Plos ONE: S100A6 Protein Negativno Uravnava CacyBP /SIP-zavrtje želodčnega raka Cell orožja in tumorigeneze

Povzetek

Calcyclin-vezavni protein (CacyBP /SIP), določi na podlagi svoje sposobnosti za interakcijo z S100 proteinov v kalcija odvisno način, je bila prej ugotovili, da zavira proliferacijo in tumorigeneze iz želodca rakave celice v našem laboratoriju. Pomembno je, da so učinki S100 proteinov na biološko obnašanje CacyBP /SIP raka želodca, še vedno nejasna. Tu smo poroča gradnjo evkariontskih izražanja vektorjev za divjega tipa CacyBP /SIP in okrnjen mutant manjka S100 vezavo proteinov domeno (CacyBP /SIPΔS100). Izrazi iz divjega tipa in okrnjenih rekombinantnih proteinov so dokazali s transfekcijo MKN45 raka želodca celic. Co-imuno testi pokazali, interakcijo med S100A6 in divjim CacyBP /SIP v MKN45 celicah. Odstranitev S100 vezave na beljakovine domeni dramatično zmanjša afiniteto CacyBP /SIP za S100 proteinov, kot je navedeno v zmanjšanem sodelovanja imuno za S100A6 ga CacyBP /SIPΔS100. MTT test, FACS test, klonogene test in tumor ksenogenskega eksperiment so bili izvedeni za oceno učinka CacyBP /SIP na rast celic in tumorigeneze in vitro
in in vivo
. Čezmerno CacyBP /SIP zaviral širjenju in tumorigeneze za MKN45 raka želodca celic; stopnje orožja in tumorigeneze so se še dodatno zmanjša z izraženimi CacyBP /SIPΔS100. Prav tako se je pokazalo, da S100 proteini negativno regulacijo CacyBP /SIP-posredovano zaviranje proliferacije želodca rakave celice, s pomočjo vpliva na β-catenin beljakovin izražanja in transkripcijske aktivacije TCF /LEF. Čeprav je osnovni mehanizem delovanja zahteva nadaljnje preiskave, ta študija ponuja nov vpogled v interakcijo med S100 proteinov in CacyBP /SIP, ki bi obogatili naše znanje S100 proteinov in biti koristna za naše razumevanje razvoja raka želodca.

Navedba: Ning X ned S Zhang K, Liang J Chuai Y Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein Negativno Uravnava CacyBP /SIP-zavrtje želodčnega raka celic orožja in tumorigeneze. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185

Urednik: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Italija

Prejeto: 27. oktober 2011; Sprejeto: 15. december 2011; Objavljeno: 25 januar 2012

Copyright: © 2012 Ning et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprta s sredstvi iz državnega Nature Science Foundation Kitajske (št 30872964, št 30772461). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

S100 proteini so največja podskupina v okviru EF-strani Ca ^{2 + -binding družino beljakovin in se odlikujejo z mobilnim in tkivno specifičnih vzorcev izražanja. Ti proteini so poznani uravnavajo znotrajcelično procese kot prehod od celičnega cikla in celično rast, diferenciacijo in gibljivosti [1]. Edinstvena lastnost teh beljakovin je, da so posamezni člani lokalizirana v posebnih celičnih oddelkov, iz katerih so nekatere lahko preselijo na Ca 2 + activation [2], [3]. Po prenos, lahko te beljakovine transducira na Ca 2+ signal v časovno in prostorsko način, ki ga v stiku z različnimi S100 ciljev specifičnih proteinov. Zanimivo je, da je večina S100 geni nahajajo v genski skupini na človeškem kromosomu 1q21, stran od pogostejših kromosomskih nepravilnosti [4]. Ta zveza kaže povezavo med kromosomskih nenormalnosti in deregulacijo S100 izražanje genov v različnih tumorjev. Do sedaj so bile ugotovljene številne člane S100 družine, da je povezana z razvojem tumorjev in metastaz [5], [6]. Vendar pa so natančne vloge in pomena S100 beljakovin v razvoj in promocijo raka slabo razumljen. Razumevanje biološke funkcije (-e) S100 proteinov bo odvisno od identifikacije proteinskih tarč S100. Do sedaj, več možnih beljakovin ciljev, vključno gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, vezave aneksin II, vezave aneksin VI, aneksina XI caldesmon in CacyBP /SIP, se je izkazalo, da interakcijo z S100 proteinov in vitro
je z Ca 2 + -dependent način [5], [7].}

Calcyclin-vezavni protein (CacyBP /SIP), 30 kDa protein identificiramo na podlagi svoje sposobnosti za interakcijo z S100A6 je z Ca ^{2 + -dependent način Ehrlich ascitesa tumorja (EAT) celice [8], se je domnevalo prej kot upor večkratni drog (MDR) -povezana molekule v raka želodca v našem laboratoriju [9]. Skozi uporabo monoklonskih protiteles proti CacyBP /SIP [10], smo pokazali, da prekomerna CacyBP /SIP zavira proliferacijo in tumorgenesis ledvic celic raka [11]. Nadaljnja raziskava je predlagal, da CacyBP /SIP zavira rast raka želodca [12]. Kljub temu napredku, učinki S100 proteinov na CacyBP /SIP pri raku želodca ostajajo nejasne. Poleg tega je bila CacyBP /SIP tudi ugotovila, da je sestavni del ubikvitinacije kompleksa preko vezave Siah1 in Skp1 [13]. In to ligaza je bil opisan urediti razgradnjo non-fosforiliranega beta catenin [13].}

CacyBP /SIP lahko veže S100, Siah1 in Skp1 po različnih regijah. Regija N-terminalni (aa 1-80) od CacyBP /SIP Dokazano je, da imajo afiniteto za Siah1. C-terminalna regija CacyBP /SIP (aa178-229) je znano, da se tvori alfa-vijačnico; to domeno lahko interakcijo z S100 proteinov, vključno S100A6 [14]. Skp1 vezavna domena ne prekriva z S100 zavezujoč regiji in Skp1 veže na srednjem delu (aa78-155) z CacyBP /SIP [15], [16]. Upoštevati učinke S100 proteinov na biološko obnašanje CacyBP /SIP na raka želodca, evkariontskih izražanja vektorji za divjega tipa CacyBP /SIP in njeni okrnjeni mutant ki nima S100 vezavo proteinov domeno (CacyBP /SIPΔS100) so bile uspešno izdelana in učinkovito izrazil v MKN45 celicah. MTT test, FACS test, klonogene test in tumor ksenogenskega poskus smo izvedli za oceno učinkov CacyBP /SIP na celično rast in tumorigeneze tako in vitro
in in vivo
. Rezultati teh študij lahko prispevajo za pojasnitev učinkov S100 proteinov na biološko obnašanje CacyBP /SIP v želodcu rakavih celic.

Materiali in metode

Celične linije in živali

želodčni rak celična linija MKN45, ki je bilo ugotovljeno, da je najnižja izražanje CacyBP /SIP v prejšnji raziskavi [12], se je ohranila v našem laboratoriju. Celice v RPMI gojili 1640 medija (GIBCO, Grand Island, NY, ZDA), dopolnjenem z 10% toplotno inaktiviramo fetalnega telečjega seruma, penicilin (100 U /ml) in streptomicin (100 ug /ml) v CO _{2 inkubator (Forma Scientic, Marjetta, OH, ZDA). BALB /c golih miši po 4-6 tednih starosti so bili pridobljeni v Šanghaju Cancer Institute za vivo
študije tumorigeneze. Ta študija je bila izvedena v strogo v skladu s priporočili v navodilih za nego in uporabo laboratorijskih živali iz National Institutes of Health. Protokol je odobril Odbor za etiko eksperimentov živali četrtega vojaške Medical University (dovoljenje številka: 11016). Vse operacija je bila izvedena v skladu z natrijevim pentobarbital anestezijo in vsak trud je bil dosežen, da se zmanjša trpljenje.}

imunofluorescenco

Celice smo nanesli na očiščenih coverslips in fiksna z 95% alkohola 20 minut pri sobni temperature. Celice o coverslips speremo s PBS in permeablized 10 minut z 0,5% Triton X-100 v PBS. Celice inkubiramo z anti-S100A6 protitelesa (razredčen 1:2000) za blokiranje s 3% serumskega albumina goveje 1 h. Celice smo nato inkubirali s FITC konjugiranim anti-mišji IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, ZDA) in nameščena na steklenih ploščicah z mešanico glicerol in polivinil alkohol vsebuje DABCO ([2,2 1,4 diazobicylo- 2,] - oktana). Imunofluorescenčni smo analizirali z MRC-1024 Laser Scanning Konfokalni Imaging System (Bio-Rad).

plazmida gradnjo in celic transfekciji

oligonukleotidnih primerjev, ki vsebujejo Eco
RI ali Eco
RV omejitev stran sintetiziramo, v tem zaporedju, za pomnoževanje CDS zaporedja CacyBP /SIP ali izbris (aa178-229) mutanta C-terminal za CacyBP /SIP (pristop AF_314752). Dva primerji so bili: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (čut) in 5 'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3 "(anti-sense); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (občutek) in 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (anti-sense), oz. Pogoji PCR so bili: 5 min pri 94 ° C za začetno denaturaciji, ki ji sledi 35 ciklov 45 sekund pri 94 °, 45 sekund pri 60 ° C in 60 sekund pri 72 °, s končno razširitvijo 10 min pri 72 ° C. Dolžine produktov PCR so bili 687 bp za CDS, in 534 bp za brisanje C-terminal. Vsak izdelek PCR smo izrezali z EcoR
I in EcoR
V restriction prebavo in klonirali v podobno prebavi pFLAG-CMV. Novi vektorji so poimenovali pFLAG-CacyBP (divji tip) in pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Vložna sekvence so potrdili zaporedja DNK.

Cell transfekciji smo izvedli z Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kot ga je opisal proizvajalec. Na kratko, celice prevlečeni in zrasel za 70-90% sotočja brez antibiotikov. So bili nato transfektirali z 1 ig pFLAG-CacyBP ali pFLAG-ΔS100. Po 24 urah po transfekciji smo G418 (350 mg /ml) dodamo k mediju kulture za izbiro transfektiranih celic. Mešani klone smo razširili za dodatnih 6 tednov. Celice transficirane s praznim vektorjev, pFLAG-CMV, smo uporabili kot negativno kontrolo. Te stabilne celične linije so poimenovali MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 in MKN45-pFLAG za divjega tipa, okrnjenih in negativne kontrole transfektantov oz.

Co-imuno

MKN45 transfektanti bilo sprali v PBS, poberemo in lizirali na ledu v pufru, ki vsebuje 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl _{2, 150 mM NaCI, 0,2 mM EGTA in 1% Nonidet P-40. Ekstrakte smo centrifugirali pri 12000 obratih na minuto za 25 minut pri 37 ° C v mikrocentrifugi. Supernatante smo uporabili za imuno testu po dodatku proteaznih inhibitorjev (10 mg /l leupeptina, 5 mg /l aprotinina, 20 mg /l inhibitorja sojinega tripsina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid) in količinsko po Bradfordu. Supernatante smo inkubirali z 30 ul protein A /G-Sepharose in 1 ug nepovezanega protitelesa za 1-3 ur pri 37 ° (pre-potrditvi). So nevezane frakcije smo potem inkubirali z serum, ki vsebuje protitelesa proti CacyBP /SIP 1.5 ure pri 4 ° C. Zmes nato inkubiramo pri dodaten protein A /G-Sepharose preko noči pri 4 ° C. Smolo smo nato sprali trikrat v pufru, ki vsebuje 20 mM tris- HCl (pH 7,5) in 150 mM NaCl, dvakrat v pufru, ki vsebuje 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) in 500 mM NaCl, in končno v 20 mM Tris -HCl pri pH 7,5. Vse odbojnikov, ki so bili uporabljeni smo dopolnili z zaviralci proteaze. Smole in vezane proteine ​​smo raztopili v vzorčnem pufru SDS, kuhamo 5 minut pri 98 ° C in se uporablja na SDS poliakrilamidnem gelu. Izraz S100A6 smo analizirali z western blot s protitelesom proti S100A6.}

Western blot

Celice zberemo in lizirali na ledu v pufru, ki vsebuje [50 mmol /L Tris-Cl (pH 7,5), 150 mmol /L NaCI, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /L PMSF in 1% NP 40] in nato kvantitativno določimo z metodo Bradfordu. Ukrep 100 ig lizatov smo elektroforezo v 10% SDS-PAGE in opral na nitrocelulozno membrano. Membrane smo blokirali z 10% nemastnega mleka pri sobni temperaturi 2 uri in inkubiramo z anti-CacyBP (1:1500) in anti-P-aktina protitelesa (Sigma, 1:5000) pri 4 ° C čez noč. Po treh opere za 15 minut vsak v TBS dopolnjen z 0,1% Tween 20 (TBST) smo membrano inkubirali s peroksidazo konjugiranih kozje anti-miš /zajca IgG protiteles (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, China) 2 h pri sobni temperature. Izboljšano kemiluminescenca (Amersham, Freiburg, Nemčija) smo uporabili za detekcijo.

metil tiazolilnih tetrazolijevega (MTT) preizkus

Celice smo zasejali s 96 vdolbinami pri 2,5 x 10 ^{3 celic /jamico v RPMI 1640 medij, ki vsebuje 10% fetalni telečji serum toplotno inaktiviran. Vsak vzorec je imel tri ponovitve. Medij je bil zamenjan pri 2-dnevnih intervalih, 6 dni. Celice inkubiramo pri 50 ul od 0,2% MTT 4 ure pri 37 ° C v 5% CO _{2 atmosferi. Po MTT inkubacije je bila 150 ul alikvot 100% DMSO dodamo vsaki kulturi raztopimo kristale. Živih celic so bili prešteti vsak dan z branjem absorbanco pri 490 nm z bralnikom 96-plošče, BP800 (DYNEX Technologies, Chantilly, VA).}}

Cell ciklusu

Subconfluent celice sprali z ledeno mrzlo PBS, suspendiramo v 0,5 ml etanola in nato hrani pri 4 ° C 30 minut. Suspenzijo smo filtrirali skozi 50-im najlonske mreže in vsebnost DNA obarvanih jeder smo analizirali s pretočnim citometrom (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Profil celični cikel smo analizirali s pomočjo multicycle-DNA Cell cikel analiziranih programske opreme. V proliferativni indeksi (PI) so bile izračunane na naslednji način:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

klonogene test

Za merjenje hitrosti širjenja orožja za posamezne celice in vitro
, smo izvedli plošča klonogene in mehki agar klonogene analize [17]. Za plošče klonogene testu smo 1 x 10 ^{3 celice zasejemo v posodo 9 cm in kultivirali v RPMI 1640 mediju za dva tedna, da se omogoči nastanek kolonij. Kolonije so bile določene v 70% etanol, obarvali z raztopino Giemsa in prešteti. Za mehko agar klonogene testom smo celice samostojna in prekrita na 0,3% agaroze z 0,5% agaroznem podlage (1 x 10 3 /jamico v 24 vdolbinicami). Število žarišč > 100 mikrometrov je štela po 20 dneh}

rast tumorjev pri golih miših

logaritmično rastočih celic (1 × 10 ^{7 celic) tripsiniziramo, resuspendirali v 0,1. ml D'Hanks raztopine in vbrizga v hypodermia vratu vsakega gole miši. Miši smo nato spremljali na volumen tumorja, splošno zdravje in celotne telesne teže. Velikost podkožnega mase tumorja merimo s šestilom pet tednov. volumen tumorja je bila izračunana po formuli: 0,5 × dolžina × širina 2. Vsak eksperimentalna skupina je bila sestavljena iz petih miši.}

Reporter gene test

testom učinek CacyBP /SIP in CacyBP /SIPΔS100 na transkripcijske aktivnosti TCF /LEF, je bila izvedena reporterski gen test kot je opisano [18]. Na kratko, celice v 24-vdolbinami (50.000 celic na jamico) smo sočasno transfektirali z ali brez pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 in reporterskega plazmida, pTOPFLASH, ki vsebujejo divjega tipa TCF /lef vezavnih mest z uporabo Lipofectamine 2000; PRL-TK Renilla
luciferaza novinar služil kot kontrola za učinkovitost transfekciji. Luciferazno aktivnost meri in kvantificiramo v luminometer z Dual-luciferazno Reporter preskusnega sistema (Promega, Southampton, Združeno kraljestvo). Poskuse smo izvedli v trojniku in dvakrat ponovili. Rezultati so izraženi kot povprečje razmerja med kresničkino luciferazno dejavnosti in aktivnosti renilla luciferazne.

Statistična analiza

Vse podatke smo analizirali s pomočjo statističnega programskega paketa SPSS (SPSS, Inc., Chicago, Illinois) in P
< 0.05 smo imeli statistično značilne. Pomen razlike v pogostosti CacyBP /SIP-pozitiven barvanjem med sosednjimi vzorcev tumorjev in tumorjev smo analizirali s testom hi-kvadrat. Študent je t
preizkus in enosmerno bilo zaposlenih analiza variance sledi več primerjalnih testih Dunnettov za analizo drugih podatkov.

Rezultati

Endogeni izraz S100A6 raka želodca celična linija MKN45

S100A6 je bil izbran kot model za opazovanje učinka S100 proteinov na biološke funkcije CacyBP /SIP. Endogenega izraz S100A6 v raka celične linije želodca MKN45 je bil prvič odkrit z Western blot in imunofluorescenco. Kot je prikazano na sliki. 1A, je S100A6 izražen v MKN45 celicah. Imunofluorescenco kaže, da je S100A6 porazdelila predvsem v jedrski membrano z zelo malo našel v jedrskem plazmi na MKN45 celic (sl. 1B).

Interakcija med S100A6 in CacyBP /SIP v želodcu rakavih celic MKN45

v prejšnjem poročilu, CacyBP /SIP, ki je bila izražena na relativno nizki ravni MKN45 celicah, so bila izražena v različnih vrstah želodca raka celičnih linij [12]. Da bi lahko ocenili sodelovanje med S100A6 in CacyBP /SIP, divjega tipa in mutant (aa178-229) CacyBP /SIP cDNA so klonirali v pFLAG-CMV vektorja in stabilno transfektirali v MKN45 celice. Ocenili smo izražanje CacyBP /SIP v teh stabilnih celičnih linij, ki jih zahodni blot. Kot je prikazano na sliki. 2A je, ZASTAVA označena CacyBP /SIP našli v divjem tipu in mutiranih CacyBP /SIP transfektanti z anti-Flag protitelesa, medtem ko ni bilo signala najdemo v celicah transfekcije s praznim vektorjem.

Interakcija med S100A6 in CacyBP /SIP v transfektant MKN45 celic smo nato ocenili s co-imuno. Po inkubaciji z anti-CacyBP protitelesa so imunoprecipitirajo odkrile S100A6 protitelesa. Kot je prikazano na sliki. 2B, interakcija med S100A6 in divjim CacyBP /so opazili SIP v celičnih lizatov MKN45-CacyBP; Vendar pa mutant CacyBP /SIP, ki je bil odrezan od aa178-229 regije, proizvaja malo signal v co-imuno testom. Zato je bila okrnjena mutant CacyBP /SIP imenovan CacyBP /SIPΔS100 in zagotavlja koristno orodje za preiskavo učinkov S100A6 na biološko obnašanje CacyBP /SIP v želodcu rakavih celic.

Učinki S100A6 na celično proliferacijo s CacyBP /SIP povzročene v želodčni rak celične linije MKN45 in vitro

MTT in FACS analize so bile izvedene, naj preuči učinke S100A6 na celično proliferacijo s CacyBP /SIP inducira v MKN45 celicah in vitro
. V primerjavi s praznimi vektorskih transfektanti, MKN45-pFLAG tako divjega tipa in CacyBP /SIPΔS100 transfektanti bistveno pokazali znižala stopnje proliferacijo celic z MTT testom ( P
< 0,05) (. Slika 3A). Vendar CacyBP /SIPΔS100 transfektanti razstavljen bistveno bolj znižala stopnja rasti v primerjavi z divjim tipom CacyBP /SIP transfektanti ( P
< 0,05).

Rezultati analize celičnega cikla, ki ga FACS podobno kažejo, da prekomerno bodisi divje ali mutant CacyBP /SIP zmanjšuje MKN45 orožja. Vendar pa je bila povprečna proliferativni indeksi (PI) za MKN45-ΔS100 celic (0,19 ± 0,03), nižja od MKN45-CacyBP celic (0,29 ± 0,02) ( P
< 0,05) (. Slika 3B) . Če povzamemo, ti podatki jasno kažejo, da divji tip CacyBP /SIP zavira proliferacijo MKN45 celic, medtem ko CacyBP /SIPΔS100 stopnjuje to zaviranje proliferacije.

Učinki S100A6 na tumorigeneze s CacyBP /SIP inducira v MKN45 karcinom linija želodca in vitro
in in vivo

Anchorage neodvisen rast je pomembna značilnost vitro
rasti tumorja. Zato smo pregledali, ali Povecanje od CacyBP /SIP izražanja zaviral rast MKN45 celic v medijih in mehkega agarja. Kot je prikazano na sliki. 4A in B, CacyBP /SIP izraz povzročilo znatno zmanjšanje rasti MKN45 celic pri testu nastanek kolonij, s povprečno zmanjšanje za 32,1%, v srednjih in 62,0% v mehkem agarju ( P
< 0,05) . Vendar transfekcija CacyBP /SIPΔS100 povzročilo še večje znižanje rasti s povprečno zmanjšanje stopnje 84,2%, v srednjih in 82,8% v mehkem agarju ( P
< 0,01).

za potrditev tega učinka in vivo
smo subkutano MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 and MKN45-pFLAG celice se v hypodermia vratu golih miših. Po treh tednih je bila povprečna volumen tumorja v vsaki skupini bistveno drugačna od drugih. Na 5 ^{th tednu je bila povprečna količina tumor v skupini MKN45-pFLAG 776.9 ± 90.9 mm 3, kar je bistveno več kot v skupini MKN45-CacyBP (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P
< 0,05), in še več kot to skupine MKN45-ΔS100 (364.9 ± 71,9 mm 3) ( P
< 0,05) (sl. 4C).}

Učinki S100A6 na CayBP /-SIP posredovano ß -catenin razgradnje

Kot sestavni del ubikvitina ligaza kompleksa, ki je CacyBP /SIP sodeluje pri razgradnji unphosphorylated β -catenin preko vezave Skp1 in Siah1. Tako je bila odkrita izraz beta -catenin posredno oceniti vpliv S100 na Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaze. Prvič, co-imuno test je pokazal, da okrnjena mutant CacyBP /SIP vežejo tako Skp1 in Siah1 (sl. 5A), kar kaže, S100A6 ni vplivala na nastanek Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaza kompleksa. Drugič, β- catenin beljakovin v MKN45-ΔS100 celice bistveno zmanjšala, v primerjavi z MKN45-CacyBP celic, medtem ko je pri prišlo do nobene spremembe v mRNA (sl. 5b). Poleg tega, ker je β-catenin potreben kot kofaktor za aktiviranje transkripcijskega faktorja, TCF /LEF smo ugotovili učinke CayBP /SIPΔS100 na TCF /LEF aktivnosti s pomočjo prehodnega transfekciji reporterski gen testov. Izražanje CacyBP /SIPΔS100 povzročilo manjše TCF /LEF dejavnosti kot divji tip CacyBP /SIP (sl. 5C). MG132, zaviralec proteasoma, bi lahko odpravili učinek tako divjega tipa CacyBP /SIP in CacyBP /SIPΔS100 na TCF /LEF dejavnosti. Skupaj, smo sklepali, da bi lahko S100A6 vpliva CayBP /SIP posredovanega ß -catenin degradacije prek interakcije z CayBP /SIP.

Pogovor

S100 družinske beljakovine so pridobili zanimanje zaradi svoje diferencialne ekspresije v tumor tkiva in njihovo sodelovanje pri napredovanju raka in metastaz [19] - [22]. S100 beljakovine interakcijo z nekaterimi ciljnimi beljakovin v kalcija odvisni ali kalcijevega neodvisen način in dodatno regulacijo delovanja teh ciljev [5], [23]. CacyBP /SIP je nova tarčni protein, ki lahko interakcijo z S100 beljakovine, vključno S100A6, S100A1, S100B in S100P, ne pa na S100A4, calbindin D, parvalbumin ali kalmodulin [8], [16]. Prejšnje dela v našem laboratoriju je pokazala, da bi lahko čezmernim CacyBP /SIP zavira proliferacijo in tumorigeneze raka želodca in ledvičnih celic raka [11], [12]. Kljub temu napredku, učinki S100 proteinov na CacyBP /SIP je treba še raziskati.

Za pojasnitev ureditev S100 proteinov na funkcijo /SIP CacyBP, smo zgradili skrajšano CacyBP /SIP mutant brez S100 vezave na beljakovine domeni tako da mutant proteina ne morejo medsebojno S100 proteinov in ohrani sposobnost interakcije z Siah1 in Skp1. V tej študiji so evkariontski ekspresijski vektorji divjega tipa CacyBP /SIP in njene prisekane mutante učinkovito izražen v MKN45 celicah. Co-imuno pokazala interakcijo med S100A6 in divjim CacyBP /SIP v MKN45 celicah. Vendar CacyBP /SIPΔS100 je malo signala s co-imuno testom, kar kaže na šibko ali nič interakcijo z S100A6. MTT test, FACS test, klonogene test in tumor ksenogenskega eksperiment v golih miših so bili izvedeni za preizkušanje učinkov divjadi in mutant CacyBP /SIP na rast celic in tumorigeneze tako in vitro
in in vitro
. Ti poskusi so pokazali, da bi lahko čezmernim CacyBP /SIP zavira proliferacijo in tumorigeneze za MKN45 raka želodca celic. Pomembno je, da celice transfektirane s CacyBP /SIPΔS100 razstavljene močnejše učinke v primerjavi z divjim tipom transfektanti, kar kaže, da bi S100 proteini negativno regulacijo inhibicijo celične proliferacije, ki jih CacyBP /SIP v želodcu rakavih celic, inducirane.

Mehanizem zaposleni s S100A6 za moduliranje CacyBP funkcija /SIP lahko ležijo v proteinskih interakcij in funkcij. CacyBP /SIP je ugotovil, da se vključijo v ubikvitinacije in degradacijo beta catenin [24] - [28]. β- catenin bilo ugotovljeno, da je prekomerno ali aktivira v proliferirajoče celice in v številnih tumorjih [29] - [31]. Fukushima sod. [32] ugotovila, da kažejo CacyBP /SIP izpadanje celice oslabljena (-catenin degradacijo in kontrolne točke v okvari G1 celičnega cikla, kar pomeni, da je β-catenin degradacija poti posreduje CacyBP /SIP opredeljuje pomembno kontrolno točko za razvoj timocitno in napredovanju celičnega ciklusa. Our prejšnje študije so pokazale, da CacyBP /SIP zavira rast in razmnoževanje želodčnih rakavih celic deloma prek degradacije p -catenin. Ali S100 ureja CacyBP /-SIP posredovano ubikvitin ligaza ohranja znan. kopičijo dokazi pokazali, da bi lahko več članov proteinske družine S100 urediti aktiviranje njihovih ciljnih beljakovin [33], [34]. Pred kratkim odkrili kvas homolog CacyBP /SIP, Sgt1, ne komunicira le z S100 proteinov v kalcijev urejen način, ampak tudi povezuje s Skp1 da tvorijo Skp1 /cullin1 /F -.. box ubikvitin ligaza kompleks [35] je bilo ugotovljeno, da bi S100A6 zavre fosforilacijo Sgt1 s kazein kinaze II vpliva na dejavnost [36] V našem sedanjem poskusu, označene smo tudi, da CacyBP /SIPΔS100 obdržijo sposobnost povezati z Skp1 in Siah1, kar kaže S100 molekule ne bi vplivala na nastanek Siah1 /Skp1 /CacyBP ubikvitin ligaza kompleksa. Kljub temu, β-catenin protein brez spremembe ravni mRNA v CacyBP /SIPΔS100 transfektirali celic je znatno nižja od transfektant celic divjega tipa. Transkripcijski dejavnost TCF /LEF, ciljnega gena za beta-catenin, se je zmanjšala v povezavi z mutiranim CacyBP /SIP brez vezave S100, v primerjavi z divjim CacyBP /SIP. Accoding teh rezultatov, smo domnevajo, da bi lahko S100 protein negativno ureditvi dejavnosti Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubikvitina ligaze z interakcijo z CacyBP /SIP. Torej blokira kombinacija S100 in CacyBP /SIP bi spodbujali beta -catenin razgradnjo, povzroči zaviranje širjenja rakavih celic. Ta ugibanja je mogoče delno podprta z Lee et al, da je v celicah z zmanjšano stopnjo S100A6 količina beta -catenin zmanjša [26]. Rezultati so v soglasju s podatki v zvezi z regulacijo navzgor S100 proteinov in degradacije pomanjkljivo z beta -catenin v tumor in proliferirajoče celice [37]. Poleg tega je bila CacyBP /SIP izkazalo, da interakcijo z tubulinu in ERK1 /2 in igrajo pomembno vlogo pri prerazporeditve v citoskeletona, diferenciacijo celic ali degeneracije [38] - [42].

Sklepi

S100A6 protein negativno uravnava CacyBP /-SIP zavrtje širjenja želodca rakave celice, deloma s pomočjo učinka na razgradnjo β-catenin in transkripcijske aktivacije TCF /LEF. Vendar pa temeljna mehanizmi za regulacijo S100A6 o beljakovin ubikvitinacije in drugih funkcij preko CacyBP /SIP-odvisni poti zahtevajo nadaljnje preiskave.

• Plos ONE: Aktiviranje Transcription Factor 4 daje rezistenco fenotip do želodca raka celice skozi transaktivacije od SIRT1 izražanja
• Plos ONE: polimorfizmi ter haplotip v heparanazo Gene združenj s napredovanje in prognozo želodčnega raka v severni kitajski Population