PLoS ONE: A Novel Functionele TagSNP Rs7560488 in de DNMT3A1 Promoter wordt geassocieerd met gevoeligheid voor maagkanker door het moduleren Promotor Activity

Abstract

DNA-methyltransferase (DNMT) 3a die DNMT3A1 Kopen en DNMT3A2
isovormen zijn voorgesteld om een ​​cruciale rol spelen bij het ontstaan ​​van kanker en toonde afwijkende expressie bevat in kanker. Geaccumuleerde bewijzen ook aangegeven dat single nucleotide polymorfismen (SNP) in DNMT genen geassocieerd met gevoeligheid voor verschillende tumoren. Onze hypothese was dat genetische varianten in de DNMT3A1
promotorregio worden geassocieerd met de maag risico op kanker. Wij selecteerden de tagSNPs uit de HapMap databank voor de Chinese en genotype in een case-control studie naar de associatie met maagkanker (GC) in een Chinese bevolking te evalueren. We identificeerden dat de functionele tagSNP rs7560488 T > C geassocieerd met een significant verhoogd risico op GC. In vitro
functionele analyse door luciferase reporter assay en EMSA aangegeven dat het tagSNP rs7560488 T > C wezenlijk is veranderd transcriptie-activiteit van DNMT3A1
gen via het beïnvloeden van de binding van een aantal transcriptiefactoren, hoewel een definitieve transcriptie factor moet nog worden vastgesteld. In vergelijking met de TT homozygoten, onderwerpen die TC heterozygoten waren en CC homozygoten vertoonden een verminderde expressie van de DNMT3A1
. Bovendien, gelaagde analyse toonde aan dat mensen die TC haven of CC genotypes minder dan 60 jaar oud waren meer vatbaar voor GC. Onze resultaten suggereren dat de genetische variaties in de DNMT3A1
promoter bijdragen aan de gevoeligheid voor GC en ook inzicht dat tagSNP rs7560488 T > C kan een veelbelovende biomarker voor het voorspellen GC genetische gevoeligheid en waardevolle informatie gC pathogenese

Visum:. Wu H, Zhang K, Gong P, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) A Novel Functionele TagSNP Rs7560488 in de DNMT3A1 Promoter wordt geassocieerd met gevoeligheid voor maagkanker door het moduleren Promotor Activity. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10.1371 /journal.pone.0092911

Editor: Xin-Yuan Guan, de Universiteit van Hong Kong, China

Ontvangen: 22 december 2013; Aanvaard: 27 februari 2014; Gepubliceerd: 25 maart 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81171915 en nr 91229107) en het Wetenschappelijk Onderzoek en Innovatie Plan voor afgestudeerden van de provincie Jiangsu, China (Grant No. CXZZ13_0082). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren in China, vooral in de provincie Jiangsu met een hoge incidentie en mortaliteit [1], [2]. Het kan verspreiden in de maag en andere organen, zoals de slokdarm, longen, lymfeknopen en lever. Daarom maagkanker is de tweede leidende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de [3] wereld. Gezien de therapeutische efficiëntie kan chirurgische resectie primaire curatieve behandeling vroeger GC patiënten [4] zijn. Helaas zijn de meeste patiënten met maagkanker ontdekt in een vergevorderd stadium, gedurende welke periode de tumor zijn inoperabele meer. Bovendien terugval na de operatie is een andere vreselijke gebeurtenis voor een slechte 5-jaarsoverleving. Gezien de patiënten met gevorderde of recidiverende maagkanker, is het geen twijfel dat de ontdekking van biomarkers en hun toepassing gepaard met traditionele diagnose een waardevolle indicatie en een uitgebreide hulp voor de preventie en behandeling strategie te formuleren zou kunnen zijn. Echter, tot nu toe weinig meetbare biomarkers voor het voorspellen GC herhaling geïdentificeerd.

Tumorgenese bekend een werkwijze van meerdere stappen, die het gevolg is van niet alleen genetische veranderingen maar zijn ook epigenetische veranderingen [5]. DNA methylatie is een belangrijke vorm van epigenetische modificatie en speelt een essentiële rol in de ontwikkeling, differentiatie, genoomstabiliteit, X-inactivatie en imprinting specifieke regulatie van genexpressie. De meest bestudeerde epigenetische verschijnsel DNA-methylatie, een essentiële regulator van transcriptie en chromatinestructuur. Afwijkende DNA methylatie patronen in een genetisch gevoelige background worden geassocieerd met een verhoogd risico op een aantal menselijke aandoeningen [6], [7], met inbegrip van GC [8]. DNMT3A
die bevat DNMT3A1 Kopen en DNMT3A2 Wat zijn twee de novo
DNA-methyltransferase speelt een cruciale rol in de embryonale ontwikkeling en afwijkende DNA-methylatie in carcinogenese. Sommige polymorfismen van de DNMT3A
gen genexpressie reguleren, beïnvloeden de enzymatische activiteit en kan bijdragen aan de gevoeligheid voor kanker. Geaccumuleerde bewijzen in moleculaire genetica aan dat SNP in DNMT
genen zijn geassocieerd met gevoeligheid voor kanker [9], [10]. Recente vooruitgang in genoom-brede associatiestudie (GWAS) ook geïdentificeerd nieuwe SNPs gevoeligheid voor GC, wat handig is om het onderliggende mechanisme van genetische variaties begrijpen de ontwikkeling van GC [11] - [14]. Onze vorige studie bleek een functioneel SNP rs1550117 in DNMT3A
promotor die de transcriptie-activiteit kan verhogen en bijdragen aan de genetische gevoeligheid voor maagkanker in een Chinese bevolking [15], [16].

GWAS heeft verschillende SNPs geassocieerd met verschillende kankers opgeleverd. In sommige gevallen, tientallen SNPs, genaamd tagSNPs die SNPs in een gebied van het genoom met hoge verbindingsevenwichtsafwijking vertegenwoordigen kunnen genetische variatie wijzen zonder genotypering elke SNPs in een chromosomaal gebied, zodat tagSNPs bruikbaar geheel-genoom SNP associatiestudies, zoals prostaat-, borst-, eierstok-, colorectale en hersentumoren [17] - [19]. In de huidige studie, hebben we gekozen voor een tagSNP rs7560488 uit de HapMap databank voor Chinese onderdanen naar de associaties tussen de genetische varianten in de evaluatie van de DNMT3A1
promotor en maag risico op kanker in een Chinese bevolking. We identificeerden een risico verbonden rs7560488 T >. C polymorfisme in de DNMT3A1
promotor, en onze verdere werkzaamheden gesuggereerd dat deze variant de promotor activiteit kunnen veranderen en vernietigen van de bindend vermogen van transcriptiefactoren

materialen en methoden

proefpersonen

Een totaal van 405 patiënten met een histologisch bevestigde maagkanker en 408 kanker-vrije controles werden gerekruteerd in deze case-control studie, en de kenmerken van de patiënten en controles zijn in tabel 1. de zaken en controles werden geëvenaard door leeftijd, geslacht en werden geselecteerd uit de First Affiliated Hospital van Nanjing Medical University. Alle monsters werden verkregen met schriftelijke toestemming en anoniem geanalyseerd. Deze studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van het Medisch Ethische Toetsingscommissie van Medical School van Southeast University.

TagSNP Selection en de TF Binding Site Prediction

De belangrijkste hypothese ten grondslag liggen aan dit experiment was dat er één of meer SNPs in de DNMT3A1
promotergebieden die worden geassocieerd met het risico op maagkanker. Afhankelijk van de verbindingsevenwichtsafwijking (LD) structuur op een specifieke locus, kunnen tagSNPs surrogaten voor vele duizenden andere SNPs zijn. We postuleren dat dergelijke tagSNPs waarschijnlijk ook enige tot dusver geïdentificeerde SNPs tag in de DNMT3A1
promotor. Zo hebben we de SNPs geselecteerd in de DNMT3A1
promoter regio met een kleinere allel frequentie (MAF) van > 5% ten opzichte van zowel de HapMap en dbSNPs databases. Voor de uitvoering van potentieel functionele tagSNP selectie, maken we gebruik van gegevens van de International HapMap en de vrij webgebaseerde tagSNP selectie tools waarmee tagSNPs te selecteren, en gebruik de TF-zoekalgoritme (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH .html) naar rs7560488 transcriptiefactor (TF) bindingsplaats voorspellen.

DNA Extraction en HRM Genotypering

om de studie van de DNMT3A1
promotor tagSNP rs7560488, genoom-DNA werd geïsoleerd uit 1 ml perifeer bloed van patiënten en gezonde individuen en werd geëxtraheerd uit witte bloedcellen binnen een week na de monsterneming door proteinase K digestie zoals eerder beschreven [20]. TagSNP rs7560488 werd gegenotypeerd met de dsDNA kleurstof LC Green in combinatie met hoge resolutie Melting (HRM) analyse. In detail werden de PCR primers door de LightScanner primer design software (Idaho Technology) (voorwaartse primer: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 ', reverse primer: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3'), welk product een 208 bp fragment. Elke PCR-reactie werd aanvankelijk uitgevoerd in een uiteindelijk reactievolume van 10 pl, met behulp 25 ng genomisch DNA, 0,2 pmol van elke primer, 0,8 pl 2,5 mM dNTP, 1 ul 25 mM MgClz _{2, 1 pl 10 x Taq buffer met (NH4) 2SO 4, 0,4 U Taq DNA polymerase (Fermentas), 1 ui 1X LC Green PLUS (Idaho Technology) en 0,4 pl dimethylsulfoxide (DMSO). Het reactiemengsel werd geïncubeerd bij 95 ° C gedurende 5 min en vervolgens onderworpen aan 40 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 57 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 seconden, gevolgd door 72 ° C gedurende 7 min met behulp een PTC-200 thermische cycler (Bio-Rad). De PCR reacties werden overgebracht naar 96-well platen (Bio-Rad) en geanalyseerd op de Light Scanner (Idaho Technology). Fluorescentie gegevens werden verzameld over een temperatuurbereik van 70-97 ° C en smeltcurve analyse werd uitgevoerd volgens de software van de fabrikant. HRM kan rechtstreeks discrimineren de heterozygote (TC) en homozygote (CC of TT) genotypen van tagSNP rs7560488 T > C door middel van smelt scannen. Na mengen homozygoot DNA met evenveel bekende PCR-producten (bijvoorbeeld CC), verder onderscheid gemaakt tussen de CC en TT genotypes. Voor nadere bevestiging, werden 5% van de monsters van elk gedetecteerd door HRM groep willekeurig geselecteerd en onderworpen aan DNA-sequencing om betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.}

De bouw van Luciferase Reporter Plasmid

Om de DNMT3A1 tagSNP construeren rs7560488 reporter plasmide, we versterkt de 948 bp fragment 25.422.345-25.422.345 van DNMT3A1
promoter regio, die de T en C allel van SNP met PCR uit genoom DNA bevat. De primers die voor de PCR amplificaties waren: (Forward: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', reverse: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). De PCR-producten werden gesubkloneerd in de NheI en HindIII restrictieplaatsen van de vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI). We controleerde alle recombinant-klonen door middel van DNA-sequencing.

transiënte transfectie en Dual Luciferase Reporter Assay

Human maagkanker AGS en BGC-823-cellen (ATCC) werden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10 % foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline /streptomycine-oplossing (10 000 U /ml en 10 mg /ml, respectievelijk). AGS en BGC-823 cellen (1 x 10 ^{5) werden gezaaid in 24-well kweekplaten. Na 24 uur kweken werden AGS, BGC-823 cellen getransfecteerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) met 0,8 mg van elk geconstrueerde vector, hetzij met T-allel of allel C. Tegelijkertijd werd 10 ng pRL-TK plasmiden (Promega) per putje getransfecteerd ook als een interne controle voor transfectie-efficiëntie corrigeren. Voordat het werden cellen gezaaid op 24-putjes platen overnacht bij 90% -95% confluentie garanderen op het moment van transfectie. Vierentwintig uur na transfectie werd luciferaseactiviteit gemeten met de Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) en uitgedrukt als de verhouding van vuurvlieg luciferase activiteiten Renilla. Alle cellen werden in triplo uitgevoerd onder dezelfde voorwaarden. Drie onafhankelijke transfectie-experimenten werden uitgevoerd, en elke luciferase assay werd in drievoud uitgevoerd.}

elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA)

De 5'-gebiotinyleerde oligo's 25 bp lang werden verkregen van Beijing genomics Institute (BGI). Oligo sequenties waren rs7560488 [T] Forward: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Forward: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Gloeien, geconcentreerd complementaire oligonucleotiden werden gemengd in een 01:01 molaire verhouding en geïncubeerd bij 95 ° C gedurende 5 min en vervolgens langzaam afgebouwd uur tot de oligonucleotiden op kamertemperatuur. Gehechte oligo's werden verdund tot een uiteindelijke concentratie van 10 fmol. Nucleaire eiwitten werden geëxtraheerd uit BGC-823 cellen met behulp van de NE-PERTM nucleaire en cytoplasmatische Extraction reagentia (Pierce, Rock-ford, IL, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De LightShift Chemoluminescente EMSA kit (Pierce /Thermo Fisher Scientific) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. kernextracten (8 ug eiwit) en 1 x bindingsbuffer met 2,5% glycerol, 5 mM MgCl2, 50 ng /pl poly (dI-dC), 0,05% NP-40 en 60: Kort gezegd werden bindingsreacties als volgt uitgevoerd fmol-biotine gelabelde rs7560488 T /C rs7560488 probes werden geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten in een volume van 20 pl. Voor competitie studies werden nucleaire extracten geïncubeerd met ongelabeld oligonucleotide gedurende 30 minuten vóór de toevoeging van gemerkte oligonucleotide. Een supershift werd AP-1 antilichaam (Boster, China) toegevoegd. Complexen werden gescheiden door elektroforese op inheemse 6% PAGE in 0,5 x TBE buffer bij 110 V. De gels werden overgebracht naar Biodyne B voorgesneden gemodificeerde nylon membranen (Pierce /Thermo Fisher Scientific) met een Trans-Blot SD semi-droge overdracht cel ( Bio-Rad Laboratories). Membranen werden verknoopt (UVC-508 UV verknoper, Ultra LUM) en het signaal werd gedetecteerd met een chemiluminescent detectiesysteem (Pierce /Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant.

Detectie van DNMT3A1 transcripten door kwantitatieve RT-PCR (Q-PCR)

de correlatie tussen de DNMT3A1 mRNA en rs7560488 polymorfisme verder detecteren, de 44 maagkanker weefsels met verschillende genotypen werden onderworpen aan extractie van het totale RNA met behulp van Trizol Reagent ( Invitrogen, Inc.). De DNMT3A1 mRNA werd gemeten met behulp van kwantitatieve real-time PCR na reverse transcriptie een Prism 7900 Real-Time PCR machine (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-actine werd gebruikt als een interne kwantitatieve controle voor elk monster. De primers die voor amplificatie werden DNMT3A1 F: 5'- GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'en R: 5'- GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; de primers voor β-actine waren F: 5'- GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'en R: 5'- AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Relatieve kwantificatie van DNMT3A1 mRNA werd berekend met behulp van de 2-ΔΔCT methode, en elke test werd uitgevoerd in drievoud.

Statistische analyses

Alle gegevens werden geanalyseerd met SPSS
versie 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Patiënten en controles werden vergeleken met behulp van Student's t
-test voor continue variabelen en chi-kwadraat (χ2) test voor categorische variabelen. Allel en genotype frequenties tussen controle en GC proefpersonen werden verkregen onder toepassing van de chi-kwadraat test en standaard-goedheid van fit-test werd gebruikt om de Hardy-Weinberg-evenwicht getest. Een P
waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Kenmerken van proefpersonen

De frequentieverdeling van de gevallen en controles zijn in tabel 1, was er geen significant verschil in de frequentieverdeling tussen patiënten en controles (P = 0,243 voor leeftijd en P = 0,355 voor seks). Het gemiddelde van de patiënten en controles was 59,8 jaar (range 20~93 jaar) en 60,6 jaar (range 25~90 jaar), respectievelijk. Werd geen significant verschil gevonden in de gemiddelde leeftijd en geslacht, wat erop wijst dat matching op basis van deze twee variabelen was voldoende.

Kandidaat tagSNP Selectie- en genotypering

Onder de kandidaat-SNPs in DNMT3A1
, hebben we ons gericht op de tagSNPs in de promotor van DNMT3A1
en voorspelde hun mogelijke functie over bindende transcriptiefactoren, waarvan de kwalitatieve en kwantitatieve expressie van de DNMT3A1
beïnvloeden. We pasten een LD-gebaseerde tagSNP selectiealgoritme (r ^{2≥0.80, MAF≥5%), waarbij die twee tagSNPs die gemeenschappelijke genetische variatie in CHB populatie, inclusief de kandidaat tagSNPsrs7560488 en rs1550117 die een functioneel polymorfisme dat wijzigt gevoeligheid bij maagkanker we bevestigd vóór [15], [16]. TFSEARCH algoritme voorspelde dat rs7560488 T creëert een bindingsplaats voor AP-1 (Figuur 1). De monsters voor genotypering van HRM en sequencing door ABI respectievelijk 3730 geautomatiseerde sequencer (figuur 2)}

TagSNP rs7560488 Variant T >. C in DNMT3A1 Promoter aanzienlijk verhoogt het risico op de GC

Het genotype uitkeringen en allelfrequenties van rs7560488 zijn weergegeven in Tabel 2. de genotype frequenties in de controles waren in overeenstemming met de Hardy-Weinberg model (P = 0,274). Zoals getoond in Tabel 2, de genotype frequenties van rs7560488 waren 68,9%, 27,4% en 3,7% voor de TT, TC en CC genotypen tussen de gevallen en 79,9%, 18,4% en 1,7% bij de controles, respectievelijk het verschil tussen de patiënten en controles was statistisch significant (P < 0,05). Bovendien, het T allel frequentie was significant lager bij gevallen dan controles (82,6% versus 89,2%, p = 0,000). Bovendien, de gecombineerde TC /CC genotype vaker voordeden bij gevallen dan controles (31,1% versus 20,1%, p = 0,002). Bij het nemen TT genotype en allel T als referentie, vonden we dat de variant genotypen (TC en CC) geassocieerd met een verhoogd risico op GC (OR = 1,653, 95% Cl = 1,194-2,287; P = 0,002). Evenzo we waargenomen dat het C allel frequenties was statistisch significant hoger dan controles (OR = 1,744, 95% Cl = 1,310-2,321; P = 0,000). Tezamen suggereren deze gegevens dat de TC CC genotypes geassocieerd met de genetische gevoeligheid voor GC; de DNMT3A
1 rs7560488 T-allel kan een vermeende beschermende allel zijn. Er waren geen significante verschillende frequenties van rs7560488 in GC op leeftijd > 60 jaar versus ≤60 jaar (P = 0,756), en mannelijke versus vrouwelijke (P = 0,459) (tabel 3)

Individuen Minder dan. 60 jaar oud waren meer vatbaar voor maagkanker met tagSNP rs7560488 Variant T > C

Leeftijd en geslacht zijn belangrijke factoren in de tumor carcinogenese inclusief maagkanker. Wanneer de analyses werden gestratificeerd naar geslacht en leeftijd van de patiënten, vonden we dat significant verband werd waargenomen, individuen die TC /CC genotypes geassocieerd met de genetische gevoeligheid voor GC zowel mannelijke als vrouwelijke groep. Daarom rs7560488 C allel was significant verhoogd risicofactor opzichte T allel (Tabel 4). Verdere stratificatie evalueerde de vereniging van rs7560488 T > C met maagkanker in verschillende leeftijden. TC /CC genotypes werden in verband gebracht met de genetische gevoeligheid voor GC op de leeftijd range ≤60 jaar (OR = 1,794, 95% CI = 1,118-2,877; P = 0,015) dan ouder dan 60 jaar, op dezelfde manier, zagen we ook dat de C allel frequenties was statistisch significant hoger dan de controlegroep (OR = 1,720, 95% CI = 1,127-2,622; P = 0,011). Deze resultaten suggereerden dat de TC CC genotypes geassocieerd met de genetische gevoeligheid voor GC, met name bij personen niet meer dan 60 jaar (Tabel 4)

De rs7560488 T >. C Variant invloed DNMT3A1 transcriptieactiviteit

Om de biologische functionele effect van rs7560488 polymorfisme op DNMT3A1 transcriptie evalueren, gebouwd we luciferase reporter vectoren (pGL3), verspreid over de 4389823-4.390.770 uitvalsbasis DNMT3A1
promotor, met ofwel wild-type (T-allel) of mutant type (C allel) en getransfecteerd ze in BGC-823, AGS cellen (Figuur 3A). Zoals getoond in Fig. 3B, vonden we dat de transcriptie activiteit van T allel hoger dan C allel met een ongeveer 2-voudig hierboven twee cellijnen, wat suggereert dat rs7560488 T allel werkte als verdediging voor maagkanker door het verhogen van de transcriptie van DNMT3A1

de rs7560488 T >. C Variant Verzwakt transcriptiefactor Affinity

in het licht van tagSNP rs7560488 ligt in de DNMT3A1
promoter regio; Wij veronderstelden dat het binding van transcriptiefactor (TF) kan worden gewijzigd. Inderdaad, met de TF-zoekalgoritme (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), we voorspelden dat rs7560488 T wordt een TF bindingsplaats voor AP-1. Om te bepalen of dit polymorfisme een effect heeft op bindingsvermogen van de transcriptiefactor, voerden we de elektroforetische mobiliteit verschuiving assay (EMSA) de binding van oligo probes die ofwel T of C allel aan kerneiwitten uit het AGS cel te analyseren. Zoals getoond in Fig. 4A, een specifiek verschoven DNA /nucleaire eiwitcomplex band werd gegenereerd door zowel C en T allel probes (Fig. 4 A lanen 2, 5). Echter, T allel nog niet volledig concurrerend geremd (Fig. 4A laan 4), maar de verschoven band werd afgeschaft door 50-voudig ongelabelde C probes (Fig. 4A laan 1), suggereert dat de bindingsactiviteit van de sequentie die rs7560488 T allel was sterker vergeleken met C-allel en de transcriptiefactor zouden preferentieel binden aan het T-allel in plaats van C allel. Bovendien super-EMSA behulp AP-1 antilichaam geen supershift van de biotine gelabelde probe /nucleair eiwit veroorzaakt (fig. 4 B laan 2, 5) dat de AP-1 mogen de transcriptiefactor die bindt aan het promotorgebied met het T of C allel. Deze resultaten gaven aan dat rs7560488 C allel het nucleaire eiwit bindende activiteit kan verlagen, hoewel het effect niet wordt beïnvloed door de transcriptiefactor AP-1.

Associatie tussen DNMT3A1rs7560488 polymorfisme en de expressie van DNMT3A1
mRNA

vierenveertig maagkanker weefsels met verschillende genotypen van DNMT3A1 rs7560488 waren beschikbaar in onze huidige studie. Vanwege de lage frequentie van CC genotype voegden we het in de monsters met TC genotype voor analyse. Zoals getoond in Fig. 5, de expressie van DNMT3A1 mRNA was lager bij personen met TC of CC genotype dan bij degenen met een TT-genotype (P < 0,05)

Discussie

Genoombrede hypomethylatie en promotor hypermethylering zijn. kenmerken van een grote verscheidenheid van kanker dragen aan tumorvorming en DNA methylering speelt een belangrijke rol bij het reguleren van genexpressie en handhaven genoomstabiliteit [21], [22]. DNA-methylatie wordt uitgevoerd door DNA-methyltransferase (DNMTs) DNMT1
, DNMT3B Kopen en DNMT3A
[23], [24]. De de novo
methyltransferases DNMT3A
zijn sterk uitgedrukt tijdens de vroege embryonale ontwikkeling en down-gereguleerd in de meeste gedifferentieerde somatische cellen [25]. De rol van de DNMT3A
in kanker bij de mens werd benadrukt door rapporten van de DNMT3A
mutaties in ongeveer 20% van de patiënten met acute myeloïde leukemie [26], [27]. Het optreden van deze mutaties gecorreleerd met verminderde enzymatische activiteit en genomische regio met verminderde methylering. DNMT3A
mutaties werden ook geïdentificeerd in 8% van de patiënten met myelodysplastisch syndroom [28]. DNMT3A
ook een cruciale rol in de epigenetische silencing van hematopoietische stamcellen (HSC) speelt regulerende genen en het mogelijk maken efficiënte differentiatie [29].

De DNMT3A
genoomplaats produceert twee transcripten die tot twee eiwitten, hoe langer DNMT3A1 Kopen en kortere DNMT3A2
, die verschillen in een 219-aminozuur amino (N) terminale staart alleen aanwezig is in DNMT3A1
[30], [31]. Het N-terminale domein van DNMT3A1
wordt een "regulerende" domein omdat het geen enzymatische DNA-methyltransferase activiteit bezitten. Dit domein heeft geen significante homologie delen met elk ander bekend eiwit. DNMT3A1
geconcentreerd in heterochromatine, die als transcriptioneel stil zijn, en functioneert primair als een transcriptionele repressie [30]. Maar andere onderzoek toonde aan dat DNMT3A1
was efficiënt aangeworven om draaid Oct3 /4 en actief vitronectine (Vtn) gen promoters via het unieke N-terminale domein [32].

Vermeld is dat genetische variaties in de DNMT3A
gen bijdragen aan het ontstaan ​​van kanker in het bijzonder in verband met GC [15], [33] - [36]. Vervolgens wordt verder onderzoek naar de relatie tussen SNPs en de translationele verordening op haar target genen voorgesteld. Maar vaststellen biologische functie voor elke SNP vergt vaak tijdrovend, moleculaire biologie experimenten. Zo is het analyseren van het grote aantal SNPs gekoppeld aan een bepaalde locus in de praktijk vraagt ​​om een ​​systematische evaluatie van bio-informatica en prioritering om de set waarschijnlijk functionele kandidaat-varianten te beperken. Omdat de meeste van de SNPs in LD, wordt de haplotype gebaseerde associatiestudies beschouwd krachtiger dan één SNP analyse causale genetische varianten onderliggende etiologie van complexe ziekten zoals kanker te identificeren [37] Bovendien, het gebruik van tagSNPs dat capture meeste haplotypic diversiteit in associatiestudies is voorgesteld [38]. Hoewel GWAS verschillende SNPs of tagSNPs significant geassocieerd met kanker heeft opgeleverd meeste tagSNPs worden gevonden in niet-eiwit coderende gebieden (intergene en intron gebieden), de identificatie van hun functionele en /of causale varianten heeft een belangrijke beperking van GWAS data interpretatie ondanks toewijzen van vermeende functionaliteit met vele andere GWAS tagSNPs is pas succesvol wanneer fijne mapping rond een bekende risicofactor regio werd uitgevoerd [39] - [41].

In de huidige studie, hebben we gekozen voor een vermeende functionele tagSNP rs7560488 dat kan vertegenwoordigen SNPs van de DNMT3A1
promotor met een hoge linkage onevenwichtigheid, is het mogelijk om genetische variatie te identificeren zonder genotypering van elke SNP in DNMT3A1
promoter regio en het verbeteren van de efficiëntie van de vereniging. We zagen dat de proefpersonen uitvoeren tagSNP rs7560488 TT genotypes vertoonden aanzienlijk verminderd maag risico op kanker in vergelijking met personen met TC of CC genotype, wat aangeeft dat allel T is een beschermend effect potentieel tentoongesteld door deze tagSNP. Bovendien is de assays voerden wij ontvangen verder bewijs waaruit blijkt dat de TC en de CC genotype geassocieerd met een verminderde expressie van DNMT3A1
mRNA in maagkanker weefsels, de resultaten suggereren dat de DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T > C polymorfisme kan de expressie van regelen DNMT3A1 Kopen en dragen daardoor bij aan GC gevoeligheid. Deze gegevens gaven ook aan dat DNMT3A1 een rol in de progressie van maagkanker kunnen spelen, maar deze bevinding moet worden bevestigd door een grotere onderzoekspopulatie. Voor zover wij weten is dit het eerste verslag en toont aan dat de DNMT3A1
transcriptie wordt direct beïnvloed door functionele tagSNP rs7560488 van DNMT3A1
promotor regio en de tagSNP rs7560488T > C werd geassocieerd met een significant verhoogd kans op GC. Vervolgens voerden wij een EMSA experiment om de biologische gevolgen van tagSNP rs7560488 polymorfisme analyseren BGC-823 cellen. Zowel het T allel en het C allel probes vertoonde twee banden gel-shift, maar competitie-experimenten toonden de bindingsaffiniteit voor de kerneiwitten van het T allel probe variant groter was dan degene die bij de C allel probe tegenhanger. Zodat de versterkte DNA-eiwitbindende vermogen van T-allel probleem bij de toename DNMT3A1
promoteractiviteit die we waargenomen in onze promotor assays. Super-EMSA-experiment AP-1-antilichamen niet eens een super-gel shift aangegeven dat transcriptiefactoren AP-1 kan niet worden in de vorming van transcriptionele complexen aan de tagSNP rs7560488 plaats. Een ander nieuw resultaat komt voort uit de associatie tussen leeftijd en rs7560488 T > C polymorfisme in gelaagde analyse impliceerde dat minder dan 60 jaar oud waren meer vatbaar voor maagkanker met tagSNP rs7560488 T > C. Waarschijnlijk DNMT3A1
beïnvloedt transcriptie van specifieke genen en vooral veranderingen in bepaalde genen verhogen het risico van GC. Deze resultaten tonen ook aan dat de sterkere risicofactor voor GC is tagSNP rs7560488 T > C, vooral bij jonge leeftijd

Bij elkaar genomen, deze studie geeft de eerste mechanistisch inzicht in hoe deze nieuwe functionele tagSNP rs7560488 T >. C-variant significant geassocieerd met het risico op maagkanker in een Chinese bevolking. We vonden dat de T naar C verandering aanzienlijk gewijzigde transcriptionele activiteit van DNMT3A1
gen via het beïnvloeden van de binding van enkele transcriptiefactoren en aldus DNMT3A1 expressieniveau veranderen, hoewel een bepaalde transcriptiefactoren nog worden vastgesteld. Onze bevindingen geven een inzicht dat DNMT3A1
promotor rs7560488 T >. C variatie is een veelbelovende biomarker voor de bevolking gevoelig voor GC evalueren en waardevolle informatie in de richting van toekomstig onderzoek bij maagkanker pathogenese

Dankwoord

Wij danken Professor Wang Yaping, Dr. Zhenming Cai, Lili Cao (Nanjing University, Nanjing, China) en Zhenghao Zhang (Southeast University, Nanjing, China) voor HRM genotypering.

• PLoS ONE: Co-Levering van doxorubicine en SATB1 shRNA door warmtegevoelige Magnetische kationische liposomen voor maagkanker Therapy
• PLoS ONE: Klinische en prognostische betekenis van HIF-1α, PTEN, CD44v6 en Survivin voor maagkanker: A Meta-Analysis