PLoS ONE A Novel Toiminnallinen TagSNP Rs7560488 että DNMT3A1 järjestäjä liittyy Alttius mahasyövän moduloimalla Promoottori Activity

tiivistelmä

DNA-metyylitransferaasin (DNMT) 3a, joka sisältää DNMT3A1
ja DNMT3A2
isomuodot on ehdotettu ratkaiseva rooli syövän synnyssä ja osoitti poikkeavaa ilmentymistä useimmat syövät. Kertyneet todisteet osoittivat myös, että yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) in DNMT geenit liittyvät alttiuteen erilaisia ​​kasvaimia. Oletimme, että geneettisiä variantteja DNMT3A1
promoottorialueen liittyvät mahalaukun syövän riski. Valitsimme tagSNPs alkaen HapMap tietokannasta Kiinan ja joiden genotyyppi on tapauskontrollitutkimuksessa arvioida yhdessä mahalaukun syöpä (GC) kiinalaisessa väestöstä. Havaitsimme, että toiminnallinen tagSNP rs7560488 T > C liittyi merkitsevästi suurentunut GC. In vitro
toiminnallinen analyysi lusiferaasireportterista määritys ja EMSA ilmoitti, että tagSNP rs7560488 T > C olennaisesti muuteta transkriptionaalista aktiivisuutta DNMT3A1
geenin kautta vaikuttavia sitoutuminen joidenkin transkriptiotekijöitä, vaikka selvä transkription tekijä on vahvistamatta. Verrattuna TT homotsygootteja, henkilöt, jotka olivat TC heterotsygooteilla ja CC homozygoottien esiin alentuneen ilmaus DNMT3A1
. Lisäksi ositettu analyysi osoitti, että henkilöt, jotka satama TC tai CC genotyyppejä alle 60 vuotias olivat alttiimpia GC. Tuloksemme viittaavat siihen, että geneettiset vaihtelut DNMT3A1
promoottori edistää alttius GC ja tarjoavat katsauksen joka tagSNP rs7560488 T > C voi olla lupaava biomarkkereiden ennustamiseksi GC geneettinen alttius ja arvokasta tietoa GC synnyssä.

Citation: Wu H, Zhang K, Gong P, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) romaani Toiminnallinen TagSNP Rs7560488 että DNMT3A1 järjestäjä liittyy Alttius mahasyövän moduloimalla Promoottori Activity. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10,1371 /journal.pone.0092911

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 22 joulukuu 2013; Hyväksytty: 27 helmikuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81171915 ja nro 91229107) ja tieteellisen tutkimuksen ja innovoinnin suunnitelma merkonomien Jiangsun maakunnassa Kiinassa (Grant nro CXZZ13_0082). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia Kiinassa, erityisesti Jiangsun maakunnassa ilmaantuvuus on suuri ja kuolleisuus [1], [2]. Se voi levitä koko vatsan ja muihin elimiin, kuten ruokatorven, keuhkot, imusolmukkeet tai maksan. Siksi mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmassa [3]. Kun otetaan huomioon terapeuttisen tehokkuuden, kirurginen resektio voi olla ensisijainen parantavaa hoitoa varhaisemmissa GC potilaista [4]. Valitettavasti useimmat mahasyöpäpotilaista havaitaan pitkälle, jona aikana kasvain ovat leikattavissa enää. Lisäksi uusiutuminen leikkauksen jälkeen on toinen kauhea tapahtuma huono 5 vuoden pysyvyys. Ottaen huomioon potilailla, joilla on pitkälle edennyt tai toistuvia mahasyöpä, ei ole epäilystäkään siitä, että löytö biomarkkereita ja niiden soveltaminen mukana perinteisiä diagnoosi voisi olla arvokas osoitus ja laaja ohje muotoilla ehkäisyyn ja hoitoon strategiaa. Tähän mennessä on kuitenkin vain vähän mitattavissa biomarkkereita ennustamiseksi GC toistuminen on tunnistettu.

tuumorigeneesiä tiedetään olevan monivaiheinen prosessi, joka on seurausta paitsi geneettisiä muutoksia, vaan myös epigeneettisiä muutoksia, [5]. DNA: n metylaatio on tärkeä muoto epigeneettiset muutos ja sillä on keskeinen merkitys kehitykselle, erilaistumiseen, genomista vakautta, X-inaktivaation, ja merkintä erityisillä geenin ilmentymisen säätelyyn. Yleisimmin tutkittu epigeneettisellä ilmiö on DNA: n metylaatio, olennainen säätelijä transkription ja kromatiinirakenteeseen. Poikkeava DNA metylaation geneettisesti herkkien tausta voi liittyä lisääntynyt riski useita ihmisen sairauksia [6], [7], mukaan lukien GC [8]. DNMT3A
joka sisältää DNMT3A1
ja DNMT3A2
kaksi de novo
DNA metyylitransferaaseja on keskeinen rooli alkion kehitykseen poikkeava DNA: n metylaation karsinogeneesissä. Jotkut polymorfismia DNMT3A
geeni voi säädellä geeniekspressiota, vaikuttaa sen entsymaattista aktiivisuutta ja saattavat edistää alttiutta syöpään. Kertyneet todisteet molekyyligenetiikan osoittavat, että SNP DNMT
geenit liittyvät syöpäalttiuteen [9], [10]. Viimeaikaiset edistymistä.Ehdotus genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa (GWAS) myös on tunnistettu uusia alttius SNP GC, joka on hyödyllistä ymmärtää taustalla mekanismi geneettisen vaihtelun kehittämisessä GC [11] - [14]. Aikaisemmat tutkimuksessa todettiin toiminnallinen SNP rs1550117 in DNMT3A
promoottori, jotka voivat lisätä sen transkriptionaalisen aktiivisuuden ja edistää geneettinen alttius mahasyövän kiinalaisessa väestöstä [15], [16].

GWAS on tuottanut lukuisia SNP liittyvät moniin syöpiin. Joissakin tapauksissa, kymmeniä SNP kutsutaan tagSNPs jotka edustavat SNP alueella genomin korkean kytkentäepätasapainossa voi tunnistaa geneettinen vaihtelu ilman genotyypin joka SNP kromosomialueella, joten tagSNPs ovat käyttökelpoisia koko genomin SNP yhdistyksen tutkimuksia, kuten eturauhas-, rinta-, munasarja-, kolorektaali- ja aivojen syövät [17] - [19]. Tässä tutkimuksessa, valitsimme tagSNP rs7560488 päässä HapMap tietokannasta kiinalaisilla arvioida assosiaatioita perimä DNMT3A1
promoottori ja mahalaukun syövän riski kiinalaisessa väestöstä. Olemme tunnistaneet riskin liittyvän rs7560488 T > C polymorfismi DNMT3A1
promoottori, ja meidän lisätyötä ehdotti, että tämä muunnos voisi muuttaa promoottorin aktiivisuutta ja tuhota sitova kyky transkriptiotekijöitä.

materiaalit ja menetelmät

tutkimus aiheet

kaikkiaan 405 potilasta, joilla on histologisesti vahvistettu mahasyövän ja 408 syöpää vapaa valvonta rekrytoitiin tässä tapauskontrollitutkimuksessa, ja ominaisuudet tapausten ja kontrollien esitetään taulukossa 1. asioissa ja verrokit iän, sukupuolen ja valittiin ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University. Kaikki näytteet saatiin kirjallinen suostumus ja analysoidaan anonyymisti. Tämä tutkimus suoritettiin hyväksymisen lääketieteellisen eettisen komitean Medical School of Southeast University.

TagSNP valinta ja TF Binding Site Prediction

Pääasialliset hypoteesi taustalla tässä kokeessa oli, että on olemassa yksi tai enemmän SNP DNMT3A1
promoottori alueille, jotka liittyvät mahalaukun syövän riski. Riippuen kytkentäepätasapaino- (LD) rakenne tietyllä lokuksen, tagSNPs voi olla korvikkeita tuhansille muita SNP. Oletamme, että tällaiset tagSNPs todennäköisesti myös merkitä mitään tähän asti tunnistetut SNP DNMT3A1
promoottori. Niinpä valitsimme SNP DNMT3A1
promoottorialueen vähäinen alleelin taajuus (MAF) on > 5% sekä HapMap ja dbSNPs tietokantoja. Toteuttaa mahdollisesti toiminnallisia tagSNP valinta, käytämme tietoja kansainvälisestä HapMap ja vapaasti web-pohjainen tagSNP valinta työkaluja valita tagSNPs, ja käytä TF-hakualgoritmi (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH .html) ennustaa rs7560488 transkriptiotekijän (TF) sitoutumiskohtaan.

DNA Extraction ja HRM-genotyypin

tutkimiseksi DNMT3A1
promoottorin tagSNP rs7560488, genomi-DNA eristettiin 1 ml perifeeristä verta potilaiden ja terveiden yksilöiden ja eristettiin valkosolujen viikon kuluessa näytteen keräämiseksi proteinaasi K pilkkomalla kuten aikaisemmin on kuvattu [20]. TagSNP rs7560488 oli genotyyppi käyttäen dsDNA väriaine LC Green yhdistettynä High Resolution Sulaminen (HRM) analyysi. Yksityiskohtaisesti, PCR-alukkeet suunniteltiin, jonka LightScanner alukkeen suunnittelun ohjelmistot (Idaho Technology) (eteenpäin-aluke: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 '; Reverse-aluke: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3'), joka tuote yhdessä 208 bp: n fragmentti. Kukin PCR-reaktio suoritetaan alun perin lopullisessa reaktiotilavuudessa 10 ui, käyttäen 25 ng genomista DNA: ta, 0,2 pmol kutakin aluketta, 0,8 ui 2,5 mM dNTP: itä, 1 ui 25 mM MgCl _{2, 1 ui 10 x Taq-puskuria kanssa (NH 4) 2SO 4, 0,4 U Taq DNA-polymeraasia (Fermentas), 1 ui 1 x LC Green PLUS (Idaho Technology) ja 0,4 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO). Reaktioseos inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja käsiteltiin sitten 40 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 57 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 30 sekuntia, minkä jälkeen 72 ° C: ssa 7 min käyttäen PTC-200 lämpösyklilaitteessa (Bio-Rad). PCR-reaktiot siirrettiin 96-kuoppaisille levyille (Bio-Rad) ja analysoitiin Light Scanner (Idaho Technology). Fluoresenssi kerättiin yli lämpötila-alueella 70-97 ° C, ja sulamisen käyrä analyysi suoritettiin valmistajan ohjelmistoa. HRM voi suoraan syrjiä heterozygoottiset (TC) ja homotsygoottisia (CC tai TT) genotyypin tagSNP rs7560488 T > C kautta sulaa skannauksen. Sekoittamisen jälkeen homotsygoottinen DNA yhtä suurella määrällä tunnettuja PCR-tuotteiden (esim CC), se tehtiin jaottelu CC ja TT genotyypit. Sillä lisävahvistusta, 5% näytteenotto jokaisesta ryhmästä havaita HRM valittiin satunnaisesti ja altistetaan DNA sekvensointi luotettavuuden varmistamiseksi ja toistettavuus.}

rakentaminen lusiferaasireportteriplasmidi

rakentamiseksi DNMT3A1 tagSNP rs7560488 toimittaja plasmidi, amplifioimme 948 bp: n fragmentti 25422345-25422345 on DNMT3A1
promoottorialueen, joka sisältää T: n ja C-alleeli SNP: PCR: llä genomisesta DNA: sta. Alukkeet, joita käytetään PCR-monistukset olivat: (Forward: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', Reverse: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). PCR-tuotteet subkloonattiin Nhel: llä ja Hindlll-restriktiokohtien pGL3-Basic-vektoriin (Promega, Madison, WI). Me tarkasti kaikki yhdistelmä-kloonien DNA-sekvensoinnin avulla.

Transient transfektio ja Dual Luciferase Reporter Assay

Ihmisen mahalaukun syövän AGS ja BGC-823-soluja (ATCC) kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 % naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (10 000 U /ml ja 10 mg /ml, vastaavasti). AGS ja BGC-823-soluja (1 x 10 ^{5) ympättiin 24-kuoppaisille viljelylevyille. 24 tunnin kuluttua viljelyn, AGS, BGC-823-solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 0,8 mg kutakin Rakennettu vektori, joko T-alleelin tai C-alleelin. Samanaikaisesti 10 ng PRL-TK plasmideja (Promega) kuoppaa kohti transfektoitiin myös sisäisenä kontrollina korjaamiseksi transfektion tehokkuutta. Ennen kuin se, solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille yli yön varmistaa 90% -95% konfluenssiin aikaan transfektion. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ja ilmaistiin suhteena tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet. Kaikki solut tehtiin kolmena kappaleena kanssa samoissa olosuhteissa. Kolme riippumatonta transfektio suoritettiin kokeita, ja kukin Lusiferaasimääritys suoritettiin kolmena kappaleena.}

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

5'-biotinyloidun oligoja 25 bp pitkä saatiin Beijing Genomics Institute (BGI). Oligo-sekvenssit olivat rs7560488 [T] Forward: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Forward: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Hehkutus, konsentroitiin täydentävät oligonukleotidit sekoitettu 01:01 moolisuhteessa ja inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten pienentää asteittain tunnin ajan, kunnes oligonukleotidit saavutti huoneen lämpötilan. Oligoihin laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 10 fmol. Nuclear proteiinit uutetaan BGC-823-soluissa käyttäen NE-PERTM Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Pierce, Rock-ford, IL, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. LightShift Chemiluminescent EMSA (Pierce /Thermo Fisher Scientific) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, sitovat reaktiot suoritettiin seuraavalla tavalla: tumauutteita (8 ug proteiinia) ja 1 x sitomispuskurissa 2,5% glyserolia, 5 mM MgCI2: ta, 50 ng /ul poly (dl-dC), 0,05% NP-40, ja 60 fmol biotiinileimattua rs7560488 T /rs7560488 C koettimia inkuboitiin jäillä 30 min: n tilavuudessa 20 ui. Kilpailun tutkimukset tumauutteita inkuboitiin leimaamattoman oligonukleotidin 30 min ennen kuin lisätään leimattu oligonukleotidi. Saat supermuutoksena, AP-1-vasta-ainetta lisättiin (Boster, Kiina). Kompleksit erotettiin elektroforeesilla natiivi 6% PAGE 0,5 × TBE-puskurissa 110 V Geelit siirrettiin Biodyne B valmiiksi leikatut modifioitu nylonmembraaneille (Pierce /Thermo Fisher Scientific) käyttäen Trans-Blot SD puolikuiva siirto solun ( Bio-Rad Laboratories). Kalvot ristisilloitettu (UVC-508 UV Cross-linkkeri, Ultra LUM) ja signaali havaittiin kanssa kemiluminesenssiosoitusta järjestelmä (Pierce /Thermo Fisher Scientific) mukaan valmistajan ohjeiden.

Detection of DNMT3A1 Transcripts by Kvantitatiivinen RT-PCR (Q-PCR) B

edelleen havaita korrelaatio DNMT3A1 mRNA-tasoja ja rs7560488 polymorfismi, 44 mahasyövän kudosten eri genotyypit tehtiin uuttamalla kokonais-RNA käyttämällä Trizol-reagenssia ( Invitrogen, Inc.). DNMT3A1 mRNA taso mitattiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR jälkeen käänteistranskriptio on Prism 7900 Real-Time PCR kone (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-aktiini käytettiin sisäisenä kvantitatiivinen ohjaus kullekin näytteelle. Käytetyt alukkeet DNMT3A1 vahvistus olivat F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'ja R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; alukkeita varten β-aktiini oli F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'ja R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Suhteellinen kvantitointi DNMT3A1 mRNA lasketaan käyttämällä 2-ΔΔCT menetelmällä, ja kukin määritys tehtiin kolmena kappaleena.

TILASTOANALYYSI

Kaikki tiedot analysoitiin SPSS
versio 13,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Potilaiden ja verrokkien verrattiin Studentin t
-testi jatkuvien muuttujien ja chi-neliö (χ2) testi kategorisen muuttujia. Alleeli ja genotyyppi taajuuksien välillä ohjaus ja GC aiheita saatiin käyttämällä chi-neliö testi, ja tavallinen hyvyys fit testiä käytettiin testaamaan Hardy-Weinberg tasapaino. P
arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Ominaisuudet koehenkilöistä

frekvenssijakaumat tapauksista ja valvonta on esitetty taulukossa 1, ei ollut merkittävää eroa frekvenssijakaumia välillä tapausten ja kontrollien (P = 0,243 ikä ja P = 0,355 sukupuoli). Keskiarvo potilaiden ja verrokkien oli 59,8 vuotta (vaihteluväli 20~93 vuotta) ja 60,6 vuotta (vaihteluväli 25~90 vuotta), tässä järjestyksessä. Mitään merkittävää eroa ei havaittu keski-iän ja sukupuolen, mikä viittaa siihen, että sovitus perustuu näihin kahteen muuttujaan oli riittävä.

Candidate tagSNP valinta ja genotyypin

Yksi ehdokas SNP DNMT3A1
, olemme keskittyneet tagSNPs että edistäjä DNMT3A1
ja ennusti niiden mahdolliset toiminnon sitova transkriptiotekijöitä, jotka vaikuttavat laadullinen ja määrällinen ilmaus DNMT3A1
. Käytimme LD-pohjainen tagSNP valinta-algoritmin (r ^{2≥0.80, MAF≥5%), joka tunnistetaan kaksi tagSNPs edustaa yhteistä geneettistä vaihtelua CHB väestöstä, mukaan lukien ehdokas tagSNPsrs7560488 ja rs1550117, joka on toiminnallinen polymorfismi, joka muuttaa alttius mahasyövän varmistimme ennen [15], [16]. TFSEARCH algoritmi ennustaa, että rs7560488 T luo sitoutumiskohta AP-1 (kuvio 1). Näytteet genotyypitys HRM ja sekvensoinnilla ABI 3730 automaattisekvensoijaa vastaavasti (kuva 2).}

TagSNP rs7560488 Variant T > C DNMT3A1 Promoottori merkittävästi riskiä GC

genotyyppi jakaumat ja alleelifrekvenssien rs7560488 on esitetty taulukossa 2. genotyyppi taajuuksia ohjaus ei yhteisymmärryksessä Hardy-Weinberg malli (P = 0,274). Kuten on esitetty taulukossa 2, genotyyppi taajuudet rs7560488 olivat 68,9%, 27,4%, ja 3,7%, että TT, TC ja CC genotyyppien joukossa tapauksissa ja 79,9%, 18,4%, ja 1,7% välillä valvonta, vastaavasti, välinen ero tapausten ja kontrollien välillä oli tilastollisesti merkitsevä (P < 0,05). Lisäksi T-alleelin frekvenssi oli huomattavasti pienempi joukossa tapauksia kuin kontrolleilla (82,6% vs. 89,2%, P = 0,000). Lisäksi, yhdistetty TC /CC-genotyyppi taajuus oli yleisempää tapausta kuin kontrolleilla (31,1% vs. 20,1%, P = 0,002). Kun otetaan TT genotyypin ja T-alleelin referenssinä, huomasimme, että variantti genotyypit (TC ja CC) liittyi suurentunut GC (OR = 1,653, 95% CI = 1,194-2,287; P = 0,002). Samoin myös havaittu, että C-alleeli taajuuksilla oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin kontrolleilla (OR = 1,744, 95% CI = 1,310-2,321; P = 0,000). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että TC ja CC genotyypit liittyy geneettinen alttius GC; DNMT3A
1 rs7560488 T alleeli voi olla oletettua suojaava alleeli. Ei ollut merkittäviä eri taajuuksien rs7560488 in GC ikäryhmä > 60 vuotta verrattuna ≤60 vuotta (P = 0,756), ja mies vs. nainen (P = 0,459) (taulukko 3).

Yksilöt Alle 60 vuotias olivat alttiimpia syöpään kanssa tagSNP rs7560488 Variant T > C

ikä ja sukupuoli olivat tärkeitä tekijöitä kasvain syövän synnyn myös mahasyövän. Kun analyysit ositettu iän ja sukupuolen potilaista, huomasimme, että merkittävää yhteyttä havaittiin, yksilöiden kuljettaa TC /CC genotyypit liittyy geneettinen alttius GC sekä miesten ja naisten ryhmässä. Siksi rs7560488 C alleeli oli merkittävästi lisääntynyt riskitekijä verrattuna T-alleelin (taulukko 4). Edelleen kerrostuminen arvioitiin yhdistys rs7560488 T > C mahalaukun syövän eri ikäisille. TC /CC genotyypit liittyy geneettinen alttius GC ikäryhmä ≤60 vuotta (OR = 1,794, 95% CI = 1,118-2,877; P = 0,015) kuin yli 60, samoin myös havaittu, että C alleelifrekvenssit oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin kontrolleilla (OR = 1,720, 95% CI = 1,127-2,622; P = 0,011). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TC ja CC genotyypit liittyy geneettinen alttius GC, erityisesti yksilöiden enintään 60 vuotta (taulukko 4).

Euroopan rs7560488 T > C Variant Vaikuttaa DNMT3A1 transkriptioaktiivisuutta

Jotta voidaan arvioida biologinen toiminnallinen vaikutus rs7560488 polymorfismin vaikutus DNMT3A1 transkriptio rakensimme lusiferaasireportterista vektorit (pGL3), ulottuen 4389823-4390770 tukikohta DNMT3A1
promoottori, joko villityypin (T-alleelin) tai mutantti tyypin (C-alleelin) ja transfektoitiin ne BGC-823, AGS-soluja (kuvio 3A). Kuten on esitetty kuviossa. 3B, olemme huomanneet, että transkription aktiivisuus T-alleelin oli suurempi kuin C-alleelin, jossa on noin 2-kertaiseksi yli kaksi solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että rs7560488 T-alleeli toimi vastaan ​​mahasyövän lisäämällä transkription DNMT3A1
.

Euroopan rs7560488 T > C Variant Vaimentaa transkriptiotekijä Affinity

Koska tagSNP rs7560488 sijaitsee DNMT3A1
promoottorialue; me arveltu, että se voisi muuttaa sitovaa transkriptiotekijän (TF). Todellakin, käyttäen TF-algoritmi (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), me ennusti rs7560488 T luo TF sitoutumiskohta AP-1. Sen määrittämiseksi, onko tämä polymorfismi on vaikutusta sitova kyky transkriptiotekijän, teimme elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) analysoida sitova oligo- koettimia, jotka sisältävät joko T tai C-alleelin ydin- uutetut proteiinit AGS solusta. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, erityinen siirtynyt DNA /tumaproteiinin kompleksi bändi syntyi sekä C ja T-alleelin koettimia (Kuva. 4 kaistat 2, 5). Kuitenkin T-alleelin vieläkään ei ole täysin inhiboi kilpailevasti (Fig. 4A kaista 4), vaikka siirtynyt bändi poistettiin 50-kertainen leimaamatonta C koettimia (Kuva. 4A kaista 1), mikä viittaa siihen, että sitoutumisaktiivisuus sekvenssin sisältävän rs7560488 T alleeli oli vahvempi verrattuna C-alleeli transkriptiotekijä voisi sitoutua valikoivasti T-alleelin sijaan C-alleelin. Lisäksi, super-EMSA käyttämällä AP-1-vasta-aine ei aiheuttanut supersiirtymäanalyysi Biotiini-leimatun koettimen /tumaproteiini (Fig. 4 B kaista 2, 5), mikä osoittaa, että AP-1 saa transkriptiotekijä, joka sitoutuu promoottorialueelle joka sisältää T tai C-alleeli. Nämä tulokset osoittivat, että rs7560488 C-alleeli saattaa vähentää tumaproteiinin sitoutumisaktiivisuus vaikka vaikutus ei vaikuta transkriptiotekijä AP-1.

välisestä assosiaatiosta DNMT3A1rs7560488 polymorfismin ja Expression tasot DNMT3A1
mRNA

Neljäkymmentäneljä mahasyövän kudosten eri genotyypit DNMT3A1 rs7560488 olivat saatavilla meidän esillä olevassa tutkimuksessa. Koska alhaisen taajuuden CC-genotyyppi, lisäsimme sen näytteiden TC genotyypin analyysiä varten. Kuten on esitetty kuviossa. 5 ekspressiotasot DNMT3A1 mRNA oli matalampi yksilöiden TC tai CC-genotyyppi kuin niillä, joilla on TT-genotyyppi (P < 0,05).

Keskustelu

Genominlaajuiset hypometylaatio ja promoottori hypermetylaation ovat tunnusmerkkejä hyvin erilaisia ​​syöpiä edistää kasvainten synnyssä ja DNA: n metylaatio pelaa keskeinen rooli geenin ilmentymisen säätelemiseksi ja ylläpitäminen genomista vakauden [21], [22]. DNA: n metylaatio suoritetaan DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) DNMT1
, DNMT3B
ja DNMT3A
[23], [24]. de novo
metyylitransferaasit DNMT3A
ovat erittäin ilmaistiin alkion varhaiskehityksen ja alassäädetty useimmissa eriytetty somaattisten solujen [25]. Rooli DNMT3A
ihmisen syövässä korostettiin raportit DNMT3A
mutaatiot noin 20% potilaista, joilla on akuutti myelooinen leukemia [26], [27]. Esiintyminen Näiden mutaatioiden korreloi vähentynyt entsyymiaktiivisuutta ja genomin alueille väheni metylaatio. DNMT3A
mutaatioita havaittiin myös 8%: lla myelodysplastinen oireyhtymä [28]. DNMT3A
on myös ratkaiseva rooli epigeneettiset hiljentäminen hematopoieettisten kantasolujen (HSC) säätelygeenit ja mahdollistaa tehokkaan eriyttämisen [29].

DNMT3A
genomista lokuksen tuottaa kaksi selostukset synnyttää kaksi proteiinia, pidempi DNMT3A1
ja lyhyempi DNMT3A2
, jotka eroavat siitä, että 219 aminohapon amino (N) terminaalista häntää on läsnä vain DNMT3A1
[30], [31]. N-terminaalinen domeeni DNMT3A1
kutsutaan "sääntely" domain koska sillä ei ole entsymaattista DNA metyylitransferaasiaktiivisuus. Tämä verkkotunnus ei jaa merkittävää homologiaa minkään muun tunnetun proteiinin. DNMT3A1
on keskittynyt heterochromatin, joka pidetään transkriptionaalisesti hiljainen, ja toimii pääasiassa transkription repression [30]. Mutta muut tutkimus osoitti, että DNMT3A1
oli tehokkaasti rekrytoitiin vaiennettu Oct3 /4 ja aktivoitu vitronektiinissä (Vtn) geenin promoottorit kautta ainutlaatuisen N-terminaalinen domeeni [32].

On raportoitu että geneettinen vaihtelut DNMT3A
geeni edistää syövän syntymistä erityisesti liittyy GC [15], [33] - [36]. Sitten, edelleen tutkia suhdetta SNP ja translaation asetusta sen kohdegeenien ehdotetaan. Mutta, selvittävät biologisen funktion kunkin SNP vaatii usein aikaa vievää, molekyylibiologian kokeet. Siten analysoidaan useita SNP sidoksissa mihinkään tiettyyn lokukseen käytännössä edellyttää järjestelmällistä bioinformatiikan arviointi ja priorisointi kaventaa joukko todennäköisesti toiminnallisten ehdokas variantteja. Koska suurin osa SNP ovat LD, haplotyyppi-pohjainen yhdistys tutkimukset pidetään tehokkaampi kuin yhden SNP-analyysi tunnistaa syy geneettisiä variantteja taustalla etiologiassa monimutkaisten sairauksien, kuten syövän [37], paitsi käyttö tagSNPs jotka keräävät useimmat haplotypic monimuotoisuuden yhdistys tutkimuksissa on ehdotettu [38]. Vaikka GWAS on tuottanut lukuisia SNP: iden tai tagSNPs merkittävästi liittyy syövän, useimmat tagSNPs löytyvät ei-proteiinia koodaavia alueita (geenienvälisillä ja introni alueet), tunnistetaan niiden toiminnalliset ja /tai syy variantteja on tärkeä rajoitus GWAS tietojen tulkinta huolimatta määrittämällä oletetun toimintoja monia muita GWAS tagSNPs on vain ollut onnistunut, kun hienokartoitus noin tunnettu riski alueella suoritettiin [39] - [41].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme valinneet oletetun toiminnallinen tagSNP rs7560488, joka voi edustavat SNP DNMT3A1
promoottori korkea kytkentäepätasapaino-, on mahdollista tunnistaa geneettinen vaihtelu ilman genotyyppi joka SNP DNMT3A1
promoottorialue ja tehostaa -alueella. Havaitsimme, että koehenkilöillä kuljettavat tagSNP rs7560488 TT genotyypit näytteillä vähensi mahasyövän riski verrattuna yksilöiden TC tai CC-genotyyppi, joka osoittaa, että alleeli T on suojaava vaikutus mahdollisesti näytteillä tämän tagSNP. Lisäksi määritykset suoritimme lisätodisteita, jotka osoittavat TC ja CC-genotyyppi liittyy pienentynyt ekspressiotasot DNMT3A1
mRNA mahasyövän kudoksissa, tulokset viittaavat siihen, että DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T > C polymorfismi voi säätelemään DNMT3A1
ja siten edistää GC alttiuteen. Nämä tiedot osoittivat myös, että DNMT3A1 voi olla rooli etenemistä mahasyövän, mutta tämä havainto on vahvistettu suurempi väestötutkimuksessa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti ja osoittaa, että DNMT3A1
transkriptio vaikuttaa suoraan toiminnallinen tagSNP rs7560488 on DNMT3A1
promoottorialue ja tagSNP rs7560488T > C liittyi merkittävästi lisääntynyt vaara GC. Seuraavaksi teimme EMSA kokeen analysoida biologinen seuraukset tagSNP rs7560488 polymorfismin BGC-823 soluja. Sekä T-alleelin ja C-alleelin koettimet havaittiin kaksi geeli-shift bändejä, mutta kilpailu kokeet osoittivat sitoutumisaffiniteettia ydinalan proteiinien T-alleelin koetin variantti oli suurempi kuin mitä havaittiin C-alleelin anturi vastine. Joten parannettu DNA-proteiinia sitova kyky T alleelin voi olla vastuussa lisääntyneestä DNMT3A1
promoottorin aktiivisuutta että havaitsimme meidän promoottori määrityksissä. Super-EMSA kokeessa käytettiin AP-1-vasta-aineita ei ole saanut super-geeli shift osoitti, että transkriptio tekijät AP-1 ei saa sisältyä muodostumista transkription komplekseja on tagSNP rs7560488 päällä. Toinen uusi tulos tulee yhdistyksen välillä iän ja rs7560488 T > C polymorfismi kerrostunut analyysi ymmärtää, että alle 60 vuotias olivat alttiimpia mahasyövän kanssa tagSNP rs7560488 T > C. On todennäköistä, että DNMT3A1
vaikuttaa spesifisten geenien transkriptio erityisesti ja muutokset tiettyjen geenien lisätä riskiä GC. Nämä tulokset osoittavat myös, että vahvempi riskitekijä GC on tagSNP rs7560488 T > C, erityisesti nuorena.

Yhdessä tämä tutkimus tarjoaa ensimmäistä mekanistinen käsityksen siitä, miten tämä uusi toiminnallinen tagSNP rs7560488 T > C variantti liittyy merkittävästi mahalaukun syövän riski kiinalaisessa väestöstä. Huomasimme, että T muutosta C: ksi olennaisesti muuteta transkriptionaalista aktiivisuutta DNMT3A1
geenin kautta vaikuttavia sitoutuminen joidenkin transkriptiotekijöitä ja siten muuttaa DNMT3A1 ilmaisun tasolla, vaikka selvä transkriptiotekijöitä on vahvistamatta. Meidän havainnot antavat kuvan, että DNMT3A1
promoottori rs7560488 T > C vaihtelu on lupaava biomerkkiaine arvioimaan väestön altis GC ja antaa arvokasta tietoa kohti tulevaa tutkimusta mahasyövän synnyssä.

Kiitokset

Kiitämme professori Yaping Wang, tohtori Zhenming Cai, Lili Cao (Nanjing University, Nanjing, Kiina) ja Zhenghao Zhang (Kaakkois yliopisto, Nanjing, Kiina) ja HRM genotyypitys.

• PLoS ONE: Co-toimitus doksorubisiinin ja SATB1 shRNA mukaan Lämpöherkkä magneettinen kationisia liposomeja mahasyövän Therapy
• PLoS ONE: Clinical ja Prognostic merkitys HIF-1α, PTEN, CD44v6, ja Surviviinispesifisiä mahasyövän: Meta-analyysi