PLoS ONE: romanas Funkcinis TagSNP Rs7560488 į DNMT3A1 Rėmėjas yra susijęs su polinkiu į skrandžio vėžys, keičiant Rėmėjas Activity

Anotacija

DNR metiltransferazė (DNMT) -3a kuriame yra DNMT3A1 pervežimas ir DNMT3A2
izoformų buvo pasiūlyta suvaidinti lemiamą vaidmenį kancerogenezėje ir parodė netipiško išraišką daugeliu vėžio. Sukauptos įrodymai taip pat nurodė, kad vieno nukleotido polimorfizmas (SNP) in DNMT genų buvo susijęs su jautrumu įvairių navikų. Mes iškėlė hipotezę, kad genetiniai variantai DNMT3A1
rengėjas regionas yra susiję su skrandžio vėžio riziką. Mes pasirinkome tagSNPs iš HapMap duomenų bazėje Kinijos ir genotipą į atvejo-kontrolės tyrimo, siekiant įvertinti asociacijos skrandžio vėžiu (GC) A Kinijos gyventojų. Mes nustatė, kad funkcinis tagSNP rs7560488 T > C susijęs su žymiai padidėjusia rizika GC. in vitro
funkcionalus analizė liuciferazė reporterio testą ir EMSA nurodė, kad tagSNP rs7560488 T > C esmės pakeistos transkripcijos veiklą, DNMT3A1
geno per įtakoti kai kurių transkripcijos veiksnių privalomas, nors tam tikrą transkripcijos veiksnys išlieka būti nustatyta. Palyginti su TT homozigotas, dalykų, kurie buvo TC heterozigotų ir CC homozigotas eksponuojami sumažintą išraišką DNMT3A1
. Be to, sluoksninė analizė parodė, kad asmenys, kurie uosto TC arba CC genotipai mažiau nei 60 metų, buvo labiau linkusios į GC. Mūsų rezultatai rodo, kad genetiniai pokyčiai DNMT3A1
rengėjas prisidėti prie jautrumu GC ir taip pat suteikia įžvalgą, kad tagSNP rs7560488 T > C, gali būti perspektyvus biologinis prognozuoti GC genetinę jautrumą ir vertingą informaciją GC patogenezė

nurodomoji dalis:. Vu O Zhang K Gong p Qiao F Wang L Cui O et al. (2014) romanas Funkcinis TagSNP Rs7560488 į DNMT3A1 Rėmėjas yra susijęs su polinkiu į skrandžio vėžys, keičiant Rėmėjas veikloje. PLoS ONE 9 (3): e92911. Doi: 10,1371 /journal.pone.0092911

redaktorius: Xin-juanis Guan, Honkongo universitetas, Kinija

Įstojo: December 22, 2013; Priimta 27 vasario 2014 m Paskelbta: Kovo 25, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 VU et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (dotacijos Nr 81.171.915 ir Nr 91.229.107) ir Mokslinių tyrimų ir inovacijų plano kolegijos absolventų Jiangsu Province, China (dotacijos Nr CXZZ13_0082). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų Kinijoje, ypač Jiangsu provincijoje su didelis sergamumas ir mirtingumas [1], [2]. Jis gali plisti visoje skrandžio ir į kitus organus, įskaitant stemplės, plaučių, limfmazgių ar kepenų. Todėl, skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirties [3] pasaulyje. Atsižvelgiant į terapinį efektyvumą, chirurginis gali būti pirminis ją gydyti ankstesniame etape GC pacientų [4]. Deja, dauguma skrandžio vėžiu pacientams nustatytas pažengęs, kurių metu navikas yra Neoperuojamo nebėra. Be to, atkryčio po operacijos yra dar vienas baisus įvykis prasta 5 metų išgyvenamumas. Atsižvelgiant į tai, kad pacientams, sergantiems progresavusia arba pasikartojančių skrandžio vėžiu, tai nėra abejonių, kad atradimas biologinius žymenis ir jų taikymas kartu su tradiciniais diagnozė gali būti vertinga nuoroda ir platus padės suformuluoti prevencijos ir gydymo strategiją. Tačiau, iki šiol, buvo nustatyta nedaug išmatuojami biomarkeriai, kaip prognozuoti su GC pasikartojimo.

tumorigenezei yra žinoma, kad su daugiapakopiu procesu, kuris yra ne tik genetinių pakitimų rezultatas bet taip pat Epigenetiniai pokyčiai [5]. DNR metilinimas yra pagrindinė forma epigenetinio modifikacijos ir vaidina svarbų vaidmenį plėtojant, diferenciacija, genomo stabilumas, X-nukenksminti, ir spauda specifiniu reglamentavimu genų ekspresiją. Dažniausiai studijavo epigenetinius reiškinys DNR metilinimas, esminis reguliatorius transkripcijos ir chromatino struktūrą. Neįprastų DNR metilinimo modelius, esantys genetiškai neatsparių fone gali būti susijęs su padidėjusia rizika dėl žmogaus sutrikimų serijos [6], [7], įskaitant GC [8]. DNMT3A
kuriame yra DNMT3A1 parsisiųsti ir DNMT3A2
du de novo
DNR metiltransferazių vaidina lemiamą vaidmenį embriono vystymuisi ir nukrypusiu nuo normos DNR metilinimo į kancerogenezėje. Kai kurie DNMT3A pervežimas geno polimorfizmas gali reguliuoti genų ekspresiją, paveikti jo fermentinį aktyvumą ir gali prisidėti prie jautrumo vėžį. Sukauptos įrodymai molekulinės genetikos rodo, kad SNP DNMT
genų susiję su jautrumu vėžio [9], [10]. Naujausi progresuoja genomo asociacijos tyrime (GWAS) taip pat buvo nustatyti naujus jautrumą VNP-ai GC, kuri yra naudinga suprasti sukeliančiam mechanizmui genetinių variantų į GC plėtros [11] - [14]. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, funkcionalus SNP rs1550117 į DNMT3A
Vykdytojai, kurie gali padidinti jo transkripcijos veiklą ir prisidėti prie genetinį polinkį į skrandžio vėžio Kinijos gyventojų [15], [16].

GWAS davė daug SNP susijęs su daugeliu vėžio. Kai kuriais atvejais, dešimtys VNP-ai, vadinami tagSNPs kurios atstovauja SNP į genomo su dideliu šarnyro pusiausvyros pažeidimo regione gali nustatyti genetinės variacijos be genotipo kas SNP chromosomų regione, todėl tagSNPs yra naudingi sveikų genomo SNP asociacijos tyrimų, pavyzdžiui, prostatos, krūties, kiaušidžių, gaubtinės ir tiesiosios žarnos ir smegenų vėžio [17] - [19]. Šiame tyrime mes pasirinkote tagSNP rs7560488 iš HapMap duomenų bazę Kinijos dalykai įvertinti tarp genetinių variantų asociacijas DNMT3A1
rengėjas ir skrandžio vėžio rizika Kinijos gyventojų. Mes identifikuoti rizikos susijusios rs7560488 T >., C polimorfizmas yra DNMT3A1
promotorius, ir mūsų tolesnis darbas rodo, kad šis variantas galėtų pakeisti rengėjas veiklą ir sunaikinti privalomas gebėjimas transkripcijos veiksnių

medžiagos ir metodai

studijų dalykai

405 pacientai su histologiškai patvirtinta skrandžio vėžio ir 408 vėžiu nemokamai kontrolę buvo įdarbinti šiuo atvejo-kontrolės tyrimo, o tais atvejais ir kontrolės charakteristikos yra nurodyta 1 lentelėje bylose ir kontrolės buvo suderinta pagal amžių, lytį ir buvo pasirinktas iš pirmasis filialas ligoninės Nanjing medicinos universitete. Visi mėginiai buvo gauti raštišką sutikimą ir anonimiškai analizuojami. Šis tyrimas buvo atliktas su medicinos etikos komiteto medicinos mokyklos Pietryčių universiteto patvirtinimą.

TagSNP atranka ir TF įrišimas Svetainės Prognozė

Pagrindinė hipotezė grindžiama šis eksperimentas buvo, kad ten yra vienas ar daugiau SNP į DNMT3A1
promotoriaus regionuose, kurie yra susiję su skrandžio vėžio riziką. Priklausomai nuo jungties disbalansui (LD) struktūros, esant ypač lokuso, tagSNPs gali būti surogatai daugelį tūkstančių kitų VNP-ai. Mes teigiame, kad tokie tagSNPs taip pat gali žymėti iki šiol nustatytas SNP į DNMT3A1
rengėjas. Taigi, mes pasirinkome SNP į DNMT3A1
promotoriaus regione nepilnametis alelio dažnis (MAF) iš > 5% iš abiejų HapMap ir dbSNPs duomenų bazėse. Įgyvendinti potencialiai funkcinę tagSNP pasirinkimą, mes naudojame duomenis iš Tarptautinio HapMap ir laisvai žiniatinklio tagSNP atrankos įrankius pasirinkti tagSNPs ir naudoti TF-paieškos algoritmą (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH~~HEAD=dobj .html) prognozuoti rs7560488 transkripcijos faktorius (TF) prijungimo vietą.

DNR išskyrimo ir žmogiškųjų išteklių genotipo

Jei studijuoti DNMT3A1
promotorinės tagSNP rs7560488, genomo DNR buvo išskirta iš 1 ml periferiniame kraujyje iš pacientų ir sveikų asmenų ir buvo išgauta iš baltųjų kraujo kūnelių per savaitę po mėginio paėmimo iki proteinazės K virškinimą, kaip aprašyta anksčiau [20]. TagSNP rs7560488 buvo genotipą naudojant dsDNA dažų LC Žalia kartu su aukštos skiriamosios gebos lydymosi (HRM) analizę. Išsamiai, PCR pradmenys buvo suprojektuotas LightScanner gruntas projektavimo programinės įrangos (Aidahas technologija) (pirmyn Gruntas: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 "; Atvirkštinė gruntas: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3), kuris produktas vieno 208 bp fragmentas. Kiekvieną PGR reakcija iš pradžių buvo atliktas galutinis reakcijos tūrio 10 pL, naudojant 25 ng genominės DNR, 0.2 pmol kiekvieno gruntas, 0,8 mikrol, 2,5 mm dNTP, 1 pL 25 mM MgCl _{2, 1 pL 10 × Taq buferis su (NH4) 2SO tirpale 4, 0,4 U Taq DNR polimerazė ( "Fermentas"), 1 mikrol 1X LC žalią pliuso (Aidahas technologijos) ir 0,4 pL dimetil (DMSO). Reakcijos mišinys buvo inkubuojamas 95 ° C temperatūroje 5 min ir tada taikomos 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 30 sekundžių, 57 ° C temperatūroje 30 sek, ir 72 ° C temperatūroje 30 sek, o po to 72 ° C temperatūroje 7 min naudojant PTC-200 termociklerį (Bio-Rad). PGR reakcijos buvo perkeltas į 96-duobučių lėkštelėse (Bio-Rad) ir analizuojami šviesą Skeneriai (Aidahas technologijos). Fluorescencijos duomenys buvo surinkti per temperatūrų intervale nuo 70-97 ° C, ir lydymosi kreivė analizė buvo atlikta pagal gamintojo programinės įrangos. Žmogiškųjų išteklių valdymas gali tiesiogiai diskriminuoti dėl heterozygote (TC) ir homozigotos (CC arba TT) genotipų tagSNP rs7560488 T > C per lydalo nuskaitymo. Sumaišius homozigotinę DNR su vienodo dydžio žinomų PGR produktų (pvz, CC), tai dar labiau atskirti tarp BK ir TT genotipų. Dėl papildomos patvirtinimo, 5% mėginių iš kiekvienos aptiktą žmogiškųjų išteklių grupės buvo atsitiktinai atrinkti ir pateikti DNR sekos, siekiant užtikrinti patikimą ir atkuriamumas.}

Statybos liuciferazės Žurnalistė PLAZMID

Jei statyti DNMT3A1 tagSNP rs7560488 reporteris plazmidės, mes sustiprino 948 bp fragmento, nuo 25422345 iki 25422345 ir DNMT3A1
rengėjas regionas, kuriame yra T ir C alelio SNP PGR nuo genomo DNR. Apskaičiavimams naudoti PGR amplifikaoijos metu pradmenys buvo: (pirmyn: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', Reversas: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). PGR produktai buvo subklonuotas į NheI ir Hind III restrikcijos aikštelių pGL3-BASIC vektoriaus (Promega, Madison, WI). Mes patikrino visas rekombinantinius klonai DNR sekos.

Laikina transfekcijq ir dvejopo liuciferazės reporterio testą

Žmogaus skrandžio vėžys AGS ir BGC-823 ląstelės (ATCC) buvo auginami RPMI-1640 terpėje papildytas 10 % vaisiaus jaučio serumo (FBS) ir 1% penicilino /streptomicino tirpalas (10 000 U /ml ir 10 mg /ml, atitinkamai). MAA ir BGC-823 ląstelės (1 × 10 ^{5) buvo pasėjamos į 24 duobučių kultūros plokščių. Po 24 valandų kultūra, AGS, BGC-823 ląstelės buvo pernešta iki Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) 0,8 mg kiekvienam pastatytas vektoriumi, arba su T alelio arba C alelio. Tuo pačiu metu, 10 ng PRL-TK plazmidės (PROMEGA) per šulinio taip pat buvo pernešta kaip vidaus kontrolės ištaisyti transfekcijq efektyvumą. Prieš tai, ląstelės buvo pasėjamos dėl 24-duobučių lėkštelėse per naktį, siekiant užtikrinti 90% -95% santakoje, transfekciją metu. Dvidešimt keturias valandas po transfekciją, liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas Dvejopo liuciferazės reporterio testą sistemos (PROMEGA, Madison, WI, JAV) ir išreikštas Firefly liuciferazės santykis Renilla liuciferazės veiklą. Visos ląstelės buvo atliekamas tris kartus su tomis pačiomis sąlygomis. Buvo atlikti trys nepriklausomi transfekciją eksperimentai, ir kiekvienas liuciferazė tyrimas buvo atliktas tris kartus.}

elektroforeziniai Mobilumas "Shift Analizės (EJSA)

5'-Biotinilinta oligos 25 bp ilgio buvo gautos iš Pekino genomika institutas (BGI). Oligo sekos buvo rs7560488 [t] Persiųsti: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ", rs7560488 [t] Reversas: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3". rs7560488 [C] priekį: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] Reversas: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Atkaitinimo, koncentruotos papildomos oligonukleotidai, sumaišyta 01:01 moliniu santykiu ir inkubuojami 95 ° C temperatūroje 5 min ir tada palaipsniui mažinama valandas, kol oligonukleotidai iki kambario temperatūros. Atkaitintas oligos buvo praskiestas, kad galutinė koncentracija 10 fmol. Branduoliniai baltymai buvo paimti iš BGC-823 ląstelių naudojant NE-PERTM branduolinių ir citoplazmos Ištraukiamieji REAGENTAI (Pierce, akmens Ford IL, USA) pagal gamintojo instrukcijas. LightShift chemiliuminescencijos EJSA komplektas (Pierce /Thermo Fisher Scientific) buvo naudojama pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, įrišimo reakcijos buvo atliekamas taip: branduolinių ekstraktai (8 mikrogramai baltymo) ir 1 × privalomą buferį su 2,5% glicerolio, 5 mm MgCl2, 50 ng /mikrol poli (di-DC), 0,05% NP-40, ir 60 fmol Biotinas žymėto rs7560488 T /rs7560488 C zondai buvo inkubuojami ant ledo 30 min greičiu 20 pL tūrio. Dėl konkurencijos tyrimai, branduolinių ekstraktai prieš pažymėtą oligonukleotido to buvo inkubuojami su nežymėtu oligonukleotido 30 min. Dėl supershift, AP antikūnas 1 buvo įtraukta (BOSTER, Kinija). Kompleksai buvo atskirti elektroforezės gimtąja 6% PAGE 0,5 × TBE buferis 110 V gel buvo perkelti į BioDyne B anksto supjaustyti modifikuotų nailono membranomis (Pierce /Thermo Fisher Scientific), naudojant "Trans-dėmė SD pusiau sausas perdavimo langelį ( Bio-Rad Laboratories). Membranos buvo Tinkliniai (UVC-508 UV Kryžminis tiltelis, "Ultra LUM) ir signalas buvo aptiktas su cheminės liuminescencijos aptikimo sistemos (Pierce /Thermo Fisher Scientific) pagal gamintojo instrukcijas.

aptikimas DNMT3A1 nuorašai kiekybiniais RT-PCR (Q-PGR)

Jei dar aptikti tarp DNMT3A1 iRNR lygiui ir rs7560488 polimorfizmo ryšį, 44 skrandžio vėžiu audiniai, įvairių genotipų buvo atliktas gavybos visos RNR naudojant Trizol reagento ( Invitrogen, Inc). DNMT3A1 iRNR lygis buvo matuojamas kiekybiniais realaus laiko PGR po atvirkštinės transkripcijos ant Prizmė 7900 realiojo laiko PGR aparato (Applied Biosystems Foster City, Kalifornija). β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kiekybinės kiekvienam mėginiui. , Naudojami DNMT3A1 amplifikacijos pradmenys buvo F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'ir R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; už beta-aktino pradmenų F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'ir R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Santykinis kiekybinis DNMT3A1 mRNR buvo apskaičiuojamas naudojant 2-ΔΔCT metodą, ir kiekvienas tyrimas buvo atliekamas tris kartus.

Statistinės analizės

Visi duomenys buvo analizuojami su SPSS
versija 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). Pacientai ir kontrolė buvo palyginti naudojant Stjudento , T
-test nuolatinių kintamųjų ir chi kvadrato (χ2) testas kategorinių kintamųjų. Alelį ir genotipas dažniai tarp valdymo ir GC dalykų buvo gauti naudojant chi kvadrato testas, o standartinė gėrio-of-fit testas buvo naudojamas išbandyti Hardy-Weinberg pusiausvyrą. P
vertė mažesnė negu 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

Charakteristikos studijų dalykų

dažnio pasiskirstymas atvejų ir kontrolės yra pateikti 1 lentelėje, nebuvo reikšmingo skirtumo dažnių paskirstymo tarp atvejų ir kontrolės (p = 0.243 amžiui ir p = 0.355 seksui). Pacientų ir kontrolės vidurkis buvo 59,8 metai (svyravo 20~93 metų) ir 60,6 metai (svyravo 25~90 metų), atitinkamai. Nėra didelio skirtumo buvo rastas vidutinio amžiaus ir lyties, o tai rodo, kad atitiktį remiantis šių dviejų kintamųjų buvo adekvatus.

Kandidatas tagSNP atranka ir genotipo

Tarp kandidačių VNP-ai į DNMT3A1
, mes sutelktas į tagSNPs į DNMT3A1
rengėjo ir prognozavo savo galimybes funkciją privalomas transkripcijos veiksniai, kurie turi įtakos kokybinę ir kiekybinę išraišką DNMT3A1
. Mes pritaikė LD pagrindu tagSNP atrankos algoritmas (R ^{2≥0.80, MAF≥5%), kuris nustatė du tagSNPs atstovaujanti bendrą genetinį pokytį CHB gyventojų, įskaitant kandidato tagSNPsrs7560488 ir rs1550117 kuri yra funkcinė polimorfizmas, kurio metu keičiama jautrumas skrandžio vėžio mes patvirtino iki [15], [16]. TFSEARCH algoritmas prognozuoja, kad rs7560488 T sukuria privalomą svetainę AP-1 (1 pav.) Už genotipo mėginių žmogiškųjų išteklių ir sekos pagal ABI 3730 automatizuotas sequencer atitinkamai (2 paveikslas)}

TagSNP rs7560488 variantas, T >. C DNMT3A1 Rėmėjas žymiai padidina GC

genotipo paskirstymo rizika ir alelių dažniai rs7560488 pateikiami 2 lentelėje genotipas dažnių kontrolės nebuvo susitarusi su Hardy-Weinberg modelio (p = 0,274). Kaip parodyta 2 lentelėje, genotipas dažniai rs7560488 buvo 68,9%, 27,4%, o 3,7% už TT, TC, ir CC genotipus tarp atvejų ir 79,9%, 18,4%, o 1,7% tarp kontrolės, atitinkamai, tarp atvejais ir kontrolės skirtumas buvo statistiškai patikimas (p < 0,05). Be to, T alelio dažnis buvo žymiai mažesnis tarp atvejais, išskyrus kontrolės (82,6%, lyginant su 89,2%, p = 0,000). Be to, kartu TC /CC genotipo dažnis buvo didesnis tarp atvejais, išskyrus kontrolės (31,1%, lyginant su 20,1%, p = 0,002). Priimdama TT genotipą ir T alelio kaip nuoroda, mes nustatėme, kad variantas genotipai (TC ir CC) buvo susijęs su padidėjusia rizika GC (OR = 1.653, 95% PI = 1.194-2.287; p = 0,002). Be to, mes taip pat pastebėjo, kad C alelių dažniai buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei kontrolės (arba = 1.744, 95% PI = 1.310-2.321; p = 0,000). Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad TC ir CC genotipai buvo susiję su genetinis polinkis GC; DNMT3A
1 rs7560488 T alelių, gali būti spėjamas apsauginis alelis. Nebuvo jokių reikšmingų skirtingų dažniai rs7560488 GC at amžiaus > 60 metų, palyginti su ≤60 metų (p = 0,756), ir vyrų, palyginti su moterų (p = 0,459) (3 lentelė)

Asmenys Mažiau nei. 60 metų buvo labiau linkusios į skrandžio vėžio su tagSNP rs7560488 Variant T > C

Amžius ir lytis buvo svarbūs veiksniai naviko kancerogenezėje įskaitant skrandžio vėžio. Kai tyrimai buvo suskirstyti pagal amžių ir lytį pacientams, mes nustatėme, kad buvo stebimas reikšmingas ryšys, asmenys, vykdantys TC /CC genotipus buvo susiję su genetinį polinkį į GC tiek vyrų ir moterų grupėje. Todėl rs7560488 C alelis buvo reikšmingai padidėjo rizikos veiksnys lyginant su T alelio (4 lentelė). Daugiau stratifikacija įvertino rs7560488 T >asociacijas; C skrandžio vėžiu įvairiose amžiaus grupėse. TC /CC genotipai buvo susiję su genetinį polinkį į GC tuo amžiaus ≤60 metų (arba = 1,794, 95% PI = 1,118-2,877; p = 0,015), išskyrus vyresni nei 60, taip pat, mes taip pat pastebėjo, kad C alelių dažniai buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei kontrolės (arba = 1.720, 95% PI = 1.127-2.622; p = 0,011). Šie rezultatai rodo, kad TC ir CC genotipai buvo susiję su genetinis polinkis GC, ypač asmenims, ne daugiau kaip 60 metų (4 lentelė)

Apie rs7560488 T >., C variantas paveikia DNMT3A1 Transkripcinis Aktyvumas

Jei įvertinti biologinę funkcinį poveikį rs7560488 polimorfizmo apie DNMT3A1 transkripcijos, mes pastatytas liuciferazės reporteris vektorių (pGL3), apimanti 4.389.823 į 4.390.770 bazę nuo DNMT3A1
promotorius, su arba laukinio tipo (T alelio) arba mutantas tipas (C alelis) ir perkeltų juos į bgc-823, AGS ląstelės (3A pav.) Kaip parodyta Fig. 3B, mes nustatėme, kad transkripcija veikla T alelio buvo didesnis nei C alelio kartu su maždaug 2 kartus pirmiau dviejų ląstelių linijų, tai rodo, kad rs7560488 T alelis dirbo kaip skrandžio vėžio gynėja didinant DNMT3A1

apie rs7560488 T >., C Variant sumažina transkripcijos faktorius Affinity

atsižvelgiant tagSNP rs7560488 yra DNMT3A1
promotoriaus regione; mes iškėlė hipotezę, kad tai gali pakeisti privalomas transkripcijos faktorius (TF). Iš tiesų, naudojant TF-paieškos algoritmą (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html~~HEAD=dobj), mes prognozavo, kad rs7560488 T sukuria TF jungimosi vietos AP-1. Norėdami nustatyti, ar šis polimorfizmas turi įtakos privalomas gebėjimas transkripcijos veiksnio poveikį, mes atlikome Elektroforezinės mobilumas perjungimo tyrimą (EMSA) analizuoti oligo zondai, kurių sudėtyje yra arba T ar C alelio branduolinių baltymų, išgautų iš AGS ląstelių privalomi. Kaip parodyta Fig. 4A, konkretus perėjo DNR /Branduolinė baltymo kompleksas juosta buvo sukurtas abiejų C ir T alelių zondai (4 pav. A juostomis 2, 5). Tačiau, T alelis dar nebuvo visiškai konkurencingai slopinamas (4A Lane 4 pav.), Nors pasislinkę juosta buvo panaikinta 50-klosčių etiketės, C zondai (pav. 4A juostų 1), o tai rodo, kad surišimo aktyvumą sekos, kurių sudėtyje yra rs7560488 T alelis buvo stipresnis, palyginti su C alelio ir transkripcijos faktoriaus gali pirmenybė jungiasi prie T alelio, o ne C alelio. Be to, super-EJSA naudojant AP-1 antikūnas ne pažeisti atitinkamų biotino žymėto zondo /branduolinės baltymų supershift (pav. B 4 juostų 2, 5), nurodant, kad AP-1 gali ne transkripcijos faktorius, kuris prisiriša prie promotoriaus regione kuriame T ar C alelio. Šie rezultatai parodė, kad rs7560488 C alelis gali sumažinti branduolinės jungimosi su baltymais veiklą, nors poveikis neturi įtakos transkripcijos veiksnio AP-1.

asociacija tarp DNMT3A1rs7560488 polimorfizmas ir išraiškos Lygiai DNMT3A1
iRNR

keturiasdešimt keturi skrandžio vėžio audiniai, įvairių genotipų DNMT3A1 rs7560488 buvo rasti mūsų šio tyrimo. Dėl to, kad žemo dažnio CC genotipo, mes pridėtinės jį į mėginių su TC genotipo analizei. Kaip parodyta Fig. 5, ekspresijos lygis DNMT3A1 mRNR buvo mažesnis asmenims su TC arba CC genotipą nei tie, su TT genotipą (P < 0,05)

Diskusijos

genomo hipometilinimas ir propaguotojas hypermethylation yra. požymiai labai įvairių vėžio, prisidedančių prie Tumorigenesis ir DNR metilinimo vaidina pagrindinius vaidmenis reguliuojant genų ekspresiją ir išlaikyti genomo stabilumą [21], [22]. DNR metilinimas yra atliekamas DNR metiltransferazių (DNMTs) DNMT1
DNMT3B parsisiųsti ir DNMT3A
[23], [24]. de novo
metiltransferazių DNMT3A
yra labai išreikštas per ankstyvas embriono vystymasis ir žemyn reguliuojama daugeliu skirtingų somatinių ląstelių [25]. Iš vaidmuo DNMT3A
žmogaus vėžio buvo pabrėžta ataskaitų DNMT3A
mutacijų maždaug 20% ​​pacientų, sergančių ūmine mieloleukemija [26], [27]. Šių mutacijų tarpusavyje susijusių su riboto fermentinį aktyvumą ir genomo regionuose, kuriuose įvykis sumažėjo metilinimas. DNMT3A
mutacijos taip pat buvo nustatyta 8% pacientų, sergančių mielodisplaziniu sindromas [28]. DNMT3A
taip pat vaidina svarbų vaidmenį epigenetinio nuslopinami ir kraujodaros kamieninių ląstelių (SSK) reguliavimo genai ir sudaryti sąlygas efektyviai diferenciaciją [29].

DNMT3A
genomo lokuso gamina du protokolus dėl kurių kilo dviejų baltymų, tuo ilgiau, DNMT3A1 parsisiųsti ir trumpesnis, DNMT3A2
, kurios skiriasi tuo, kad 219-aminorūgščių amino (N) -terminal uodega būna tik DNMT3A1
[30], [31]. N-galinio domeno DNMT3A1
vadinama "reguliavimo" domenas, nes ji neturi fermentų DNR metiltransferazei veiklą. Šis domenas nepriklauso tą didelę homologiją su bet kuriuo kitu žinomu baltymų. DNMT3A1
sukoncentruota heterochromatin, kuri yra laikoma transkripciškai tyli, ir visų pirma veikia kaip transkripcijos represijų [30]. Tačiau kitų tyrimų parodė, kad DNMT3A1
buvo efektyviai įdarbinti Tyliųjų Oct3 /4 ir aktyvuota vitronektinas (Vtn) genas rengėjus per savo unikalaus N-galinio domeno [32].

Buvo pranešta, kad genetiniai pokyčiai DNMT3A
geno prisidėti prie kancerogenezėje ypač susijusių su GC [15], [33] - [36]. Tada siūloma toliau tirti tarp VNP-ai ir pritaikymo reglamentą savo tikslo genų santykius. Bet išsiaiškinti biologinį funkciją kiekvienam SNP dažnai reikia daug laiko, molekulinės biologijos eksperimentus. Taigi, analizuojant daug SNP, susijusius su konkrečiu lokuso praktikoje reikalauja sistemingo bioinformatikos vertinimą ir prioritetų susiaurinti galimų funkcinių kandidačių variantų rinkinį. Kadangi dauguma VNP-ai yra LD, kad haplotipas pagrindu asociacijos tyrimai yra laikomi galingesnis nei vieno SNP analizę, siekdama nustatyti priežastinius genetinius variantus pagrindines sudėtingų ligų, tokių kaip vėžys etiologiją [37], be to, tagSNPs naudojimas, kad užfiksuoti dauguma haplotypic įvairovės asociacijos tyrimų buvo pasiūlyta [38]. Nors GWAS davė daug SNP ar tagSNPs reikšmingai susijęs su vėžiu, dauguma tagSNPs randama nebaltyminės kodavimo regionuose (intergenic ir INTRON regionai), nustatyti jų funkcinius ir /ar priežastinius variantus turi svarbų apribojimą GWAS duomenų aiškinimo, nepaisant priskiriant spėjamą funkcionalumą su daugeliu kitų GWAS tagSNPs buvo tik sėkmingas, kai gerai kartografavimo aplink žinomą rizikos regione buvo atliktas [39] - [41].

Šiame tyrime mes pažymėtus tariamą funkcinius tagSNP rs7560488 kuris gali atstovauti SNP iš DNMT3A1
rengėjas aukštos šarnyro pusiausvyros pažeidimo, tai yra įmanoma nustatyti genetinės variacijos be genotipo kiekvieną SNP DNMT3A1
promotoriaus regione ir pagerinti asociacijos efektyvumą. Mes pastebėta, kad tiriamieji, vežantys tagSNP rs7560488 TP genotipus eksponavo žymiai sumažino skrandžio vėžio riziką, palyginti su asmenimis, su TC ar CC genotipą, nurodant, kad alelis T yra apsauginis poveikis potencialiai eksponuojami šio tagSNP. Be to, tyrimai mes atliekame pateikė daugiau įrodymų, kad TC ir CK genotipas susijęs su sumažėjusiu raiškos lygį DNMT3A1
mRNR skrandžio vėžio audiniuose, rezultatai rodo, kad DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T >C polimorfizmas gali reguliuoti išraišką DNMT3A1 parsisiųsti ir tokiu būdu prisidėti prie GC jautrumo. Šie duomenys taip pat parodė, kad DNMT3A1 gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio progresavimą, tačiau ši išvada turi būti patvirtinta didesniu gyventojų tyrimas. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita, o tai rodo, kad DNMT3A1
transkripcija yra tiesiogiai įtakoja funkcines tagSNP rs7560488 yra DNMT3A1
rengėjas regionas ir tagSNP rs7560488T > C yra susijęs su žymiai padidėjo rizika GC. Be to, mes atliko EMSA eksperimentą išanalizuoti biologinių pasekmių tagSNP rs7560488 polimorfizmo į BGC-823 ląstelių. Tiek T alelis ir C alelių zondai parodė dvi gelis poslinkio juostas, tačiau konkurencijos eksperimentai parodė jungimosi afinitetą su branduolinių baltymus T alelis zondo variantas buvo didesnis nei matė su C alelis zondo kolega. Taigi sustiprintas DNR su baltymais gebėjimas T alelių, gali būti atsakingas už padidėjimas DNMT3A1
promotoriaus veiklos, kad mes pastebėtas mūsų promotoriaus analizei. Super EJSA eksperimentas naudojamas ne gavo super gelis perėjimas nurodė, kad transkripcijos veiksniai AP-1 negali apimti į transkripcijos kompleksų formavimas prie tagSNP rs7560488 svetainėje AP 1 antikūnai. Kitas romanas rezultatas ateina iš tarp amžiaus ir rs7560488 T >asociacijos C polimorfizmas yra sluoksninė analizės reiškė, kad mažiau nei 60 metų, buvo labiau linkusios į skrandžio vėžio su tagSNP rs7560488 T > C. Tikėtina, kad DNMT3A1
įtakos transkripcijos konkrečių genų ypač pokyčiai ir tam tikrų genų padidinti GC riziką. Šie rezultatai taip pat rodo, kad stipresnis rizikos veiksnys GC yra tagSNP rs7560488 T > C, ypač jauno amžiaus

Kartu paėmus, šis tyrimas suteikia pirmą mechaniškai įžvalgų, kaip šis romanas funkciniai tagSNP rs7560488 T >. C variantas yra reikšmingai susijęs su rizika skrandžio vėžio Kinijos populiacijos. Mes nustatėme, kad T C kaitai esmės pakeistos transkripcijos veiklą, DNMT3A1
genas per įtakoti kai kurių transkripcijos veiksnių privalomas ir taip pakeisti DNMT3A1 raiškos lygis, nors neabejotinas transkripcijos veiksnių išlieka būti nustatyta. Mūsų išvados pateikti įžvalgą, kad DNMT3A1
rengėjas rs7560488 T >., C variantas yra perspektyvus biologinis įvertinti gyventojų imlų GC ir suteikti vertingos informacijos link būsimos mokslinių tyrimų skrandžio vėžio patogenezės

Padėka

Mes dėkojame profesoriui Yaping Wang, Dr. Zhenming Cai Lili Cao (Nanjing University, Nanjing, Kinija) ir Zhenghao Zhang (Pietryčių universitetas, Nanjing, Kinija) už HRM genotipo.

• PLoS ONE: Bendro Pristatymas doksorubicino ir SATB1 shRNR iki šilumai magnetinio katijoninių liposomos skrandžio vėžio gydymo
• PLoS ONE: Klinikiniai ir prognostinis reikšmė HIF-1α, PTEN, CD44v6 ir Survivin skrandžio vėžiu: metaanalizė