PLoS ONE: Expression von AFP und STAT3 beteiligt ist in Arsentrioxid-induzierte Apoptose und Hemmung der Proliferation in AFP-produzierenden Magenkarzinomzellen

Abstrakt

Alpha-Fetoprotein (AFP) produzierenden Magenkrebs (AFPGC), durch die Produktion von AFP vertreten, hat ein aggressiveres Verhalten als gemeinsame Magenkrebs. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht gut verstanden. Arsentrioxid (As _{2 O 3) verwendet wird klinisch akuter Promyelozytenleukämie (APL) zu behandeln und hat Aktivität In-vitro-
gegen mehrere feste Tumorzelllinien, mit der Induktion von Apoptose und Hemmung der Proliferation die Hauptwirkungen. Signaltransducer und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) spielt eine wichtige Rolle in der Tumorgenese von verschiedenen primären Tumoren und Krebszellen durch zell Überleben upregulating und Tumorsuppressorproteine ​​Herunterregulieren. Hier fanden wir verminderte Expression von AFP und STAT3 nach der Induktion von Apoptose durch As 2 O 3 in den AFPGC FU97 Zellen. Außerdem wurde die Höhe der STAT3 Ziel Onkogen Bcl-2 verringerte sich mit As 2 O 3, und die des Tumorsuppressor-Bax erhöht. Darüber hinaus wurden STAT3 Ausdruck und Tiefe der Invasion und Lymphknotenmetastasen assoziiert. Das Überleben der Patienten mit Magenkrebs niedriger war mit AFP und STAT3 Doppelexpression als mit Überexpression von entweder allein. Herunterregulieren von AFP und STAT3-Expression spielt eine wichtige Rolle in As 2 O 3 induzierte Apoptose von AFPGC Zellen, die einen neuen Mechanismus der As 2 O 3-induzierter Zell-Apoptose hindeutet. Als 2 O 3 ein mögliches Mittel zur AFPGC Behandlung sein kann}

Citation:. Jia Y, Liu D, Xiao D, Ma X, Han S, Zheng Y, et al. (2013) Die Expression von AFP und STAT3 Ist in Arsentrioxid-induzierte Apoptose und Hemmung der Proliferation in AFP-Producing Magenkrebszellen beteiligt. PLoS ONE 8 (1): e54774. doi: 10.1371 /journal.pone.0054774

Editor: Matias A. Avila, Universität von Navarra School of Medicine und Zentrum für Angewandte Medizinische Forschung (CIMA), Spanien

Empfangen: 4. November 2012; Akzeptiert: 14. Dezember 2012 um; Veröffentlicht: 30. Januar 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wird von National Nature Science Foundation Grant of China (NSFC, Nr 81000869 und 81272588) unterstützt. (Http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm.). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Alpha-Fetoprotein (AFP) ist ein Hauptplasmaprotein durch den Dottersack und in der Leber während des fötalen Lebens produziert. In der klinischen Praxis wird AFP oft als Tumormarker des hepatozellulären Karzinoms und Dottersacktumoren eingesetzt. Einige Studien haben gezeigt, dass die anderen Tumoren in menschlichen auch AFP produzieren könnte und Magenkrebs war eine der häufigsten [1] - [8]. AFP-produzierenden Magenkrebs (AFPGC) hat ein aggressiveres Verhalten als gemeinsame Magenkrebs, weil die Krankheit schnell und metastasieren häufig in die regionalen Lymphknoten und Leber [7] fortschreitet - [10]. Darüber hinaus wird AFPGC mit kürzeren Intervall freien Lebermetastasen nach radikaler Operation verbunden, und die Überlebensrate deutlich schlechter mit AFPGC als ohne AFP Produktion [1], [9], [10]. So kann AFP ein passives Tumormarker und ein aktives Tumorwachstum Stimulator sein. Herunterregulieren AFP-Expression kann ein wirksamer Ansatz sein, um Krebs AFP-produzierenden

Arsentrioxid (As _{2 O 3) verwendet wurde erfolgreich Leukämie [11] zu behandeln -. [13] und aktiv ist in mehreren soliden Tumoren, einschließlich Magenkrebs [14]. Der Wirkungsmechanismus von As 2 O 3 enthält beeinflussen die Aktivitäten von Akt, JNK-Kinasen, NF-kappaB, Glutathion, Calcium-Signalgebung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Caspasen sowie pro- und anti -apoptotic Proteine ​​[15] - [18]. Keine Standard-Chemotherapie ist für AFPGC, obwohl einige Therapien Wirksamkeit bei einer kleinen Anzahl von Fällen gezeigt haben [19] - [21]. Auch die Wirkungen und Mechanismen von As 2 O 3 gegen AFPGC bleiben unklar.}

Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) wird sowohl in der Signaltransduktion und Transkriptionsaktivierung beteiligt und eine wichtige Rolle hat in verschiedenen biologischen Prozessen, wie Stoffwechsel und tumorigenesis [22], [23]. STAT3 konstitutiv ist in einer Vielzahl von Krebsarten aktiviert [24], [25]. STAT3 Targeting kann ein wirksamer Ansatz sein Tumorprogression zu adressieren. Diese STAT3 Effekt wird durch Regulierung verschiedener STAT3 Zielgene vermittelt werden, einschließlich Apoptose-Inhibitoren und Zellzyklus-Regulatoren, wie beispielsweise Bcl-2, Mcl-1, Survivin, p53, c-Myc, Cyclin D1 [26] - [31] und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) [32]. Allerdings ist die Rolle von STAT3 in AFPGC schlecht verstanden.

Hier haben wir die Wirkung von As geprüft _{2 O 3 auf die Proliferation und AFP und STAT3-Expression in AFPGC FU97 Zellen. Wir werteten Downstream Ereignisse von STAT3-Signalisierung, Bcl-2 und Bax-Expression, die möglichen Mechanismen zu erforschen, dieses Phänomen zu Grunde liegen. Ferner untersuchten wir die Expression von AFP und STAT3 durch Immunhistochemie in menschlichen Magenkrebsproben. Das Herunterregulieren AFP und STAT3 Ausdruck beigetragen Als 2 O 3-induzierte Apoptose und Hemmung der Proliferation in AFPGC.}

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Die Studienprotokoll wurde von der Ethik in der Medizin andHuman Clinical Trial Ausschuss des Jinan Central Hospital genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten.

Cell Culture and Drug Treatment

Die menschliche Zelllinie AFPGC FU97 aus der japanischen Sammlung von Forschung Bioresources erhalten (Japan) und wurde in DMEM ( Invitrogen) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS;. Invitrogen), das mit 1% Antibiotika bei 37 ° C in 5% CO _{2 befeuchtete Luft}

_{2 O 3 ( Sigma) wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 1 mol /L als eine Stammlösung und gelagert bei 4 ° C gelöst. Für In-vitro-
Verwendung wurde die Stammlösung ohne FBS auf die geeignete Konzentration in einem Wachstumsmedium verdünnt. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit As 2 O 3 bei Endkonzentrationen von 1, 5 oder 10 &mgr; mol /l behandelt. Kontrollkulturen wurden mit destilliertem PBS bei einer Endkonzentration von 0,1% in Kulturmedium behandelt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.}

MTT Zytotoxizitätstest

Die Wirkung von As _{2 O 3 auf die Hemmung In-vitro-
Wachstum von FU97 Zellen bestimmt durch Messen MTT (3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) Farbstoff Absorption von lebenden Zellen. FU97-Zellen wurden in 96-well Platten ausgesät bei 1,6 × 10 ^{3 Zellen pro Vertiefung in 100 ul DMEM über Nacht 10% FBS enthielt. Nach der Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen an As 2 O 3 für 24, 48 und 72 h, 20 &mgr; l (5 g /L) MTT (Sigma, St. Louis, MO) wurde in jede Vertiefung und die Platten wurden hinzugefügt bei 37 ° C für weitere 4 h inkubiert. Formazin wurde in 150 &mgr; l /Vertiefung Dimethylsulfoxid (DMSO) und die Extinktion gelöst wurde bei 490 nm detektiert. Hemmungsrate (%) = (1-A-Wert in der experimentellen Gruppe /A-Wert in der Kontrollgruppe) × 100%. Die 0 &mgr; mol /L Gruppe als Leerkontrolle verwendet wurde.}}

DNA-Fragmentation Analyse durch Elektrophorese

Insgesamt 10 ^{6 Zellen sanft von den Tellern gekratzt wurde, zweimal in kaltem PBS, und bei 15000 rpm für 10 min zentrifugiert, anschließend lysiert, in 200 &mgr; l Lyse-Puffer (1 ml von 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], 0,5 ml 10% Triton X-100 ). Lysierten Zellen wurden für 10 min bei 4 ° C gehalten, und die Überstände wurden inkubiert mit 2 ul RNase A (10 mg /mL in Tris-EDTA-Puffer) bei 50 ° C für 30 min, dann mit 2 &mgr; l Proteinase K (10 mg /ml in destilliertem Wasser) für 45 min bei 50 ° C. Die Lösung wurde mit 5 M NaCl gemischt (20 &mgr; l) und 2-propanol (120 &mgr; l) für 24 h bei 20 ° C inkubiert, dann 20 min bei 15000 rpm zentrifugiert. Die ausgefällte DNA wurde in Tris-EDTA (5 &mgr; l) Puffer und unterzog Elektrophorese mit 2% Agarosegel und Tris-Acetat-EDTA-Puffer bei 50 V. Die DNA Fragmentierungsmuster unter Verwendung eines UV-Transilluminator sichtbar gemacht wurde, gelöst.}

Hoechst 33258 Färbung Analyse von Zell-Apoptose

die Zellen auf den Glasdeckgläschen gezüchtet mit 4% Paraformaldehyd fixiert wurden /PBS für 30 Minuten, gewaschen 15 min in 0,1% Triton X-100 /PBS und inkubiert in der Dunkelheit mit Hoechst 33258 (10 ug /ml) für 15 min. Nachdem die Deckgläschen in PBS gewaschen wurden, wurden positive Kerne gezählt. Normale Kerne und apoptotische Kerne (verkürzte oder fragmentierten Chromatin) waren leicht zu unterscheiden.

Quantitative Real-time PCR

Zellen mit As kultiviert _{2 O 3 (5 mmol /L ) für 72 h. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) quantifiziert und durch Spektrophotometrie extrahiert. Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung von Zufallsprimern nach den Anweisungen Kit (Takara, Japan) hergestellt. Quantitative Echtzeit-PCR von AFP, STAT3 und seinem stromabwärtigen Gene beteiligt, die 7300 in Echtzeit PCR-System (ABI, USA) mit SYBR Takara Ex Taq Premix Reagenzien (Takara, Japan). Primer wurden von Invitrogen entwickelt und validiert. Der Primer Informationen ist in Tabelle 1 PCR-Reaktionen wurden bei 94 ° C, in dreifacher Ausführung in einer 20-ul-Volumen von 30 Zyklen gefolgt für die anfängliche Denaturierung für 2 min durchgeführt bei 94 ° C für 30 s und bei 60 ° C für 45 s. Ein Reinigungskontrollgens GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Jedes Primersatz wurde zuerst optimalen Konzentrationen zu bestimmen, getestet, und die Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel laufen gelassen, um die entsprechende Größe zu bestätigen. Anschließend wurde ABI Dissoziationskurve Software zur Steuerung für mehrere Arten in jeder PCR-Amplifikation verwendet. cDNA aus FU97 Zellen ohne As 2 O 3 Behandlung verwendet wurde, für jedes Gen eine Standardkurve zu konstruieren.}

Western-Blot-Analyse

Die Zellpellets wurden in Extraktionspuffer homogenisiert (50 mmol /L Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 150 &mgr; mol /L NaCl, 100 mg /l Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mg /l Aprotinin, 1% NP-40 und 0,5% Natriumorthovanadat), inkubiert bei 4 ° C 30 min und 20 min bei 12 000 g /min zentrifugiert. Gesamtprotein in dem Zelllysat wurde unter Verwendung des Bio-Rad kolorimetrischen Kits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemessen. Für Western-Blot-Analyse wurde auf 10% SDS-PAGE Gesamtprotein trennt und auf Nitrocellulosemembranen (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), die mit den Antikörpern für AFP bei 4 ° C für 24 h inkubiert wurden (1 :500, R & D), STAT3 (1:1000), Caspase 3 (1:500), Bcl-2 (1:500), BAX (1:500) und GAPDH (1:1000, alle Cell Signaling Technology) dann Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus /Kaninchen-IgG-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology) nach einer letzten Waschung. Reaktionen wurden unter Verwendung von 4-Chlor-1-naphthol (Sigma) und H _{2 O 2 entwickelt. Signale wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Kits (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK) nachgewiesen. GAPDH Ebene war ein interner Standard.}

Immunoassay von AFP-Konzentration in Supernatant

Der Überstand von FU97-Zellen wurden nach der Behandlung gesammelt mit As _{2 O 3 oder negative Kontrolle für 24, 48 und 72 h.AFP Konzentration im Überstand wurde durch zwei-Ort Immunoenzyme Test in einem TOSOH AIA-System (Japan) bestimmt. Der cut-off Wert für AFP betrug 10 ng /ml.}

Patienten

Wir untersuchten Daten aus chirurgischen und pathologischen Aufzeichnungen für 24 Patienten mit AFPGC und 24 zufällig ausgewählten Patienten mit normalen Serum-AFP und abgestimmt Patienten von Magenkrebs im Stadium zu AFPGC. Die Patienten waren ab Januar 1996 die chirurgische Resektion am Clinical Hospital of Shandong University, China, unterzogen bis Dezember 2011 AFPGC Patienten erhöhte Serum-AFP-Ebene zeigte aber keine gleichzeitige Lebererkrankungen. Die histopathologische Anwesenheit von AFP-Positivität wurde durch Immunhistochemie bestätigt. Wir setzten uns mit jedem Patienten das Überleben oder das Datum des Todes zu bestätigen.

Immunhistochemie

Immunhistochemie beteiligt Verwendung von Biotin-Streptavidin-Peroxidase mit einem Vectastain ABC-Kit (Vector Laboratories, CA, USA). Kurz gesagt, wurden aus in Paraffin eingebetteten Proben Gewebe hergestellten Gewebeschnitte (4 mm). Die Schnitte wurden mit Xylol gefolgt von Dehydratisierung in abgestuften Alkohol entparaffiniert. Die Schnitte wurden in einer Mikrowelle für 2 min bei 900 W erhitzt, um das Antigen, abzurufen und dann mit 0,3% H _{2 O 2 -Lösung in Methanol inkubiert für 30 min endogene Peroxidase zu blockieren. Nach 3 Waschungen mit phosphatebuffered Kochsalzlösung (PBS), Objektträger mit 10% normalem Pferdeserum inkubiert wurden unspezifische Hintergrundfärbung zu blockieren, dann mit primären Antikörpern Kaninchen (1:100 Verdünnung) und Anti-STAT3 (1:200) anti-AFP inkubiert in eine feuchte Kammer bei 4 ° C über Nacht. Nach einem Waschen mit PBS gewaschen, für 30 min wurden die Schnitte 3 Mal mit PBS mit biotinyliertem Pferd-anti-Maus-Antikörper inkubiert und mit Streptavidin-konjugierter Peroxidase für 30 min inkubiert. Die Schnitte wurden durch Inkubation sichtbar gemacht mit 3, 3'-Diaminobenzidin-Lösung (0,3% H 2 O 2 und 0,05% 3, 3'-Diaminobenzidin) und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Weglassen des primären Antikörpers war eine negative Kontrolle. Jeder Lauf enthalten eine positive Kontrolle und eine negative Kontrolle. Für die negative Kontrolle wurde der primäre Antikörper mit PBS ersetzt.}

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und wurden durch die Verwendung von SPSS v11.5 (SPSS Inc., Chicago analysiert , IL, USA). Der Verband der klinisch-pathologische Variablen und AFP und STAT3-Expression wurde durch Chi-Quadrat-Test bestimmt und die Korrektur des Yate wurde in einer kleinen Anzahl von Proben angewendet. Chi-Quadrat-Test oder zweiseitigen Student t
Test zur Beurteilung der Unterschiede zwischen den Gruppen verwendet wurde. Die Analyse des Überlebens ging es um die Log-Rank-Test, mit Kaplan-Meier-Kurven. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: microRNA-9 Unterdrückt die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebszellen durch Targeting Cyclin D1 und Ets1
• PLoS ONE: A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Technologie Identifiziert Heterogene Activated Signaling Pathways in Gastric Cancers