont été centrifugés à 12 000 tpm pendant 25 min à 37 ° C dans une microcentrifugeuse. Les surnageants ont été utilisés pour un essai d'immunoprécipitation après l'addition d'inhibiteurs de la protéase (10 mg /l leupeptine, 5 mg /L d'aprotinine, 20 mg /L de l'inhibiteur de trypsine du soja, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM) et quantifiés par la méthode de Bradford. Les surnageants ont été mises en incubation avec 30 ul de protéine A /G-Sépharose et un anticorps sans rapport avec 1 pg à 3/1 h à 37 ° (précontrôle). Les fractions non liées ont ensuite été incubées avec du sérum contenant des anticorps contre CacyBP /SIP pendant 1,5 h à 4 °. Le mélange a été ensuite mis en incubation avec des protéines supplémentaires A /G-Sépharose pendant une nuit à 4 °. La résine a été ensuite lavée trois fois dans un tampon contenant 20 mM de HCl Tris (pH 7,5) et 150 mM de NaCl, deux fois dans un tampon contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 500 mM de NaCl, et finalement dans du Tris 20 mM, -HCl à pH 7,5. Tous les tampons qui ont été utilisés ont été complétés par des inhibiteurs de la protéase. Les protéines de résine et liée ont été solubilisées dans un tampon d'échantillon de SDS, bouillis pendant 5 min à 98 ° C, puis appliqués à un gel de polyacrylamide-SDS. L'expression de S100A6 a été analysé par western blot avec un anticorps dirigé contre S100A6.}

Western blot

Les cellules ont été recueillies et lysées sur la glace dans un tampon contenant [50 mmol /L de Tris-Cl (pH 7,5), 150 mmol /l de NaCl, 0,2 mmol /l d'EDTA, 1 mmol /l de PMSF et 1% de NP 40], puis quantifié par la méthode de Bradford. Une mesure de 100 ug de lysats a été soumis à une électrophorèse à 10% de SDS-PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées avec du lait sans matières grasses 10% à la température ambiante pendant 2 h et on fait incuber avec un anticorps anti-CacyBP (1:1500) et anti-β-actine anticorps (Sigma, 1:5000) à 4 ° pendant une nuit. Après trois lavages de 15 min chacune dans TBS supplémenté avec 0,1% de Tween 20 (TBST), la membrane a été incubée avec /anticorps IgG de lapin de chèvre conjugué à la peroxydase anti-souris (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, Chine) pendant 2 h à la salle température. chimioluminescence amélioré (Amersham, Freiburg, Allemagne) a été utilisé pour la détection.

méthyle thiazolyle tétrazolium (MTT)

Les cellules ont été ensemencées sur une plaque à 96 puits à 2,5 x 10 ^{3 cellules /puits dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum foetal de veau inactivé par la chaleur. Chaque échantillon avait trois répétitions. Le milieu a été remplacé à des intervalles de 2 jours, pendant 6 jours. Les cellules ont été mises en incubation avec 50 ul de 0,2% de MTT pendant 4 h à 37 ° C dans CO à 5% _{2 atmosphérique. À la suite de l'incubation du MTT, une aliquote de 150 pl de DMSO à 100% ont été ajoutés à chaque culture pour dissoudre les cristaux. Les cellules viables ont été comptées chaque jour en lisant l'absorbance à 490 nm en utilisant un lecteur de 96 plaque, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).}}

Cycle cellulaire analyse

subconfluentes cellules ont été lavées avec PBS glacé, mis en suspension dans 0,5 ml d'éthanol et ensuite maintenu à 4 ° C pendant 30 min. La suspension a été filtrée à travers une maille de nylon de 50 pm, et la teneur en ADN des noyaux colorés ont été analysées avec un cytomètre de flux (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Le profil du cycle cellulaire a été analysé à l'aide du cycle cellulaire multicycles ADN du logiciel d'analyse. Les indices prolifératives (PI) ont été calculés comme suit:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

clonogénique test

Pour mesurer le taux d'une seule cellule de prolifération in vitro
, clonogénique de la plaque et des essais clonogéniques agar mou ont été réalisées [17]. Pour le dosage clonogénique de la plaque, 1 x 10 ^{3 cellules ont été ensemencées dans une boîte de 9 cm et cultivées dans un milieu RPMI 1640 pendant deux semaines pour permettre la formation de colonies. Les colonies ont été fixées dans 70% d'éthanol, colorées avec une solution Giemsa et comptées. Pour le dosage clonogénique de la gélose molle, les cellules ont été détachées et étalées dans 0,3% d'agarose avec une sous-couche d'agarose à 0,5% (1 x 10 3 /puits dans une plaque à 24 puits). Le nombre de foyers > 100 um a été compté au bout de 20 jours}

La croissance tumorale dans

Les cellules en croissance logarithmique des souris nude (1 x 10 ^{7 cellules) ont été trypsinées, remises en suspension dans 0,1. d'ml de solution de Hanks, et injecté dans le hypodermia du col de chaque souris nude athymiques. Les souris ont ensuite été surveillées pour le volume de la tumeur, la santé générale et du poids corporel total. La taille de la masse tumorale sous-cutanée a été mesurée par calibre pendant cinq semaines. Le volume tumoral a été calculé selon la formule: 0,5 x longueur x largeur 2. Chaque groupe expérimental était composé de cinq souris.}

Reporter essai de gène

Pour analyser l'effet de CacyBP /SIP et CacyBP /SIPΔS100 sur l'activité transcriptionnelle de Tcf /LEF, le dosage du gène rapporteur a été réalisée comme décrit [18]. En bref, les cellules dans une plaque de 24 puits (50.000 cellules par puits) ont été co-transfectées avec ou sans pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 et le plasmide rapporteur, pTOPFLASH, contenant des sites Tcf /Lef de liaison de type sauvage en utilisant Lipofectamine 2000; pRL- TK luciférase journaliste de Renilla a servi de contrôle pour l'efficacité de la transfection. L'activité luciférase a été mesurée et quantifiée dans un luminomètre en utilisant le Dual-Luciferase Reporter Assay Système (Promega, Southampton, Royaume-Uni). Des expériences ont été réalisées en triple et répétées deux fois. Les résultats sont exprimés par la moyenne du rapport entre l'activité de luciférase de luciole et de l'activité de la luciférase Renilla.

Analyse statistique

Toutes les données ont été analysées en utilisant le progiciel statistique SPSS (SPSS, Inc., Chicago, Illinois), et P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. La signification de la différence de fréquence des CacyBP /SIP positif coloration entre les échantillons et les tumeurs cancéreuses adjacentes ont été analysées par le test du chi-carré. Étudiant de t
tests et une analyse de variance suivie par de multiples tests de comparaison de Dunnett ont été employées pour l'analyse des autres données.

expression endogène de

Résultats de S100A6 dans le cancer gastrique lignée cellulaire MKN45

S100A6 a été choisi comme modèle pour observer l'effet des protéines S100 sur la fonction biologique de CacyBP /SIP. L'expression endogène de la S100A6 dans la lignée cellulaire de cancer de l'estomac MKN45 a d'abord été détectée par western blot et immunofluorescence. Comme on le voit sur la Fig. 1A, S100A6 a été exprimée dans les cellules MKN45. Immunofluorescence indique que S100A6 est distribué principalement dans la membrane nucléaire avec très peu trouvée dans le plasma nucléaire des cellules MKN45 (Fig. 1B).

Interaction des S100A6 et CacyBP /SIP dans des cellules de cancer de l'estomac MKN45

dans un précédent rapport, CacyBP /SIP, qui a été exprimé à un niveau relativement bas en MKN45 cellules, a été largement exprimé dans plusieurs différents types de lignées cellulaires de cancer gastrique [12]. Afin d'évaluer l'interaction entre S100A6 et CacyBP /SIP, de type sauvage et mutant (aa178-229) CacyBP /SIP ADNc ont été clones dans le vecteur pFLAG-CMV et transfectées de façon stable dans les cellules MKN45. Nous avons évalué l'expression de CacyBP /SIP dans ces lignées cellulaires stables par western blot. Comme on le voit sur la Fig. 2A, étiquetée FLAG CacyBP /SIP a été détecté dans le type sauvage et mutants transfectants CacyBP /SIP avec l'anticorps anti-Flag, alors qu'aucun signal n'a été trouvé dans les cellules transfectées avec le vecteur vide.

L'interaction entre S100A6 et CacyBP /SIP dans les cellules transfectées MKN45 a ensuite été évaluée par co-immunoprécipitation. Après incubation avec un anticorps anti-CacyBP, immunoprécipité par l'anticorps ont été détectés S100A6. Comme on le voit sur la Fig. 2B, une interaction entre S100A6 et de type sauvage CacyBP /SIP a été observée dans les lysats cellulaires MKN45-CacyBP; cependant, CacyBP mutant /SIP qui a été tronquée de la région aa178-229, produit peu de signal dans le test de co-immunoprécipitation. Par conséquent, le tronc mutant CacyBP /SIP a été nommé CacyBP /SIPΔS100 et fournit un outil utile pour étudier les effets de S100A6 sur le comportement biologique de CacyBP /SIP dans les cellules de cancer gastrique.

Effets de S100A6 sur la prolifération cellulaire induite par CacyBP /SIP dans la lignée cellulaire de cancer gastrique MKN45 in vitro

MTT et FACS essais ont été effectués pour examiner les effets de S100A6 sur la prolifération cellulaire induite par CacyBP /SIP dans MKN45 cellules in vitro
. En comparaison avec le vecteur transfectants vide, MKN45-pFLAG, à la fois de type sauvage et CacyBP /SIPΔS100 transfectants ont montré de manière significative la diminution des taux de prolifération cellulaire par le test MTT ( P
< 0,05) (Fig. 3A). Cependant, CacyBP /SIPΔS100 transfectants présentaient significativement plus une diminution du taux de croissance par rapport aux transfectants CacyBP /SIP de type sauvage ( P
< 0,05).

Les résultats de l'analyse du cycle cellulaire par FACS de même indiquer que la surexpression soit sauvage ou mutant CacyBP /SIP réduit MKN45 prolifération. Cependant, les indices prolifératifs moyens (PI) de cellules MKN45-ΔS100 (0,19 ± 0,03) était plus faible que celle des cellules MKN45-CacyBP (0,29 ± 0,02) ( P
< 0,05) (Fig. 3B) . Pris ensemble, ces données indiquent clairement que de type sauvage CacyBP /SIP inhibe la prolifération des cellules MKN45, tandis que CacyBP /SIPΔS100 intensifie cette inhibition de la prolifération.

Effets de S100A6 sur la tumorigenèse induite par CacyBP /SIP dans le MKN45 lignée cellulaire de cancer gastrique in vitro
et in vivo

la croissance indépendante de l'ancrage est une caractéristique importante de in vitro
croissance tumorale in. Par conséquent, nous avons examiné si la régulation positive de l'expression CacyBP /SIP inhibé la croissance des cellules MKN45 dans les médias et l'agar mou. Comme on le voit sur la Fig. 4A et B, CacyBP expression /SIP a entraîné une réduction marquée de la croissance cellulaire MKN45 dans un essai de formation de colonies, avec une réduction moyenne de 32,1% en moyenne et 62,0% dans la gélose molle ( P
< 0,05) . Cependant, la transfection de CacyBP /SIPΔS100 a entraîné une diminution encore plus grande de la croissance avec une diminution moyenne des taux de 84,2% en moyenne et 82,8% dans la gélose molle ( P
< 0,01).

pour confirmer cet effet in vivo
, nous injection sous-cutanée des cellules MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 et MKN45-PFLAG dans le hypodermia du cou de souris nues. Au bout de trois semaines, le volume moyen de la tumeur dans chaque groupe était significativement différente de celle des autres. À l'extrémité 5 ^{e semaine, le volume tumoral moyen du groupe MKN45-pFLAG était 776,9 ± 90,9 mm 3, ce qui est nettement supérieur à celui du groupe MKN45-CacyBP (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P
< 0,05), et plus encore que celle du groupe MKN45-ΔS100 (364,9 ± 71,9 mm 3) ( P
< 0,05) (Fig. 4C).}

Effets de S100A6 sur CayBP /SIP médiation β-caténine dégradation

en tant que composante du complexe ubiquitine ligase, CacyBP /SIP est impliqué dans la dégradation des phosphorylée β-caténine via Skp1 et SIAH1 contraignant. Donc, l'expression de β-caténine a été détectée pour évaluer indirectement l'influence de S100 sur SIAH1-CacyBP /SIP-Skp1 ligase unbiquitin. Tout d'abord, un dosage de co-immunoprécipitation ont montré que le mutant tronqué se lient CacyBP /SIP et les deux Skp1 SIAH1 (Fig. 5A), ce qui suggère S100A6 n'a pas affecté la formation de SIAH1-CacyBP /SIP-Skp1 complexe ligase unbiquitin. Deuxièmement, β- protéine caténine dans les cellules MKN45-ΔS100 est significativement diminuée, par rapport aux cellules MKN45-CacyBP, alors que sans changement survenu dans l'ARNm (Fig. 5B). En outre, comme β-caténine est nécessaire comme co-facteur pour l'activation du facteur de transcription, TCF /LEF, nous avons déterminé les effets de CayBP /Tcf SIPΔS100 sur l'activité /FEL en utilisant une transfection transitoire des tests de gène rapporteur. Expression de CacyBP /SIPΔS100 a donné lieu à plus faible activité Tcf /LEF que le type sauvage CacyBP /SIP (Fig. 5C). MG132, un inhibiteur de protéasome, pourrait éliminer l'effet des deux de type sauvage CacyBP /SIP et CacyBP /SIPΔS100 sur Tcf activité /LEF. Pris ensemble, nous avons déduit que S100A6 pourrait affecter CayBP /SIP β-caténine médiée dégradation via l'interaction avec CayBP /SIP.

Discussion

protéines de la famille S100 ont suscité un intérêt en raison de leur expression différentielle dans la tumeur des tissus et leur implication dans la progression du cancer et des métastases [19] - [22]. protéines S100 interagissent avec des protéines cibles de manière dépendante du calcium ou de calcium-indépendante et règlent en outre la fonction de ces objectifs [5], [23]. CacyBP /SIP est une nouvelle protéine cible qui peut interagir avec des protéines S100, y compris S100A6, S100A1, S100B, et S100P, mais pas S100A4, calbindine D, ou parvalbumine calmoduline [8], [16]. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont montré que la surexpression de CacyBP /SIP pourrait inhiber la prolifération et la tumorigenèse du cancer gastrique et le carcinome à cellules rénales [11], [12]. Malgré ces progrès, les effets des protéines S100 sur CacyBP /SIP restent à étudier.

Pour élucider la régulation des protéines S100 sur la fonction /SIP CacyBP, nous avons construit le mutant CacyBP /SIP tronquée sans S100 domaine de liaison de la protéine , de sorte que la protéine mutante ne pouvait interagir protéines S100 et conserve la capacité d'interagir avec et SIAH1 Skp1. Dans cette étude, des vecteurs d'expression eucaryotes pour type sauvage CacyBP /SIP et son mutant tronqué ont été effectivement exprimées en MKN45 cellules. Co-immunoprécipitation a démontré une interaction entre S100A6 et de type sauvage CacyBP /SIP dans MKN45 cellules. Cependant, CacyBP /SIPΔS100 a montré peu de signal par le test de co-immunoprécipitation, ce qui indique une interaction faible ou nulle avec S100A6. test MTT, le dosage FACS, essai clonogénique et xénogreffe de tumeur expérience chez des souris nues ont été réalisées pour tester l'effet de sauvage et mutant CacyBP /SIP sur la croissance cellulaire et la tumorigenèse fois in vitro
et in vitro
. Ces expériences ont montré que la surexpression de CacyBP /SIP peut inhiber la prolifération et la tumorigenèse des cellules de cancer de l'estomac MKN45. Surtout, les cellules transfectées avec CacyBP /SIPΔS100 présentaient des effets plus intenses par rapport aux transfectants de type sauvage, ce qui suggère que les protéines S100 peuvent réguler négativement l'inhibition de la prolifération cellulaire induite par CacyBP /SIP dans les cellules cancéreuses gastriques.

Le mécanisme mis en oeuvre par S100A6 pour moduler la fonction /SIP CacyBP pourrait se trouver dans les interactions et les fonctions des protéines. CacyBP /SIP est identifié d'être impliqués dans l'ubiquitination et la dégradation des β-caténine [24] - [28]. β- caténine a été trouvée pour être surexprimé ou activés dans les cellules en prolifération et dans de nombreuses tumeurs [29] - [31]. Fukushima et al. [32] ont montré que les cellules CacyBP /SIP knockout montrent dépréciés (caténine dégradation et un point de contrôle du cycle cellulaire de G1 défectueux, ce qui indique que la voie de dégradation β-caténine médiée par CacyBP /SIP définit un point de contrôle essentiel pour le développement des thymocytes et de la progression du cycle cellulaire Notre. des études antérieures ont également montré que CacyBP /SIP inhibe la croissance et la prolifération des cellules cancéreuses gastriques en partie par la dégradation de la β-caténine. Si S100 régule CacyBP /SIP à médiation par l'ubiquitine-ligase conserve inconnue. preuves cumulables a montré que plusieurs membres de la famille des protéines S100 pourraient réguler l'activation de leurs protéines cibles [33], [34]. Un homologue de levure récemment découverte CacyBP /SIP, SGT1, non seulement interagit avec les protéines S100 en calcium réglementés de manière, mais associe aussi avec Skp1 pour former Skp1 /cullin1 /F -.. complexe boîte ubiquitine ligase [35] Il a été constaté que S100A6 pourrait inhiber la phosphorylation de SGT1 par la caséine kinase II affecter l'activité [36] Dans notre expérience actuelle, on a également identifié que CacyBP /SIPΔS100 conservent la capacité à associer Skp1 et SIAH1, suggérant molécule S100 pourraient ne pas affecter la formation de SIAH1 /Skp1 /CacyBP complexe ubiquitine ligase. Néanmoins, la protéine β-caténine sans un changement du niveau d'ARNm dans les cellules /de SIPΔS100 transfectées CacyBP est nettement plus faible que les cellules transfectées de type sauvage. L'activité transcriptionnelle de Tcf /LEF, un gène cible de β-caténine, a diminué en conjonction avec mutant CacyBP /SIP sans liaison S100, contre sauvage CacyBP /SIP. Accoding à ces résultats, nous postulons que la protéine S100 pourrait réguler négativement l'activité de SIAH1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitine ligase par interaction avec CacyBP /SIP. blocage de sorte que la combinaison de S100 et CacyBP /SIP pourrait favoriser la dégradation caténine β, conduisent à l'inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses. Cette hypothèse peut être partiellement soutenu par Lee et al que dans les cellules ayant un niveau diminué de S100A6 la quantité de β-caténine est réduite [26]. Les résultats sont en accord avec les données concernant la régulation positive des protéines S100 et la dégradation déficiente de β-caténine dans la tumeur et les cellules en prolifération [37]. En outre, CacyBP /SIP a été montré pour interagir avec la tubuline et ERK1 /2 et jouer un rôle important dans les réarrangements du cytosquelette, la différenciation cellulaire ou de la dégénérescence [38] - [42].

Conclusions

protéine régule négativement S100A6 CacyBP /SIP à médiation par l'inhibition de la prolifération cellulaire gastrique du cancer, en partie grâce à l'effet sur la dégradation de β-caténine et d'activation de la transcription de TCF /LEF. Cependant, les mécanismes sous-jacents de régulation des S100A6 sur les protéines ubiquitination et d'autres fonctions via CacyBP /voie SIP-dépendante nécessitent une enquête plus approfondie.

• PLOS ONE: facteur d'activation de transcription 4 Confère une multirésistance Phénotype aux cellules de cancer gastrique par transactivation de SIRT1 Expression
• PLoS ONE: polymorphismes et un haplotype dans HEPARANASE associations génétiques avec la progression et le pronostic du cancer gastrique dans une population chinoise du Nord