PLoS ONE: A Novel Functional TagSNP Rs7560488 im DNMT3A1 Promotor mit Empfänglichkeit für Magen-Krebs von Stetige Promotoraktivität

Abstrakt

DNA-Methyltransferase (DNMT) -3A, die enthält DNMT3A1
und DNMT3A2
Isoformen eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung spielen und zeigte abweichenden Expression vorgeschlagen wurden, in den meisten Krebsarten. Gesammelte Beweise zeigten auch, dass Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) in DNMT Gene wurden mit der Anfälligkeit im Zusammenhang mit verschiedenen Tumoren. Wir vermuten, dass genetische Varianten in DNMT3A1
Promotorregion mit Magenkrebsrisiko assoziiert sind. Wir haben für Sie die tagSNPs aus der HapMap-Datenbank für den chinesischen und in einer Fall-Kontroll-Studie genotypisiert die Assoziation mit Magenkrebs (GC) in einem chinesischen Bevölkerung zu bewerten. Wir festgestellt, dass die funktionellen tagSNP rs7560488 T > C mit einem signifikant erhöhten Risiko von GC verbunden. In vitro
funktionelle Analyse von Luciferase-Reporter-Assay und EMSA zeigte, daß das tagSNP rs7560488 T > C im Wesentlichen Transkriptionsaktivität verändert DNMT3A1
Gen über die Bindung einiger Transkriptionsfaktoren, obwohl eine bestimmte Transkriptions Beeinflussung Faktor bleibt festgelegt werden. Im Vergleich mit TT-Homozygote, Probanden, die waren TC Heterozygoten und Homozygoten CC zeigte eine verminderte Expression von DNMT3A1
. Darüber hinaus zeigte geschichtete Analyse, dass Personen, die TC oder CC-Genotypen weniger als 60 Jahre alt waren anfälliger für GC Hafen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die genetischen Variationen in der DNMT3A1
Promotor zur Anfälligkeit für GC beitragen und bieten auch einen Einblick, dass tagSNP rs7560488 T > C ein vielversprechender Biomarker GC genetische Anfälligkeit sein kann für die Vorhersage und einen wertvollen Informationen in GC Pathogenese

Citation:. Wu H, Zhang K, Gong P, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) Eine neuartige funktionelle TagSNP Rs7560488 im DNMT3A1 Promotor mit Empfänglichkeit für Magenkrebs durch Stetig Promoter Aktivität. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10.1371 /journal.pone.0092911

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Empfangen: 22. Dezember 2013; Akzeptiert: 27. Februar 2014; Veröffentlicht: 25. März 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Erteilungsnummer 81171915 und Nr 91229107) und des wissenschaftlichen Forschungs- und Innovationsplan für Hochschulabsolventen in der Provinz Jiangsu, China (Grant No CXZZ13_0082) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren in China, vor allem in der Provinz Jiangsu mit einer hohen Inzidenz und Mortalitätsrate [1], [2]. Es kann überall in den Magen und auf andere Organe ausgebreitet, einschließlich der Speiseröhre, Lunge, Lymphknoten oder Leber. Daher ist Magenkrebs die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt [3]. Unter Berücksichtigung der therapeutischen Effizienz kann die chirurgische Resektion eine primäre kurative Behandlung für frühere Phase der GC-Patienten [4]. Leider sind die meisten Patienten mit Magenkrebs im fortgeschrittenen Stadium erkannt wird, während welcher Zeit der Tumor sind mehr inoperablem. Darüber hinaus Rückfall nach der Operation ist eine weitere schreckliche Ereignis für eine schlechte 5-Jahres-Überlebensrate. Unter Berücksichtigung der Patienten mit fortgeschrittenem oder rezidivierendem Magenkrebs, ist es kein Zweifel, dass Entdeckung von Biomarkern und deren Anwendung mit traditionellen Diagnose begleitet könnte eine wertvolle Hinweise und eine umfangreiche Hilfe, die Prävention und Behandlung Strategie zu formulieren. Bisher sind jedoch nur wenige messbare Biomarker für die Vorhersage GC Rezidiv identifiziert.

Tumorigenesis ist bekannt, ein mehrstufiges Verfahren zu sein, das das Ergebnis nicht nur genetische Veränderungen, sondern auch epigenetischen Veränderungen [5]. DNA-Methylierung ist eine wichtige Form der epigenetischen Modifikation und spielt eine wesentliche Rolle in der Entwicklung, Differenzierung, genomische Stabilität, X-Inaktivierung und Prägung durch spezifische Regulation der Genexpression. Die am häufigsten untersuchten epigenetischen Phänomen ist die DNA-Methylierung, ein wesentlicher Regulator der Transkription und der Chromatinstruktur. Aberrante DNA-Methylierungsmuster in einem genetisch empfänglichen Hintergrund kann mit einem erhöhten Risiko für eine Reihe von menschlichen Erkrankungen [6], [7], einschließlich GC [8] verbunden sein. Dnmt3a
welche enthält DNMT3A1
und DNMT3A2 Was sind zwei de novo
DNA-Methyltransferasen spielt eine entscheidende Rolle in der Embryonalentwicklung und anomale DNA-Methylierung in der Karzinogenese. Einige Polymorphismen des Dnmt3a
Gen kann die Genexpression regulieren, beeinflussen seine enzymatische Aktivität und kann die Anfälligkeit für Krebs beitragen. Akkumulierte Evidenzen in der molekularen Genetik anzugeben, dass SNP in DNMT
Gene sind, die mit Anfälligkeit für Krebs [9], [10]. Jüngste Fortschritte in der genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) auch neue Empfänglichkeit SNPs für GC identifiziert wurden, die hilfreich ist, den zugrunde liegenden Mechanismus der genetischen Variationen in der Entwicklung von GC zu verstehen [11] - [14]. Unsere früheren Studie fand eine funktionelle SNP rs1550117 in Dnmt3a
Promotor, der seine Transkriptionsaktivität erhöhen und auf die genetische Anfälligkeit für Magenkrebs in einem chinesischen Bevölkerung [15], [16] beitragen.

GWAS hat zahlreiche SNPs im Zusammenhang mit vielen Krebsarten ergab. In einigen Fällen Dutzende von SNPs, genannt tagSNPs die SNPs in einer Region des Genoms mit hoher Kopplungsungleichgewichts darstellen können genetische Variation zu identifizieren, ohne alle SNPs in einer chromosomalen Region Genotypisierung so tagSNPs nützlich sind in gesamten Genoms SNP Assoziationsstudien, wie beispielsweise Prostata-, Brust-, Eierstock-, Darm- und Hirnkrebserkrankungen [17] - [19]. In der vorliegenden Studie wählten wir ein tagSNP rs7560488 aus der HapMap Datenbank für Chinesen, die Assoziationen zwischen den genetischen Varianten in der DNMT3A1
Promotor und Magenkrebsrisiko in einer chinesischen Bevölkerung zu bewerten. Wir identifizierten ein Risiko-assoziierten rs7560488 T >. C Polymorphismus in der DNMT3A1
Promotor und unsere weitere Arbeit vorgeschlagen, dass diese Variante die Promotoraktivität verändern könnten und die Bindungsfähigkeit von Transkriptionsfaktoren zerstören

Materialien und Methoden

Studienteilnehmer

insgesamt 405 Patienten mit histologisch Magenkrebs bestätigt und 408 Krebs-freie Kontrollen wurden in diesem Fall-Kontroll-Studie rekrutiert, und die Eigenschaften der Fälle und Kontrollen detailliert sind in Tabelle 1-Fälle und Kontrollen wurden nach Alter, Geschlecht abgestimmt und wurden aus dem Ersten Affiliated Hospital der Nanjing Medical University ausgewählt. Alle Proben wurden mit schriftlicher Zustimmung und analysiert anonym erhalten. Diese Studie wurde mit Zustimmung der Medizinischen Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Southeast University durchgeführt.

TagSNP Auswahl und die TF-Bindungsstelle Prediction

Die Haupthypothese dieses Experiment zugrunde liegende war, dass es ein oder mehr SNPs in der DNMT3A1
Promotorregionen, die mit dem Risiko von Magenkrebs in Verbindung gebracht. In Abhängigkeit von der Kopplungsungleichgewichts (LD) -Struktur an einem bestimmten Locus sein kann tagSNPs Surrogate für viele Tausende von anderen SNPs. Wir postulieren, dass eine solche tagSNPs sind wahrscheinlich auch alle bisher identifizierten SNPs in der DNMT3A1
Promotor zu markieren. So haben wir uns für die SNPs in der DNMT3A1
Promotorregion mit einer kleineren Allelfrequenz (MAF) von > 5% von den beiden HapMap und dbSNPs Datenbanken. Zur Umsetzung potenziell funktionelle tagSNP Auswahl, verwenden wir Daten aus dem internationalen HapMap und den frei webbasierten tagSNP Auswahl-Werkzeuge tagSNPs auszuwählen, und verwenden Sie die TF-Suchalgorithmus (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH .html) zur Vorhersage rs7560488 Transkriptionsfaktor (TF) Bindungsstelle.

DNA-Extraktion und HRM Genotyping

um zu untersuchen, die DNMT3A1
Promotor tagSNP rs7560488, genomische DNA isoliert aus 1 ml von peripherem Blut von Patienten und gesunden Personen und wurde von den weißen Blutzellen innerhalb einer Woche nach der Probensammlung durch Proteinase K-Verdau extrahiert, wie zuvor beschrieben [20]. TagSNP rs7560488 wurde mit der dsDNA Farbstoff LC Grün in Kombination mit hoher Auflösung Melting (HRM) Analyse genotypisiert. Im Einzelnen wurden die PCR-Primer von der LightScanner Primer-Design-Software (Idaho Technology) entwickelt (Vorwärts-Primer: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 '; Reverse-Primer: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3'), welches Produkt einen einzelnen 208-bp-Fragment. Jede PCR-Reaktion wurde zunächst in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 ul durchgeführt, 25 ng genomischer DNA unter Verwendung von 0,2 pmol eines jeden Primers, 0,8 &mgr; l 2,5 mM dNTPs, 1 &mgr; l 25 mM MgCl _{2, 1 &mgr; l 10 × Taq-Puffer mit (NH4) 2 SO 4, 0,4 U Taq-DNA-Polymerase (Fermentas), 1 ul 1X LC Grün PLUS (Idaho Technology) und 0,4 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). Das Reaktionsgemisch wurde 5 min bei 95 ° C inkubiert und dann für 30 sec bis 40 Zyklen von 95 ° C ausgesetzt wird, 57 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec, gefolgt von 72 ° C für 7 min unter Verwendung von ein PTC-200 Thermocycler (Bio-Rad). Die PCR-Reaktionen wurden zu den 96-Well-Platten überführt (Bio-Rad) und auf der Licht Scanner (Idaho Technology) analysiert. Fluoreszenzdaten wurden über einen Temperaturbereich von 70-97 ° C gesammelt und Schmelzkurvenanalyse erfolgte nach den Angaben des Herstellers Software durchgeführt. C durch Schmelz Scanning; HRM könnte die heterozygote (TC) und homozygote (CC oder TT) Genotypen von tagSNP rs7560488 T >direkt diskriminieren. Nach homozygote DNA mit einer gleichen Menge von bekannten PCR-Produkte Mischen (z.B. CC), ist es weiter unterschieden zwischen dem CC und TT Genotypen. Für eine weitere Bestätigung, 5% der Proben aus jeder Gruppe von HRM erkannt wurden zufällig ausgewählt und einer DNA-Sequenzierung unterzogen, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.}

Bau von Luciferasereporterplasmid

Für die Konstruktion der DNMT3A1 tagSNP rs7560488 Reporterplasmid, wir verstärkt, um das 948 bp-Fragment 25.422.345-25.422.345 von DNMT3A1
Promotorregion, die die T und C-Allel von SNP durch PCR aus genomischer DNA enthält. Die Primer für die PCR-Amplifikationen wurden verwendet: (Vorwärts: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', Rückwärts: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). Die PCR-Produkte wurden in die NheI und HindIII Restriktionsstellen des pGL3-Basic Vektor (Promega, Madison, WI) subkloniert. Wir überprüft alle rekombinanten Klone durch DNA-Sequenzierung.

Vorübergehende Transfektion und Dual-Luciferase Reporter Assay

Menschliche Magenkrebs AGS und BGC-823-Zellen (ATCC) in RPMI-1640-Medium mit 10 ergänzt angebaut wurden % Fetal Bovine Serum (FBS) und 1% Penicillin /Streptomycin-Lösung (10 000 U /ml und 10 mg /ml, jeweils). AGS und BGC-823-Zellen (1 × 10 ^{5) wurden in 24-Well-Kulturplatten ausgesät. Nach 24 Stunden Kultur, AGS wurden BGC-823-Zellen von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit 0,8 mg jeder konstruierten Vektors, entweder mit T-Allel oder C-Allel transfiziert. Gleichzeitig 10 ng pRL-TK-Plasmiden (Promega) pro Vertiefung wurde als interne Kontrolle für transfiziert Transfektionseffizienz korrigiert wird. Bevor es wurden die Zellen auf Platten mit 24 Vertiefungen über Nacht 90% -95% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu gewährleisten. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurde die Luciferase-Aktivität durch das Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) gemessen und ausgedrückt als das Verhältnis der Firefly Luciferase Luciferase-Aktivitäten zu Renilla. Alle Zellen wurden in dreifacher Ausführung mit den gleichen Bedingungen durchgeführt. Drei unabhängige Transfektionsexperimente wurden durchgeführt, und jede Luciferase-Test wurde dreifach durchgeführt.}

elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA)

Die 5'-biotinylierten Oligos 25 bp in der Länge von Peking erhalten Genomics Institute (BGI). Oligo-Sequenzen waren rs7560488 [T] Vorwärts: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Vorwärts: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Zum Glühen konzentrierte komplementären Oligonukleotiden bei einer 1.01 molaren Verhältnis gemischt und für 5 min bei 95 ° C inkubiert und dann über Stunden allmählich reduziert, bis die Oligonucleotide Raumtemperatur erreicht. Geglühten Oligos wurden zu einer Endkonzentration von 10 fmol verdünnt. Kernproteine ​​wurden aus BGC-823-Zellen extrahiert unter Verwendung der NE-PERTM Kern- und Cytoplasma-Extraktionsreagenzien (Pierce, Rock ford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Lightshift Chemiluminescent EMSA-Kit (Pierce /Thermo Fisher Scientific) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, wurden Bindungsreaktionen wie folgt durchgeführt: Kernextrakte (8 &mgr; g Protein) und 1 × Bindungspuffer mit 2,5% Glycerin, 5 mM MgCl 2, 50 ng /&mgr; l Poly (dI-dC), 0,05% NP-40 und 60 Biotin-markierte rs7560488 T /rs7560488 C Sonden auf Eis inkubiert wurden für 30 min in einem Volumen von 20 &mgr; l fmol. Für Kompetitionsstudien wurden Kernextrakte mit nicht-markiertem Oligonucleotid für 30 min vor der Zugabe des markierten Oligonukleotids inkubiert. Für einen Supershift wurde AP-1-Antikörper hinzugefügt (BOSTER, China). Komplexe wurden durch Elektrophorese auf 6% nativer PAGE in 0,5 × TBE-Puffer bei 110 V. Die Gele wurden getrennt übertragen Biodyne B vorgeschnittenen modifizierten Nylonmembranen (Pierce /Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung einer Trans-Blot SD halbtrockenen Transferzelle ( Bio-Rad Laboratories). Membranen wurden vernetzte (UVC-508 UV Vernetzer Ultra LUM) und das Signal wurde mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem (Pierce /Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.

Detektion von DNMT3A1 Transcripts durch quantitative RT-PCR (Q-PCR)

weiter um die Korrelation zwischen der DNMT3A1 mRNA-Spiegel und rs7560488 Polymorphismus, die 44 Magenkrebsgewebe mit verschiedenen Genotypen erkennen wurden Extraktion der gesamt-RNA unter Verwendung von Trizolreagenz unterworfen ( Invitrogen, Inc.). Die DNMT3A1 mRNA-Ebene wurde durch quantitative Echtzeit-PCR nach der reversen Transkription auf einem Prism 7900 Real-Time PCR-Maschine (Applied Biosystems, Foster City, CA) gemessen. β-Actin wurde als interne quantitative Kontrolle für jede Probe verwendet. Die Primer für die Amplifikation verwendet wurden DNMT3A1 F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'und R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; Die Primer für β-Actin wurden F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'und R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Relative Quantifizierung von DNMT3A1 mRNA wurde unter Verwendung der 2-ΔΔCT Methode berechnet, und jeder Test wurde dreifach durchgeführt.

Statistische Analysen

Alle Daten wurden mit analysiert SPSS
Version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Die Patienten und Kontrollen wurden unter Verwendung von im Vergleich Student t
-Test für kontinuierliche Variablen und Chi-Quadrat (χ2) Test für kategoriale Variablen. Allels und Genotyp Frequenzen zwischen Kontrolle und GC Probanden wurden mit dem Chi-Quadrat-Test erhalten, und die Standard-Güte-of-Fit-Test wurde verwendet, um die Hardy-Weinberg-Gleichgewicht zu testen. A P
Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Co-Lieferung von Doxorubicin und SATB1 shRNA durch Wärmeempfindliche Magnetic kationische Liposomen für Magenkrebs Therapy
• PLoS ONE: Klinische und prognostische Bedeutung von HIF-1α, PTEN, CD44v6 und Survivin für Magenkrebs: Eine Meta-Analyse