PLoS ONE: microRNA-9 Unterdrückt die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebszellen durch Targeting Cyclin D1 und Ets1

Abstrakt

Neue Erkenntnisse zeigen, dass veränderte microRNA-9 (miR-9) Ausdruck in Verbindung gebracht wird, das Fortschreiten von Magenkrebs. Allerdings bleiben die genauen Rollen und die zugrunde liegenden Mechanismen der miR-9 bei der Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebs noch unbekannt. In dieser Studie wurde miR-9 werden herunterreguliert und umgekehrt korreliert mit der Expression von Cyclin D1 und V-ets Erythroblastosis Virus E26 Onkogen Homolog 1 (Ets1) bei Magenkrebs Geweben und Zelllinien. Bioinformatik-Analyse ergab die putative miR-9-Bindungsstellen in der 3'-nicht-translatierten Bereichen (3'- UTR) von Cyclin D1 und Ets1 mRNA. Die ektopische Expression oder Zuschlags von miR-9 führte in Reaktion darauf eine veränderte Expression von Cyclin D1, Ets1 und ihre Downstream-Ziele phosphoryliert Retinoblastom und Matrix-Metalloproteinase 9 in kultivierten Magenkrebszelllinien SGC-7901 und AGS. In der Luciferase-Reportersystem, gezielte miR-9 direkt die 3'-UTR von Cyclin D1 und Ets1, und diese Effekte wurden durch Mutieren der miR-9-Bindungsstellen abgeschafft. Überexpression von miR-9 unterdrückt die Proliferation, Invasion und Metastasierung von SGC-7901 und AGS-Zellen In-vitro-
und in vivo
. Wiederherstellung von miR-9-vermittelter Herabregulierung von Cyclin D1 und Ets1 durch transiente Transfektion rettete die Krebszellen von Abnahme der Proliferation, Migration und Invasion. Darüber hinaus förderte anti-miR-9-Inhibitor der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen, während Klopfen nach unten von Cyclin D1 oder Ets1 teilweise die Auswirkungen von miR-9-Überexpression phenocopied. Diese Daten zeigen, dass miR-9, um die Expression von Cyclin D1 und Ets1 über die Bindungsstellen in ihren 3'-UTR unterdrückt, wodurch die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebs Hemmung

Citation:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X et al. (2013) microRNA-9 Unterdrückt die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebszellen durch Cyclin-D1-Targeting und Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10.1371 /journal.pone.0055719

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile

Empfangen: 14. September 2012; Akzeptiert: 29. Dezember 2012; Veröffentlicht: 31. Januar 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Nr 30600278, Nr 30772359, Nr 81071997, Nr 81072073, Nr 81272779), Programm für New Century Ausgezeichnete Talente in University (NCET-06-0641), Scientific Research Foundation für die Returned Overseas Chinese Wissenschaftler (2008-889) und Grundlagenforschung Fonds für die Zentral Universitäten (2012QN224). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebs in der Welt [1]. Trotz der Verbesserung der chirurgischen und multimodale Therapie, die Prognose von fortgeschrittenem Magenkrebs bleibt immer noch schlecht aufgrund der Wiederholung, Invasion und Metastasierung, mit einem 5-Jahres-Überlebensrate unter 30% [1]. Eine bessere Kenntnis der Mechanismen der Tumorprogression zu Grunde liegende gerechtfertigt neue Paradigmen für die Diagnose und Behandlung von Magenkrebs [2] zu entdecken. MicroRNAs (miRNAs), eine vor kurzem identifizierte Kategorie kleiner und hoch konservierte nichtkodierenden RNAs können in der post-transkriptionalen Regulation der Genexpression durch komplementäre Teil teilnehmen mit der 3'-nicht-translatierten Bereichen (3'- UTR) von Ziel-mRNA bindet, was zu translationale Repression oder mRNA-Abbau [3]. Beweise Schwellen zeigt, dass miRNAs in den biologischen Prozessen im Zusammenhang mit der Apoptose, Proliferation, Differenzierung, Invasion und Metastasierung beteiligt sind, während die Deregulierung von denen Krebs Initiierung und Progression von entscheidender Bedeutung ist [3]. Es ist derzeit dringend die Rollen von miRNAs und ihre Zielgene in Tumorprogression von Versuchsmodellen zu untersuchen.

In menschlichen Magenkrebs, eine Reihe von miRNAs sein aberrant überexprimiert berichtet wurden oder herunterreguliert während die Progression von Magenkrebs, einschließlich miR-21 [4], miR-15b [5], miR-16 [5], und miR-101 [6]. Diese miRNAs spielen onkogenen oder tumorunterdrückende Rolle in der Regulation des Zellwachstums, Migration und Invasion durch ihre Zielgene unterdrücken. Zum Beispiel ist onkogenen miR-21 aberrant in Magenkrebs überexprimiert, und fördert die Proliferation und Invasivität von Magenkrebszellen durch Targeting Reversion induzierenden cysteinreichen Protein mit Kazal Motive [4]. Inzwischen sind miR-15b und miR-16 herunterreguliert bei Magenkrebs, und über Targeting-B-Zell-Leukämie /Lymphom 2 [5], um multidrug resistance von Magenkrebszellen durch Modulation der Apoptose beitragen. miR-101 ist herunterreguliert in Magenkrebsgewebe und Zelllinien, während die ektopische Expression von miR-101 hemmt signifikant die Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch Enhancer von Zeste homolog Targeting 2, Cytochrom c Oxidase Untereinheit II und myeloische Zell-Leukämie-Sequenz 1 [6]. Daher ist es ein Schwerpunkt war weiter die Expression und Funktion der miRNA in der Tumorbiologie von Magenkrebs zu erkunden.

MicroRNA-9 (miR-9) zunächst als einer der entscheidenden Regler für die Entwicklung identifiziert , Physiologie und Pathologie des Nervensystems bei verschiedenen Organismen, einschließlich Drosophila
, Zebrabärbling und Säugetiere [7] - [9]. Eine Reihe von nachfolgenden Studien haben gezeigt, dass veränderte miR-9-Expression mit der Entwicklung und Progression von Krebs assoziiert ist [10] - [14]. Frühere Studien zeigen, dass miR-9 signifikant herunterreguliert in Magenkrebs, seine potentiellen Rollen in der Tumorprogression impliziert [15] - [18]. Es wird auch darauf hingewiesen, dass miR-9 kann über Targeting den Schwanz Typ homeobox 2 (CDX2) [19] und NF-kappa B (NF-kappaB) [16], um die Proliferation von Magenkrebszellen modulieren. Allerdings garantiert die genaue Funktion und die zugrunde liegenden Mechanismen der miR-9 in der Progression von Magenkrebs noch weitere Untersuchungen. In dieser Studie zeigen wir, zum ersten Mal, dass miR-9 direkt Cyclin D1 und V-ets Erythroblastosis Virus E26 Onkogen Homolog 1 (Ets1) ausgerichtet ist, und unterdrückt die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebszellen in vitro
und in vivo
.

Ergebnisse |

miR-9 war herunterreguliert und umgekehrt mit der Expression von Cyclin D1 und Ets1 bei Magenkrebs Gewebe korreliert und Zelllinien

Um die miR-9-Expression in Magenkrebs, Magenkrebs Gewebe und benachbarten nicht-neoplastische Schleimhaut zu untersuchen wurden aus 86 primären Fälle gesammelt. Echtzeit-quantitative reverse Transkription PCR (RT-PCR) ergab, dass miR-9 wurde herunterreguliert in Magenkrebsgeweben als in benachbarten, nicht-neoplastische Schleimhaut ( P
= 0,001, Abb. 1A). Die miR-9-Expression war signifikant niedriger bei Magenkrebs Fälle mit tiefer Magenwand Invasion ( P
< 0,001), Lymphknotenmetastasen ( P
< 0,001), Fernmetastasen ( P
= 0,022) und erweiterte TNM-Stadium ( P
= 0,01) (Tabelle S1). Im Gegensatz dazu höher Cyclin D1 und Ets1 Transkript-Spiegel wurden in Magenkrebsgewebe ( P
< 0,0001 und P
<.. 0,0001 bzw. 1B und 1C) nachgewiesen. Es gab eine inverse Korrelation zwischen miR-9-Expression und Cyclin D1 Transkriptspiegel bei Magenkrebs Gewebe ( P
. ≪ 0,001, 1D). Zusätzlich wurde eine inverse Korrelation zwischen miR-9-Expression und Ets1 Transkriptniveaus auch in diesen Krebsgewebe festgestellt ( P
. ≪ 0,001, Fig 1E). Lower miR-9-Expression und höhere Transkriptspiegel von Cyclin D1 und Ets1 wurden in Magenkrebs-Zelllinien als die in normalen Magenepithelzellen GES-1-Zellen [20] (Abb. 1F) beobachtet. Immunhistochemische Färbung wurde durchgeführt, um die Expression von Cyclin D1 und Ets1 in dieser Krebsproben (Fig. S1) zu beobachten. Nuclear Cyclin D1 wurde in 26/86 (30,2%) Fälle, während Kern- und Zytoplasma-Färbung von Ets1 bemerkt wurde in 58/86 (67,4%) Fälle (Tabelle S1) beobachtet. Die Immunreaktivität von Cyclin D1 und Ets1 war signifikant höher bei Magenkrebs Fälle mit tiefer Magenwand Invasion ( P
< 0,001 und P
= 0,001), Lymphknotenmetastasen ( P
< 0,001 und P
< 0,001), Fernmetastasen ( P
< 0,001 und P
< 0,001) und erweiterte TNM-Stadium ( P
< 0,001 und P
= 0,004) (Tabelle S1). Lower miR-9-Expression wurde in Magenkrebsgewebe mit höherer Immunfärbung von Cyclin D1 ( P
< 0,0001, Abb 1G.) Beobachtet oder Ets1 ( P
. ≪ 0,0001, Abb 1H ). Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-9 wurde nach unten reguliert und umgekehrt mit der Expression von Cyclin D1 und Ets1 bei Magenkrebs Geweben und Zelllinien korreliert.

miR-9 nach unten reguliert die Expression von Cyclin D1 und Ets1 durch Post -transcriptional Repression

Um die Hypothese zu untersuchen, dass miR-9 kann die Expression von Cyclin D1 und Ets1 bei Magenkrebs beeinflussen, rechnerische Vorhersage wurde von miRNA-Datenbanken durchgeführt. Mögliche Bindungsstellen von miR-9 mit einer hohen Komplementarität wurden 2974-2995 des Cyclin D1 3'-UTR und 2648-2670 der Ets1 3'-UTR an den Basen festgestellt (Abb. 2A). Um die direkten Auswirkungen von miR-9 auf der Expression von Cyclin D1 und Ets1 in Magenkrebszellen zu untersuchen, führten wir die miRNA-Überexpression Experimente. Stabile Transfektion von miR-9-Vorläufers in SGC-7901 und AGS-Zellen führte zu einer Erhöhung der miR-9 Stufen (Abb. S2). Western-Blot, RT-PCR und Echtzeit-quantitative RT-PCR gezeigt, dass Überexpression von miR-9 führte zu einer verringerten Protein- und Transkriptionsniveaus von Cyclin D1 und Ets1 in Magenkrebszellen als solche, transfiziert mit negativen Kontrollvektor (mock) ( Fig. 2B, Fig. 2C und Fig. 2D). Außerdem sind die Mengen an phosphoryliertem Retinoblastom (pRB, ein nachgeschalteter Effektor von Cyclin D1) [21] und der Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9, ein nachgeschalteter Gen von Ets1) [22] wurden in miR-9-überexprimierenden Krebszellen verringert (Fig. 2B, Fig. 2C und Fig. 2D). Um die suppressive Rolle von miR-9 in der Expression von Cyclin D1 und Ets1 untersuchen, führten wir die miR-9 Zuschlags Experimente durch Transfektion von anti-miR-9 oder Negativkontrolle (anti-NC) -Inhibitoren in GES-1, SGC -7901 und AGS-Zellen. Transfektion von anti-miR-9-Inhibitor verringert offensichtlich die endogene miR-9-Expression (Fig. S3A) und nach oben reguliert die Proteinspiegel von Cyclin D1, pRB, Ets1 und MMP-9 als diejenigen, transfiziert mit anti-NC (Fig. 2E und Abb. S4A). Real-time quantitative RT-PCR-Analysen die erweiterten Transkriptmengen von Cyclin D1, Ets1 und MMP-9 in kultivierten Zellen, die mit anti-miR-9-Inhibitor zeigten, im Vergleich zu denen, transfiziert mit anti-NC (Fig. 2F und Fig. S4B). Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass miR-9 deutlich die Expression von Cyclin D1 und Ets1 durch post-Transkriptionsrepression gehemmt.

miR-9 direkt gezielte Cyclin D1 und Ets1 in Magenkrebszellen

festzustellen, ob miR-9 könnte reprimieren wurden die Expression von Cyclin D1 und Ets1 indem sie auf ihre Bindungsstellen in der 3'-UTR, die PCR-Produkte enthalten, intakte Zielstellen oder Mutation von miR-9 seed Erkennungssequenzen (Fig. 3A), der in die Luciferase-Reportervektor. Die Plasmide wurden in Magenkrebszellen transfiziert stabil mit negativen Kontrollvektor (mock) transfiziert oder miR-9-Vorläufer. Das Renilla
Luciferase-Aktivitäten normiert auf die von firefly signifikant reduziert in SGC-7901 und AGS-Zellen stabil transfiziert mit miR-9-Vorläufers (Fig. 3B), und diese Wirkungen wurden durch Mutieren der putative abgeschafft miR-9 Bindungsstellen innerhalb der 3'-UTR von Cyclin D1 und Ets1 (Fig. 3B). Darüber hinaus Zuschlags von miR-9 mit anti-miR-9-Inhibitor die Luciferase-Aktivitäten in GES-1 erhöht, SGC-7901 und AGS-Zellen (Abb. 3C und Fig. S4C), während die Mutation von miR-9-Erkennungsstelle abgeschafft diese Effekte (Fig. 3C und Fig. S4C). Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-9 unmittelbar und spezifisch mit den Zielorten in der 3'-UTR von Cyclin D1 und Ets1 interagierten.

miR-9 unterdrückt die In-vitro-
Proliferation von Magenkrebs Zellen, die durch Cyclin D1
Targeting

Da oben Beweise zeigten, dass miR-9 die Cyclin D1-Expression und die Kombination der Tatsachen, die gehemmt D1 spielt eine kritische Rolle bei der Zellzyklusprogression und die Proliferation von Krebszellen [21] Cyclin, untersuchten wir die Wirkungen von miR-9-über~~POS=TRUNC und Zielgen Restauration an kultivierten Magenkrebszellen. Western-Blot und quantitative Echtzeit-RT-PCR zeigten, dass die Transfektion von Cyclin D1, aber nicht von Ets1 rettete die miR-9-induzierte Herunterregulation von Cyclin D1 (Fig. 4A und Fig. 4B). In Koloniebildungstest, abgeschwächte miR-9-Überexpression das Wachstum von SGC-7901 und AGS-Zellen, wenn im Vergleich zu denen, transfiziert mit negativen Kontrollvektor (Mock) (Abb. 4C). Durchfluss-Zytometrie angedeutet, dass miR-9-Überexpression induzierten Zellzyklusarrest bei G _{0 /G 1 Phase in SGC-7901 und AGS-Zellen (Abb. 4D). Zusätzlich Transfektion von Cyclin D1, aber nicht von Ets1 in SGC-7901 und AGS Zellen wiederhergestellt die Proliferationshemmung und Zellzyklus-Arrest induziert durch Überexpression von miR-9 (Fig. 4C und Fig. 4D). Auf der anderen Seite, untersuchten wir die Auswirkungen von miR-9 Zuschlags auf GES-1, SGC-7901 und AGS-Zellen. Einführung von Anti-miR-9-Inhibitor in diese Zellen zu einer verstärkten Fähigkeiten der Proliferation (Abb. S3B) und des Zellzyklus (Abb. S3C). Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-9 bemerkenswert die In-vitro-
Proliferation und Zellzyklusprogression von Magenkrebszellen durch Targeting Cyclin D1 unterdrückt.}

miR-9 abgeschwächt die in vitro
Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch Ets1
Targeting

Da frühere Studien die wichtige Rolle von Ets1 bei der Invasion und Metastasierung von Krebszellen zeigen [23], [24], untersuchten wir die Wirkungen von Mir- 9 über~~POS=TRUNC und Zielgen Wiederherstellung auf die Migration und Invasion von Magenkrebs SGC-7901 und AGS-Zellen. Western-Blot und quantitative Echtzeit-RT-PCR zeigte, dass die Transfektion von Ets1, aber nicht von Cyclin D1, rettete die miR-9-induzierte Herunterregulation von Ets1 (Abb. 5A und Fig. 5B). In Transwell-Migrationstest stellte Magenkrebszellen, stabil transfiziert mit miR-9 Vorläufers eine verschlechterte Migrationsfähigkeit als diejenigen, transfiziert mit negativen Kontrollvektor (mock) (Fig. 5C). In Matrigel Invasionstest, miR-9-Überexpression einer Abschwächung der Invasivität von SGC-7901 und AGS-Zellen (Abb. 5D). Darüber hinaus Transfektion von Ets1, aber nicht von Cyclin D1, in SGC-7901 und AGS Zelllinien wieder die miR-9-meditaed Hemmung auf die Migration und Invasion (Abb. 5C und Fig. 5D). Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkungen von miR-9 Zuschlags auf GES-1, SGC-7901 und AGS-Zellen. Die Transfektion von anti-miR-9-Inhibitor zu einer verstärkten Migration und Invasion dieser Zellen (Abb. S3D und Abb. S3E). Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-9 bemerkenswert das abgeschwächte in vitro
Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch Targeting Ets1.

miR-9 abgeschwächt, das Wachstum und die Metastasierung von Magenkrebszellen in vivo

Wir haben die Wirksamkeit von miR-9 weiter untersucht gegen Tumorwachstum und Metastasierung in vivo
. Stabile Transfektion von miR-9-Vorläufers in SGC-7901 oder AGS-Zellen führte zu einer verringerten Wachstum und Gewichts subkutane Xenograft-Tumoren in athymischen Nacktmäusen, bei denen im Vergleich stabil transfiziert mit negativen Kontrollvektor (mock) (Fig. 6A und Fig. 6B ). Darüber hinaus wurde die Expression von Cyclin D1, Ets1 und Downstream MMP-9 reduziert durch stabile Transfektion von miR-9-Vorläufers (Fig. 6C). Der CD31-positive mittlere Gefäßdichte wurde innerhalb von Tumoren durch Injektion von Krebszellen stabil mit miR-9-Vorläufer (Fig. 6D) gebildet wird, reduziert. In den experimentellen Metastasierung Studien, SGC-7901 oder AGS-Zellen stabil mit miR-9 Vorläufer etabliert statistisch weniger Lunge Metastasen Kolonien transfiziert als Mock-Gruppe (Abb. 6E). Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-9, um das Wachstum und die Metastasierung von Magenkrebszellen gehemmt in vivo
.

Preissturz von Cyclin D1 und Ets1 phenocopied miR-9-Überexpression vermittelte Hemmung auf die Proliferation , Migration und Invasion von Magenkrebszellen in vitro

Da obigen Ergebnisse die negativen Regulation von Cyclin D1 und Ets1 Expression von miR-9 angegeben ist, wir diese Zuschlags von Cyclin D1 und Ets1 Hypothese könnte üben ähnliche Wirkungen auf kultivierte Magenkrebszellen. Die small interfering RNAs (siRNAs), um die kodierende Region von Cyclin D1 und Ets1, si-CCND1 und si-Ets1 Targeting, wurden in SGC-7901 und AGS-Zellen entwickelt und transfiziert. Die Transfektion von si-CCND1 und si-Ets1 führte verringerte sich in Expression von Cyclin D1, pRB, Ets1 und MMP-9 in Magenkrebszellen, die jeweils im Vergleich zu denjenigen, transfiziert mit Scramble-siRNA (si-SCB) (Abb. 7A, Fig . 7D und Fig. S5). Preissturz von Cyclin D1 unterdrückt die Proliferation und induziert Zellzyklusarrest bei G _{0 /G 1 Phase in SGC-7901 und AGS-Zellen (Abb. 7B und Fig. 7C). Darüber hinaus Zuschlags von Ets1 in SGC-7901 und AGS-Zellen führte zu einer verminderten Fähigkeiten von Migration und Invasion (Abb. 7E und Abb. 7F). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zuschlags von Cyclin D1 und Ets1 phenocopied (die ähnliche Phänotypen besessen) miR-9-Überexpression bei der Hemmung der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen In-vitro-
.}

Diskussion

Es hat sich etabliert, dass die miR-9-Expressionsprofil in der Krebstherapie auf Gewebeverteilung beruht. In primären Hirntumoren ist miR-9 erhöht und Funktionen als ein wesentlicher Faktor in der neuralen Karzinogenese [10]. miR-9 ist auch in Gebärmutterhalskrebs überexprimiert [11], dessen Tumor-Promotor Rolle bei der Tumorentstehung und Progression hindeutet. Allerdings ist miR-9 in mehreren menschlichen Krebs-down-reguliert, einschließlich Bauchspeicheldrüsenkrebs [12], Ovarialkarzinom [13] und Darmkrebs [14], und ist mit der malignen Progression von Brustkrebs [25] und Darmkrebs ( 14). Luo et al.
Verwies auf die Herabregulation von miR-9 in 24 Magenkrebs-Proben [15], die anschließend in 9 [16] bestätigt wurde, 72 [17] und 13 [18] Magenkrebs Fälle. Allerdings Inoue et al.
Die Hochregulation von miR-9 berichtet in fünf Patienten mit Magenkrebs durch real-time PCR-basierte miRNA Arrays [26], und diese andere Erkenntnis in miR-9-Expressionsprofil kann aufgrund auf die Heterogenität der begrenzten Proben. In dieser Studie zeigen wir, dass miR-9 in 86 primären Magenkrebs Proben deutlich herunterreguliert ist als in benachbarten, nicht-neoplastischen Geweben, die mit früheren Ergebnissen konsistent ist [15] - [18]. Wichtig ist, bestätigen wir auch, dass miR-9-Expression invers mit den klinischen Phasen, Invasion und Metastasierung von Magenkrebs assoziiert ist. Beim Menschen wird die reife miR-9 von drei unabhängigen Genen codiert, miR-9-1, miR-9-2 und miR-9-3, Ortung auf den Chromosomen 1, 5 bzw. 15 [27]. Frühere Studien zeigen, dass die nach unten reguliert miR-9-Expression in Magenkrebs ist aufgrund aberrante Hypermethylierung der Promotorregion von miR-9 kodierenden Gene [17]. In ähnlicher Weise wird anomale Hyper von miR-9 Familie Gene auch in einigen primären Tumoren mit Lymphknotenmetastasen, wie Darmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs und Melanomen [14], berichtet [28]. Wichtig ist, dass die aktuelle Studie berichtet, die inverse Korrelation zwischen miR-9 Ebenen und die Expression von Cyclin D1 und Ets1 bei Magenkrebs Gewebe, was bedeutet, dass Cyclin D1 und Ets1 kann negativ durch miR-9 geregelt werden.

Die Funktion und Zielgene von miR-9 sind tumorspezifische und abhängig von zellulären Kontext. miR-9 in der Lage, E-Cadherin-Expression in Brustkrebs [29], wodurch die nukleäre Translokation von β-Catenin und seinen Bindungs ​​mit Transkriptionsfaktoren T-Zell-Faktor /lymphoide Enhancer-Faktor 1 ist, und anschließende hochreguliert Transkription zu unterdrücken, Gene, die die Zellproliferation und Angiogenese [29] zu erleichtern. Zwangs miR-9-Expression in Brustkrebs-Zelllinien führt auch zu signifikanten Veränderungen Expression multipler Gene in dem p53-bezogenen apoptotischen Weg [30]. Durch die direkte Targeting NF-kappaB, ektopische Expression von miR-9 hemmt die In-vitro-
und in vivo
Wachstum von Eierstockkrebszellen [31] und das Wachstum und die Metastasierung von Melanomen [32] . In neuroblatoma Überexpression von miR-9 hemmt die Invasion, Metastasierung und Angiogenese von Tumorzellen durch Matrix-Metalloproteinase-Targeting-14 [33]. Wan et al.
Berichtet, dass eine Überexpression von miR-9 die gehemmt In-vitro-
und in vivo
Wachstum von Magen-Adenokarzinom-Zelllinie MGC803 durch Unterdrückung von NF-kappaB bei der Post-Transkriptionsebene [16]. Doch in einer aktuellen Studie, Rotkrua et al.
Darauf hingewiesen, dass miR-9 könnte in Magen Karzinogenese durch Herunterregulieren CDX2 und Zuschlags von miR-9 verringerte sich die in vitro beteiligt sein
Proliferation von Magenkrebs MKN-45-Zellen [19], während ihre Ergebnisse müssen weiter mit miR-9-über~~POS=TRUNC, Zielgen Rettung gestärkt werden, und in-vivo-Studien
. Außerdem ist es derzeit umstritten, ob CDX2 spielt eine onkogene oder Tumorsuppressor-Rolle in der Karzinogenese Magen [34], [35]. Darüber hinaus haben die potentielle Rolle von miR-9 bei der Invasion und Metastasierung von Magenkrebs bisher nicht aufgeklärt worden. Somit werden die Funktion und direkte Ziele von miR-9 bei Magenkrebs rechtfertigen weitere Untersuchungen.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Überexpression von miR-9, die Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen abgeschwächt, das war ähnlich der von Cyclin D1 oder Ets1 Zuschlags, die potentielle Anwendung von miR-9 als ein Ziel für die Therapie von Magenkrebs schließen lässt. Darüber hinaus bestätigte unsere Daten, dass miR-9 Cyclin D1 und Ets1 in Magenkrebszellen durch 3'-UTR-Luciferase-Reporterassay direkt angegriffen. Seit den letzten Beweise zeigen, dass bestimmte miRNAs alternativ Genexpression durch Wechselwirkung mit Promotoren modulieren kann [36] - [38], die möglichen Rollen von miR-9 in der Transkription von Cyclin D1 und Ets1 Regulierung durch mit Promotoren in Wechselwirkung unklar bleiben und rechtfertigen unsere weitere Untersuchung. Cyclin D1 ist ein Proto-Onkogen, das zu der Familie der G gehört _{1 Cycline, und spielt eine wichtige Rolle in der Zellzyklus-G 1 bis S-Übergang von ihrer Partner cyclin dependent kinase 4 Bindung und 6 zu phosphorylieren und inaktivieren das RB-Protein [21]. Die Überexpression von Cyclin D1 ein frühes Ereignis in der Karzinogenese in menschlichen Darm-, Speiseröhren- und Gallenblase Krebserkrankungen [39] und ist ein prognostischer Indikator mit schlechten Überleben in der Speiseröhre verbunden sind, Brust- und Urin-Krebs [39]. Cyclin-D1-Überexpression in menschlichen Krebserkrankungen wird durch mehrere Mechanismen aufgeklärt, einschließlich genomischer Veränderungen, post-Transkriptionsregulation, und post-translationalen Proteinstabilisierung [39]. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass miR-16-1 reprimiert Cyclin D1-Expression auf der post-transkriptioneller Ebene über die Bindung seiner 3'-UTR in Mantelzell-Lymphom [40]. In der vorliegenden Studie haben unsere Ergebnisse zeigten, dass miR-9-vermittelte Hemmung auf die Zellzyklusprogression und Zellproliferation durch Wiederherstellung von Cyclin D1-Expression in Magenkrebszellen gerettet wurde, was darauf hindeutet, dass die Identifizierung von Cyclin D1 als miR-9 Zielgen, mag erklären, zumindest teilweise, warum die über~~POS=TRUNC von miR-9 unterdrückt, die Proliferation von Magenkrebszellen.}

Ets1, ein Mitglied der ETS-Familie von Transkriptionsfaktoren, bindet an spezifische DNA-Sequenzen, die eine GGAA enthält /T Kernmotiv [22], und beteiligt sich an der Tumorinvasion und Metastasierung durch transkriptionalen Regulation mehrerer Gene, die für extrazelluläre Matrixumbau, Migration und Invasion, wie beispielsweise Matrix-Metalloproteinase und Urokinase-Plasminogen-Aktivator [22]. Bis heute haben eine zunehmende Anzahl von klinischen Studien die wichtige Rolle von Ets1 in Tumor Entwicklung und Progression von verschiedenen soliden Tumoren gezeigt [23], [24]. Frühere Studien zeigen, dass Ets1 Expression auf die klinisch-pathologischen Eigenschaften von Magenkrebs bezieht, einschließlich Tumorinfiltration und Lymphknoten oder entfernten Metastasen, seine kritische Rolle bei der Invasion und Metastasierung von Magenkrebs vorgeschlagen [41]. Allerdings bleibt die Mechanismen, die Ets1 Überexpression bei Magenkrebs zugrunde liegen noch weitgehend unbekannt. Jüngste Studien zeigen, die post-Transkriptionsregulation von Ets1 von miR-125b in Brustkrebszellen [42], und von miR-200b in Endothelzellen [43]. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass als direktes Ziel von miR-9 wurde Ets1 bei Magenkrebs hochreguliert und dazu beigetragen, die Migration und Invasion von Krebszellen. Preissturz von Ets1 phenocopied teilweise die Auswirkungen von miR-9-Überexpression bei Magenkrebs-Zelllinien, während die Wiederherstellung der Ets1 Ausdruck, die Krebszellen von miR-9-vermittelte Hemmung auf die Migration und Invasion gerettet, eine neuartige posttranskriptionales Regulationsmechanismus enthüllt von Ets1 von miR-9 und ihrer klinischen Potenziale bei Magenkrebs.

Insgesamt haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass miR-9, um die Expression von Cyclin D1 und Ets1 durch direkt ihre 3-Targeting 'reprimiert -UTR, Hemmung somit die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebszellen. Diese Studie erweitert unser Wissen über die Regulation von Cyclin D1 und Ets1 bei der Post-Transkriptionsebene durch miRNA, und schlägt vor, dass miR-9 kann als ein neues therapeutisches Ziel für Magenkrebs von möglichen Werten sein.

Werkstoffe und Methoden

Patientengewebeproben

Genehmigung dieser Studie durchzuführen, wurde vom Institutional Review Board der Tongji Medical College (: 2010-S003 Zulassungsnummer) erhalten. Paraffin eingebettete und frische Proben von 86 primären Magenkrebsfälle wurden von der Abteilung für Chirurgie, Union Hospital der Tongji Medical College erhalten. Ihre pathologische Diagnose wurde durch mindestens zwei Pathologen erwiesen. Die demographischen und klinisch-pathologischen Daten aller Patienten wurden in Tabelle S1 zusammengefasst. Benachbarte Magenschleimhaut, die keine makroskopischen Tumor enthielt, wurde ebenfalls erhalten, und die nicht-neoplastischen Bereiche wurden anschließend durch mikroskopische Histologie bestätigt. Die frischen Tumorproben und den angrenzenden nicht-neoplastischen Mucosa wurden bei -80 ° C bis zum Gebrauch gesammelt und gespeichert.

Immunohistochemistry

Immunhistochemische Färbung wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [44], mit Antikörpern, die spezifisch für Cyclin D1, Ets1, MMP-9 und CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200-Verdünnungen). Die Negativkontrollen enthalten parallele Abschnitte mit Auslassung des primären Antikörpers behandelt, zusätzlich zu einem benachbarten Abschnitt des gleichen Blocks, in dem der primäre Antikörper durch polyklonale Kaninchen-IgG (Abcam Inc) als Isotyp-Kontrolle ersetzt wurde. Die Reaktionsgrad wurde durch mindestens zwei Pathologen ohne Kenntnis der klinisch-pathologischen Eigenschaften von Tumoren beurteilt. 5% der Zellen positiv (1+) 6-25% der Zellen positiv (2+) 26-50% der Zellen positiv; - () <: Der Grad der Positivität wurde zunächst wie folgt nach dem Anteil der positiven Krebszellen klassifiziert und (3 +) > 50% der Zellen positiv. Folien mit mäßiger positiv (2+) oder stark positiv (3+) Reaktivität wurden als mit einem "hohen Expression" eingestuft, während Folien mit negativen (-) oder schwach positiv (1+) Reaktivität eine "niedrige Expression", wie mit klassifiziert wurden .

Western-Blot

zelluläre Protein mit 1 × Zell-Lyse-Puffer (Promega, Madison, WI) extrahiert wurde. Protein (50 &mgr; g) aus jeder Probe wurde einer 4-20% vorgegossenen Polyacrylamidgel (Bio-Rad, Hercules, CA) Elektrophorese und auf Nitrocellulose-Membranen (Bio-Rad). Für Cyclin D1, Ets1, MMP-9, pRB und β-Aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) Detektion wurden die primären Antikörper-Verdünnungen 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 und 1: 1000 jeweils durch 1:3000 Verdünnung von Ziegen-Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-markiertem Antikörper (Bio-Rad) gefolgt. Verstärkte Chemilumineszenz-Substrat-Kit (Amersham, Piscataway, NJ) wurde für die Detektion von Signalen chemiluminscent mit Autoradiographie-Film (Amersham) verwendet.

RT-PCR und Echtzeit-quantitative RT-PCR

Total RNA wurde mit RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) isoliert. Die reversen Transkriptionsreaktionen wurden mit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN) durchgeführt. Die PCR-Primer für Cyclin D1, Ets1, MMP-9 und β-Actin wurden von Premier Primer 5.0 Software (Tabelle S2) ausgelegt. RT-PCR wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [44]. Real-time quantitative RT-PCR mit SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) wurde unter Verwendung von ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Fluoreszenzsignale wurden während Verlängerungsphase gesammelt, Ct-Werte der Proben wurden berechnet und die Transkriptspiegel von Cyclin D1, Ets1 und MMP-9 waren um 2 denen von β-Aktin normalisiert ^{-ΔΔCt Methode.}

Die Quantifizierung von miR-9-Expression

Die Pegel der reifen miR-9 in primären Geweben und Zelllinien wurden Bulge-Loop ™ miRNAs qPCR Primer-Set (RiboBio Co. Ltd, Guangzhou, China) bestimmt. Nach cDNA mit einer miRNA-spezifische Stem-Loop-Primer synthetisiert wurde, wurde die quantitative PCR mit den spezifischen Primern (Tabelle S2) durchgeführt. Die miR-9 Stufen waren mit denen der U6 snRNA normalisiert.

miRNA Ziel Vorhersage

miRNA Ziele vorhergesagt wurden unter Verwendung der Algorithmen MIRANDA, miRDB, RNA22 und Targetscan [45]. Um die Gene häufig vorhergesagt durch vier verschiedene Algorithmen, die Ergebnisse der vorhergesagten Ziele wurden durchschnitten mit miRWalk [46].

Zellkultur und Transfektion

menschlichen Magenkrebszelllinien (SGC-7901 zu identifizieren und MKN-74) und SV40-transformierten, normal und nicht-tumor Magenepithelzellen GES-1-Zellen [20] wurden aus der Type Culture Collection der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten. Menschliche Magenkrebs-Zelllinie AGS (CRL-1739) wurde als American Type Culture Collection (Rockville, MD) erworben. Zellen wurden in RPMI1640-Medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (Life Technologies, Inc.), Penicillin (100 U /ml) und Streptomycin (100 ug /ml) gezüchtet. Zellen wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2 gehalten.}

• PLoS ONE: Assoziation zwischen Reduktion der Plasma Adiponectin Niveaus und Risiko einer bakteriellen Infektion nach Magenkrebs Chirurgie
• PLoS ONE: Expression von AFP und STAT3 beteiligt ist in Arsentrioxid-induzierte Apoptose und Hemmung der Proliferation in AFP-produzierenden Magenkarzinomzellen