PLoS One: S100A6 Protein negatívan szabályozza CacyBP /SIP-gátlást gyomorrák sejt proliferáció és tumorogenezisben

absztrakt

Calcyclin-kötő fehérje (CacyBP /SIP), amely alapján az a képessége, hogy kölcsönhatásba lépnek a S100 fehérjék kalcium-függő módon, korábban megállapították, hogy gátolja a proliferációt és a tumorgenezis gyomor- rákos sejtek a laboratóriumi körülmények között. Fontos, hogy a hatása S100 fehérjék biológiai viselkedésének CacyBP /SIP gyomorrákban homályos marad. A leírásban beszámolunk az építési eukarióta expressziós vektorok vad típusú CacyBP /SIP és egy csonka mutáns hiányzik az S100 fehérje kötő domén (CacyBP /SIPΔS100). A kifejezéseket a vad típusú és a csonkított rekombináns fehérjék bizonyítja transzfekciójával MKN45 gyomor rákos sejteket. Co-immunprecipitációs vizsgálatok igazolták közötti kölcsönhatás S100A6 és a vad típusú CacyBP /SIP MKN45 sejtekben. Eltávolítása az S100 fehérje kötő domén drámaian csökkentette az affinitása CacyBP /SIP S100 fehérjék által jelzett csökkentett együttes immunológiai S100A6 által CacyBP /SIPΔS100. Az MTT assay, FACS vizsgálattal, klonogén assay és tumor xe kísérletet végeztünk, hogy megállapítsuk a hatás CacyBP /SIP sejtnövekedést és tumorogenezisben in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Túlexpressziója CacyBP /SIP gátolta a proliferációt, valamint a tumorgenezis a MKN45 gyomorrák sejtek; elterjedése és tumorogenezisben rátákat még tovább csökkenthető a kifejezés CacyBP /SIPΔS100. Azt is kimutatta, hogy S100 fehérjék negatívan szabályozzák CacyBP /SIP-közvetített gátlását gyomorrák sejtproliferáció révén hatással β-catenin fehérje expresszió és transzkripciós aktivációs TCF /LEF. Bár az alsó hatásmechanizmus további vizsgálatokat igényel, ez a tanulmány az új betekintést a kölcsönhatás S100 proteinek és CacyBP /SIP, ami gazdagítja a tudásunkat S100 fehérjék és hasznos lehet az, hogy megértsük a gyomorrák kialakulásával. Katalógusa

bevezető hivatkozás: Ning X, a Sun S, Zhang K, Liang J., Chuai Y, Li Y et al. (2012) S100A6 Protein negatívan szabályozza CacyBP /SIP-közvetített gátlása gyomorrák sejt proliferáció és tumorigenezis. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185 katalógusa

Szerkesztő: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Olaszország katalógusa

Beérkezett: október 27, 2011; Elfogadva: december 15, 2011; Megjelent: január 25, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Ning et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány ben támogatták Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 30872964, 30772461 számú). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

S100 proteinek a legnagyobb alcsoport az EF-kéz Ca ^{2 + -kötő protein családja és az jellemzi, hogy sejt- és szövet-specifikus expressziós mintázatok. Ezek a fehérjék ismert, hogy szabályozzák a sejten belüli folyamatok, mint például a sejtciklus átmenet és a sejtes növekedés, a differenciálódás és a motilitás [1]. Egy egyedülálló tulajdonsága ezeknek a fehérjéknek, hogy az egyes tagok lokalizálódik adott sejtkompartmentekbe közül egyesek képesek áthelyezni upon Ca 2 + aktivációs [2], [3]. Amikor transzlokáció, ezek a fehérjék transzdukálhatósága Ca 2 + jel időbeli és térbeli módon kölcsönhatásban áll más S100 protein-specifikus célokat. Érdekes módon a legtöbb S100 gének találhatók egy géncsoport humán kromoszómán 1q21, a helyszínen, a gyakori kromoszóma-rendellenességek [4]. Ez az egyesület azt javasolja a kapcsolatot a kromoszóma-rendellenességek és a dereguláció S100 génexpresszió különböző tumorok. Naprakész, számos tagja S100 család már azonosítottak, hogy összefügg a tumor fejlődését és metasztázis [5], [6]. Azonban a pontos szerepét és fontosságát S100 fehérjék fejlesztése és támogatása a rák nehezen érthető. Megértése a biológiai funkció (i) az S100 fehérjék függ azonosítására S100 fehérje célokat. Eddig több lehetséges fehérje célokat, beleértve a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, annexin II, annexin VI annexin XI caldesmon és CacyBP /SIP, kimutatták, hogy kölcsönhatásba lépnek a S100 proteinek in vitro
egy Ca 2 + -függő módon [5], [7].}

Calcyclin-kötő fehérje (CacyBP /SIP), egy 30 kDa-os fehérje alapján azonosított azon képességét, hogy kölcsönhatásba lépnek a S100A6 egy Ca ^{2 + -függő módon Ehrlich aszcitesz tumor (EAT) sejtek [8], azt korábban gondolták, mint a több gyógyszerrel szembeni rezisztencia (MDR) -függő molekula a gyomorrák a laboratóriumunkban [9]. Használat révén történő monoklonális antitest ellen CacyBP /SIP [10], megmutattuk, hogy overexpressziója CacyBP /SIP gátolja a proliferációt és a daganatkeltés közös veserák sejtek [11]. További vizsgálat azt javasolta, hogy a CacyBP /SIP elnyomja a növekedés a gyomorrák [12]. Az elért eredmények ellenére a hatását S100 fehérjék CacyBP /SIP gyomorrákban továbbra sem tisztázott. Ezen túlmenően, CacyBP /SIP is megállapították, hogy egy komponens egy ubikvitináció komplex keresztül kötő Siah1 és Skp1 [13]. És ez a ligáz írták le, hogy szabályozza a bomlás nem foszforilezett β-catenin [13].}

CacyBP /SIP képes kötődni S100, Siah1 és Skp1 különböző régiókban. Az N-terminális régiót (AA 1-80) A CacyBP /SIP kimutatták, hogy van affinitása az Siah1. A C-terminális régiója CacyBP /SIP (aa178-229) ismert, hogy egy α-hélix; Ezen a területen kölcsönhatásba léphet S100 fehérje, beleértve S100A6 [14]. Skp1 kötő domént nem fedi át az S100-kötő régió és Skp1 kötődik a középső rész (aa78-155) A CacyBP /SIP [15], [16]. Megfigyelni a hatását S100 fehérjék biológiai viselkedésének CacyBP /SIP a gyomorrák, eukarióta expressziós vektorok vad típusú CacyBP /SIP és annak csonkolt mutáns hiányzik az S100 fehérje kötő domén (CacyBP /SIPΔS100) sikeresen kialakítani és hatékonyan kifejezni a MKN45 sejtekben. MTT-vizsgálattal, FACS vizsgálati eljárás, klonogén assay és tumor xenograft kísérlet végeztünk, hogy értékelje a hatását CacyBP /SIP a sejtnövekedésre és a tumorgenezis mindkét in vitro
és a in vivo katalógusa. Az E tanulmányok eredményei hozzájárulhatnak, hogy tisztázzuk az hatásait S100 fehérjék biológiai viselkedésének CacyBP /SIP gyomorrákban sejtekben.

Anyagok és módszerek

Sejtvonalak és állatokra

a gyomorrák sejtvonal MKN45, amelyről megállapították, hogy a legalacsonyabb expresszióját CacyBP /SIP a mi korábbi vizsgálatban [12], megőrizte laboratóriumunkban. A sejteket tenyésztettük RPMI 1640 tápközegben (GIBCO, Grand Island, NY, USA), kiegészítve 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal, penicillinnel (100 U /ml), és sztreptomicint (100 ng /ml) egy CO _{2 inkubátorban (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALB /c csupasz egerek 4-6 hetes koruk által nyújtott Shanghai Rákkutató Intézet az in vivo katalógusa tumorogenezisben tanulmány. Ezt a vizsgálatot végeztek szigorú ajánlásaival összhangban az Útmutató az ápolási és a laboratóriumi állatok felhasználását a National Institutes of Health. A protokoll hagyta jóvá a Bizottság Etikai Állatkísérletek negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem (engedély száma: 11.016). Minden műtét alatt végeztük nátrium pentobarbitál érzéstelenítés, és mindent megtett, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Katalógusa}

Immunfluoreszcenciás festés katalógusa

A sejteket vittük tisztítani fedőlemezen és fix 95% -os alkohol 20 percig szobahőmérsékleten hőmérséklet. A sejteket a fedőlemezeket PBS-sel mostuk és permeablized 10 percig 0,5% Triton X-100 PBS-ben. A sejteket anti-S100A6 antitest (hígított 1:2000) blokkolás után 3% szarvasmarha szérum albumin 1 órán át. A sejteket ezután FITC-konjugált anti-egér IgG-t (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) és üveg tárgylemezekre keverékével glicerin és a polivinil-alkohol tartalmú DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] - oktán). Immunfluoreszcenciával analizáltuk MRC-1024 Laser Scanning konfokális képalkotó rendszer (Bio-Rad). Katalógusa

A plazmid építési és a sejtek transzfekcióját katalógusa

oligonukleotid primereket tartalmazó Eco RI katalógusa vagy Eco
RV restrikciós szintetizáltuk, illetve amplifikálására a CDS szekvenciáját CacyBP /SIP vagy egy C-terminális deléciós (aa178-229) mutánsa CacyBP /SIP (csatlakozási AF_314752). A két láncindítót: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (szensz), és 5 'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3' (antiszensz); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (szensz), és 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (antiszensz), ill. A PCR körülményei a következők voltak: 5 perc 94 ° C-on a kezdeti denaturáció, majd 35 ciklus 45 másodperc 94 ° C, 45 sec, 60 °, és 60 másodperc 72 °, egy végső extenziós 10 percen át 72 °. Hossza A PCR-termékeket 687 bp CD-k, és a 534 bp C-terminális deléció. Mindegyik PCR terméket kivágtuk EcoR katalógusa I és EcoR
V restrikciós emésztéssel és klónozva hasonlóképpen emésztett PFLAG-CMV. Az új vektorok nevezték PFLAG-CacyBP (vad-típusú) és PFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). A betét szekvenciákat DNS-szekvenálással igazoltuk.

Cell transzfekció végeztünk Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), amint azt a gyártó. Röviden, a sejteket szélesztjük és növesztjük, hogy 70-90% összefolyás nélkül antibiotikumok. Ők aztán transzfektált 1 ng PFLAG-CacyBP vagy PFLAG-ΔS100. 24 órával a transzfekció után, G418-at (350 mg /ml) adtunk hozzá, hogy a táptalaj kiválasztására vonatkozó transzfektált sejtekben. Vegyes klónokat kiterjesztett további 6 héten keresztül. A sejteket transzfektáltuk üres vektor, PFLAG-CMV, alkalmaztunk negatív kontrollként. Ezek a stabil sejtvonalak nevezték MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 és MKN45-PFLAG a vad-típusú, csonkolt és negatív kontroll transzfektánsok, ill.

Co-immunprecipitációs

A MKN45 transzfektáns PBS-ben mostuk, elkülönítettük, és lizáltuk jégen egy pufferben, amely 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 8 mM MgCI _{2, 150 mM NaCi, 0,2 mM EGTA, és 1% Nonidet P-40. Az extraktumokat centrifugáltuk 12.000 rpm-en 25 percig 37 ° mikrocentrifugában. A felülúszókat használtuk egy immunprecipitációs vizsgálattal hozzáadása után proteáz inhibitorok (10 mg /l leupeptin, 5 mg /l aprotinin, 20 mg /l szójabab-tripszin inhibitor, 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid) és mennyiségileg a Bradford módszerrel. A felülúszókat inkubáltuk 30 ul protein A /G-Sepharose és 1 ng nem kapcsolt antitest 1-3 órán át 37 ° (pre-távolság). A nem kötődött frakciókat ezután inkubáltuk antitesteket tartalmazó szérumot ellen CacyBP /SIP 1,5 órán át 4 °. A keveréket ezután inkubáltuk további protein-A /G-Sepharose éjszakán át 4 °. A gyantát ezután háromszor mossuk egy pufferben, amely 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) és 150 mM nátrium-klorid, kétszer egy pufferben, amely 20 mM Tris-HCl-t (pH = 7,5) és 500 mM NaCI-ot, és végül 20 mM Tris sósavval pH = 7,5. Az összes puffer hogy használták kiegészültek proteáz inhibitorok. A gyanta és a megkötött fehérjéket oldhatóvá SDS mintapufferben, 5 percig forraltuk 98 °, és az alkalmazott SDS poliakrilamid gélen. A kifejezés a S100A6 analizáltuk Western-blottal antitest ellen S100A6.}

Western blot

A sejteket összegyűjtöttük, és lizáltuk jégen tartalmazó pufferben [50 mmol /l Tris-CI (pH = 7,5), 150 mmol /l nátrium-klorid, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /l PMSF-et és 1% NP 40], majd mennyiségileg a Bradford módszerrel. Annak a mértéke, 100 ug lizátumokban elektroforetizáltuk 10% -os SDS-PAGE és blottoltuk nitrocellulóz membránra. A membránokat blokkoltuk 10% zsírmentes tej, szobahőmérsékleten 2 órán és inkubáltuk anti-CacyBP (1:1500) és anti-β-aktin antitestet (Sigma, 1:5000), 4 ° éjszakán át. Három mosás után 15 percig minden egyes TBS kiegészített 0,1% Tween 20 (TBST), a membránt peroxidázzal konjugált kecske anti-egér /nyúl IgG antitesttel (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, China) 2 órán át szobahőmérsékleten hőmérséklet. Fokozott kemilumineszcencia (Amersham, Freiburg, Németország) használtunk kimutatására.

Metil tiazolil-tetrazolium (MTT) vizsgálat

sejtet oltunk egy 96 lyukas lemez 2,5 × 10 ^{3 sejt /lyuk RPMI 1640 közegben, amely 10% hővel inaktivált borjúembrió-szérummal. Minden mintát három ismétlésben. A táptalajt cserélve 2-napos időközönként, 6 napon át. A sejteket inkubáltuk 50 ul 0,2% MTT 4 órán át 37 °, 5% CO _{2 atmoszférában. Követően MTT inkubálást 150}}

• PLoS One: aktiváló transzkripciós faktor 4 ruházza multidrog fenotípus gyomorrák sejtek révén transzaktivációját SIRT1 Expression
• PLoS One: A polimorfizmus és a haplotípus Heparanáz Gene Egyesületek a progresszió és a gyomorrák prognózisa egy észak-kínai Population