PLOS ONE: A Novel Funcional TagSNP Rs7560488 na DNMT3A1 promotor é associadas à susceptibilidade ao cancro gástrico, modulando a atividade do promotor

Abstract

ADN-metiltransferase (DNMT) -3A que contém DNMT3A1
e DNMT3A2
isoformas têm sido sugeridos para desempenhar um papel crucial na carcinogênese e mostrou expressão aberrante na maioria dos cânceres. evidências acumuladas também indicou que polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) em genes DNMT foram associados com a susceptibilidade a tumores diferentes. Nossa hipótese é que variantes genéticas em DNMT3A1 e região promotora estão associados com o risco de câncer gástrico. Nós selecionamos os tagSNPs do banco de dados HapMap para os chineses e genotipados em um estudo de caso-controle para avaliar a associação com o câncer gástrico (GC) em uma população chinesa. Identificou-se que os rs7560488 tagSNP funcionais T > C associada com um aumento significativo do risco de GC. In vitro
análise funcional pelo ensaio de repórter de luciferase e EMSA indicou que o rs7560488 tagSNP T > C alteraram substancialmente a atividade transcricional de DNMT3A1
gene via influenciar a ligação de alguns fatores de transcrição, embora uma transcrição definitiva fator continua a ser estabelecida. Comparado com homozigotos TT, indivíduos que eram heterozigotos TC e homozigotos CC exibiram uma expressão reduzida de DNMT3A1
. Além disso, a análise estratificada mostrou que os indivíduos que abrigam TC ou genótipos CC menos de 60 anos de idade foram mais suscetíveis ao GC. Nossos resultados sugerem que as variações genéticas no DNMT3A1
promotor contribuir para a susceptibilidade à GC e também fornecer um insight que rs7560488 tagSNP T > C pode ser um promissor biomarcador para prever GC susceptibilidade genética e uma informação valiosa no GC patogênese

Citation:. Wu H, Zhang K, Gong P, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) A Novel Funcional TagSNP Rs7560488 na DNMT3A1 promotor está associado à suscetibilidade ao câncer de estômago modulando Promotor Atividade. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10.1371 /journal.pone.0092911

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 22 Dezembro, 2013; Aceito: 27 de fevereiro de 2014; Publicação: 25 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81171915 e No. 91.229.107) e a Investigação científica e Plano de Inovação para graduados universitários da província de Jiangsu, China (Grant No. CXZZ13_0082). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns na China, especialmente na província de Jiangsu, com uma elevada taxa de incidência e mortalidade [1], [2]. Ela pode se espalhar por todo o estômago e outros órgãos, incluindo o esôfago, pulmões, gânglios linfáticos ou fígado. Portanto, o câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo [3]. Em consideração da eficiência terapêutica, a ressecção cirúrgica pode ser um tratamento curativo primário para a fase anterior de pacientes GC [4]. Infelizmente, a maioria dos pacientes com câncer gástrico são detectados em estágio avançado, período durante o qual o tumor é mais irressecável. Além disso, a recidiva após a cirurgia é um outro evento terrível para uma taxa de sobrevida em 5 anos pobres. Considerando os pacientes com câncer gástrico avançado ou recorrente, não é nenhuma dúvida de que a descoberta de biomarcadores e sua aplicação acompanhados com o diagnóstico tradicional pode ser uma indicação valiosa e uma extensa ajuda a formular a estratégia de prevenção e tratamento. No entanto, até agora, alguns biomarcadores mensuráveis ​​para prever a recorrência de GC foram identificados.

Tumorigênese é conhecido por ser um processo de múltiplos passos, que é o resultado de alterações genéticas não só mas também alterações epigenética [5]. A metilação do DNA é uma das principais formas de modificação epigenética e desempenha um papel essencial no desenvolvimento, diferenciação, estabilidade genômica, X-inactivação, imprinting por regulamentação específica da expressão do gene. O fenômeno epigenético mais comumente estudado é a metilação do DNA, um regulador essencial da estrutura de transcrição e cromatina. padrões de metilação de ADN aberrante um fundo geneticamente susceptíveis pode estar associada com um risco aumentado de uma série de distúrbios humanos [6], [7], incluindo GC [8]. DNMT3A
que contém DNMT3A1
e DNMT3A2 Quais são dois de novo de
metiltransferases de ADN desempenha um papel crucial no desenvolvimento embrionário e metilação de DNA aberrante na carcinogênese. Alguns polimorfismos do DNMT3A
gene pode regular a expressão gênica, influenciar sua atividade enzimática e podem contribuir para a susceptibilidade ao câncer. evidências acumuladas em genética molecular indicam que SNP em DNMT
genes estão associados com a susceptibilidade ao câncer [9], [10]. avanços recentes no estudo genômico de associação (GWAS) também foram identificados novos SNPs de susceptibilidade para GC, que é útil para compreender o mecanismo subjacente de variações genéticas no desenvolvimento de GC [11] - [14]. Nosso estudo anterior descobriu um funcionais rs1550117 SNP em DNMT3A
promotor que pode aumentar sua atividade transcricional e contribuem para a suscetibilidade genética para câncer gástrico em uma população chinesa [15], [16].

GWAS rendeu inúmeras SNPs associados a muitos tipos de câncer. Em alguns casos, dezenas de SNPs, chamados tagSNPs que representam SNPs numa região do genoma com alta desequilíbrio de ligação pode identificar variações genéticas sem a genotipagem de cada SNP numa região cromossómica, por isso tagSNPs são úteis em todo o genoma estudos de associação SNP, tal como próstata, mama, ovário, colo-rectal e os cancros cerebrais [17] - [19]. No presente estudo, foi selecionada uma tagSNP rs7560488 do banco de dados HapMap para assuntos chineses para avaliar as associações entre as variantes genéticas no DNMT3A1
promotor eo risco de câncer gástrico em uma população chinesa. Nós identificamos um rs7560488 associada a risco T >. C polimorfismo no DNMT3A1
promotor, eo nosso trabalho adicional sugerido que esta variante podem alterar a atividade do promotor e destruir a capacidade de ligação de fatores de transcrição

materiais e Métodos

os sujeitos do estudo

Um total de 405 pacientes com diagnóstico histológico de câncer gástrico e 408 controles sem câncer foram recrutados neste estudo de caso-controle, e as características dos casos e controles estão detalhados na Tabela 1. Casos e controles foram pareados por idade, sexo e foram selecionados no primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica de Nanjing. Todas as amostras foram obtidas com consentimento por escrito e analisados ​​anonimamente. Este estudo foi realizado com a aprovação da Comissão de Ética Médica da Faculdade de Medicina da Universidade do Sudeste.

TagSNP Seleção e do TF local de ligação Previsão

A principal hipótese subjacente a esta experiência foi que há uma ou mais SNPs no DNMT3A1
regiões promotoras que são associados com o risco de cancro gástrico. Dependendo do desequilíbrio de ligação (LD) estrutura em um locus particular, tagSNPs pode ser substitutos para muitos milhares de outros SNPs. Postulamos que tais tagSNPs também são susceptíveis de assinalar quaisquer SNPs até agora identificados no DNMT3A1
promotor. Assim, foram selecionados os SNPs no região promotora DNMT3A1
com uma freqüência do alelo menor (MAF) de > 5% de ambos os bancos de dados HapMap e dbSNPs. Para implementar a seleção tagSNP potencialmente funcional, usamos dados do HapMap Internacional e as ferramentas de seleção tagSNP livremente baseados na web para selecionar tagSNPs, e usar o algoritmo TF-search (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH .html) para prever fator de transcrição rs7560488 (TF) local de ligação.

Extração de DNA e genotipagem HRM

para estudar o DNMT3A1
promotor rs7560488 tagSNP, DNA genômico foi isolado a partir de 1 ml de sangue periférico de doentes e indivíduos saudáveis ​​e foi extraída a partir de células brancas do sangue dentro de uma semana após a colheita da amostra por digestão com proteinase K, como anteriormente descrito [20]. rs7560488 TagSNP foi genotipados usando o corante dsDNA LC verde em combinação com alta resolução de fusão análise (GRH). Em detalhe, os iniciadores de PCR foram concebidos pelo LightScanner software desenho de primers (Tecnologia Idaho) (iniciador directo: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 '; iniciador inverso: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3'), que o produto de um único fragmento 208 bp. Cada reacção de PCR foi realizada inicialmente num volume de reacção final de 10 uL, utilizando 25 ng de DNA genómico, 0,2 pmol de cada iniciador, 0,8 ul de dNTPs 2,5 mM, 1 mL de MgCl 25 mM _{2, 1 uL 10 x tampão Taq com (NH4) 2SO 4, 0,4 U de Taq DNA polimerase (Fermentas), 1 ul 1X LC PLUS verde (Idaho Technology) e 0,4 mL sulfóxido de dimetilo (DMSO). A mistura de reacção foi incubada a 95 ° C durante 5 min e, em seguida, submetido a 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg, seguido de 72 ° C durante 7 min usando um termociclador PTC-200 (Bio-Rad). As reacções de PCR foram transferidos para as placas de 96 poços (Bio-Rad) e analisados ​​sobre a luz do scanner (Idaho Technology). Os dados de fluorescência foram recolhidos ao longo de um intervalo de temperatura de 70-97 ° C, e análise de curva de fusão foi realizada de acordo com o software do fabricante. HRM poderia discriminar diretamente o heterozigoto (CT) e homozigoto genótipos de tagSNP rs7560488 T >(CC ou TT); C por meio de digitalização de fusão. Após a mistura de ADN homozigótico com uma quantidade igual de produtos de PCR conhecidos (por exemplo, CC), é ainda distinguido entre o genótipos TT CC e. Para confirmação, 5% das amostras de cada grupo detectado por HRM foram selecionados aleatoriamente e submetidos a sequenciação de ADN para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade.}

Construção de luciferase Reporter plasmídeo

Para construir o DNMT3A1 tagSNP rs7560488 plasmídeo repórter, foi amplificado o fragmento de 948 pb 25422345-25.422.345 de DNMT3A1
região promotora, que contém o alelo T e C de SNP por PCR a partir de ADN genómico. Os iniciadores utilizados para as amplificações de PCR foram: (Forward: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', reverso: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). Os produtos de PCR foram subclonados nos sítios de restrição NheI e HindIII do vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI). Verificou-se todos os clones recombinantes por sequenciação de ADN.

A transfecção transiente e Dual Luciferase Reporter Assay

Humano células AGS e cancro gástrico BGC-823 (ATCC) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de soro Fetal bovino (FBS) e solução de penicilina /estreptomicina 1% (10 000 U /ml e 10 mg /ml, respectivamente). AGS e células BGC-823 (1 × 10 ^{5) foram semeadas em placas de cultura de 24 poços. Após 24 horas de cultura, as células AGS, BGC-823 foram transfectadas por Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) com 0,8 mg de cada vector construído, quer com o alelo T ou alelo C. Simultaneamente, 10 plasmídeos de pRL-TK (Promega) ng por poço também foi transfectada como um controlo interno para corrigir a eficiência de transfecção. Antes de isso, as células foram semeadas em placas de 24 poços durante a noite para assegurar 90% -95% de confluência no momento da transfecção. Vinte e quatro horas após a transfecção, a actividade da luciferase foi medida pela Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, EUA) e expressa como a razão de luciferase do pirilampo para Renilla actividades de luciferase. Todas as células foram feitas em triplicado, com as mesmas condições. Três experiências de transfecção independentes foram realizadas, e cada ensaio de luciferase foi realizado em triplicado.}

Mudança eletroforética Mobility Assay (EMSA)

Os oligos 5'-biotinilados 25 pb de comprimento foram obtidos a partir de Pequim Instituto de genômica (BGI). sequências oligo foram rs7560488 [T] Forward: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] Reverso: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Para a frente: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] reverso: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Para o recozimento, concentrou-se oligonucleótidos complementares foram misturados numa proporção molar de 1:01 e incubadas a 95 ° C durante 5 min e, em seguida, gradualmente reduzida durante horas até que os oligonucleótidos atingido a temperatura ambiente. Os oligos hibridados foram diluídos para uma concentração final de 10 fmol. proteínas nucleares foram extraídas de células BGC-823 usando os NE-PERTM nuclear e citoplasmática de extracção Reagentes (Pierce, Rock-ford, IL, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O kit LightShift EMSA quimioluminescente (Pierce /Thermo Fisher Scientific) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as reacções de ligação foram realizados como se segue: extractos nucleares (8 ug de proteína) e a 1 × tampão de ligação, com 2,5% de glicerol, 5 mM de MgCl2, 50 ng /poli ul (dl-dC), 0,05% de NP-40, e 60 fmol de sondas C T /rs7560488 rs7560488 marcados com biotina foram incubadas em gelo durante 30 minutos num volume de 20 ul. Para estudos de competição, os extractos nucleares foram incubadas com o oligonucleótido não marcado, durante 30 min antes da adição do oligonucleótido marcado. Para uma supershift, foi adicionado anticorpo de AP-1 (BOSTER, China). Os complexos foram separados por electroforese em PAGE nativo 6% em tampão TBE 0,5 × a 110 V. Os geles foram transferidos para Biodyne B pré-cortadas membranas de nylon modificados (Pierce /Thermo Fisher Scientific), utilizando uma célula de transferência semi-seca Trans-Blot SD ( bio-Rad Laboratories). As membranas foram reticuladas (UVC-508 reticulador de UV, Ultra LUM) e o sinal foi detectado com um sistema de detecção quimioluminescente (Pierce /Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.

Detecção de DNMT3A1 Transcrições por RT-PCR quantitativa (Q-PCR)

para detectar ainda mais a correlação entre os níveis de ARNm e rs7560488 polimorfismo DNMT3A1, dos 44 tecidos de cancro gástrico com diferentes genótipos foram submetidos a extracção do ARN total utilizando Trizol Reagente ( Invitrogen, Inc.). O nível de ARNm DNMT3A1 foi medida quantitativa por PCR em tempo real após a transcrição reversa, numa máquina de PCR 7900 Real-Time prisma (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-actina foi utilizado como um controlo interno quantitativa para cada amostra. Os iniciadores utilizados para a amplificação foram DNMT3A1 F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'e R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; os iniciadores para actina foram β-F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'e R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. quantificação relativa de mRNA DNMT3A1 foi calculado usando o método 2-ΔΔCT, e cada ensaio foi feito em triplicado.

Análises Estatísticas

Todos os dados foram analisados ​​com o SPSS versão
13,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Pacientes e controles foram comparados por meio de Student t
-teste para variáveis ​​contínuas e teste do qui-quadrado (χ2) para variáveis ​​categóricas. Freqüências alélicas e genotípicas entre indivíduos controle e GC foram obtidos utilizando o teste do qui-quadrado e o teste padrão de bondade-de-ajuste foi utilizada para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg. A valor P
inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Características dos sujeitos do estudo

A distribuição dos casos e controles de freqüência são apresentado na Tabela 1, não houve diferença significativa nas distribuições de frequência entre os casos e os controlos (P = 0,243 para a idade e P = 0,355 para o sexo). A média de pacientes e controles foi de 59,8 anos (variação 20~93 anos) e 60,6 anos (variação 25~90 anos), respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi encontrada na idade média e gênero, sugerindo que a correspondência com base nestas duas variáveis ​​foi adequada.

Candidato tagSNP Seleção e Genotipagem

Entre os SNPs candidatos em DNMT3A1
, enfocamos os tagSNPs no promotor de DNMT3A1
e previu sua função potencial de fatores de transcrição de ligação, que afetam a expressão qualitativa e quantitativa do DNMT3A1
. Foi aplicado um algoritmo de selecção tagSNP à base de LD (R ^{2≥0.80, MAF≥5%), que identificaram dois tagSNPs representando a variação genética comum na população CHB, incluindo o candidato tagSNPsrs7560488 e rs1550117 que é um polimorfismo funcional que modifica o susceptibilidade no câncer gástrico foi confirmada antes [15], [16]. TFSEARCH algoritmo previu que rs7560488 t cria um local de ligação para o AP-1 (Figura 1). As amostras para genotipagem por HRM e sequenciação por ABI 3730 sequenciador automático respectivamente (Figura 2)}

TagSNP rs7560488 Variant T >. C em DNMT3A1 Promotor significativamente aumenta o risco de GC

As distribuições genotípicas e freqüências alélicas de rs7560488 são apresentados na Tabela 2. as freqüências genotípicas nos controles estavam de acordo com o modelo de Hardy-Weinberg (P = 0,274). Como mostrado na Tabela 2, as frequências dos genótipos de rs7560488 foram 68,9%, 27,4%, e 3,7% para o TT, TC, e genótipos CC entre os casos e 79,9%, 18,4%, e 1,7% entre os controlos, respectivamente, a diferença entre os casos e os controlos foi estatisticamente significativa (P < 0,05). Além disso, a freqüência do alelo T foi significativamente menor entre os casos do que nos controles (82,6% versus 89,2%, P = 0,000). Além disso, a freqüência do genótipo TC /CC combinado foi maior entre os casos do que nos controles (31,1% versus 20,1%, P = 0,002). Ao tomar genótipo TT e alelo T como referência, descobrimos que os genótipos variantes (TC e CC) foram associados com um risco aumentado de GC (OR = 1,653, IC 95% = 1,194-2,287; P = 0,002). Da mesma forma, também observamos que as freqüências alélicas C foi significativamente maior do que os controles (OR = 1,744; IC95% = 1.310-2.321; P = 0,000). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que os genótipos TC e CC estavam associados com a susceptibilidade genética do GC; DNMT3A
1 rs7560488 T alelo pode ser um alelo protetor putativo. Não houve frequências significativas diferentes de rs7560488 em GC na faixa etária > 60 anos versus ≤ 60 anos (P = 0,756) e do sexo masculino contra o sexo feminino (P = 0,459) (Tabela 3)

indivíduos com menos de. 60 anos de idade eram mais suscetíveis ao câncer gástrico com tagSNP rs7560488 Variant T > C

Idade e sexo foram fatores importantes na carcinogênese de tumores, incluindo o câncer gástrico. Quando as análises foram estratificadas pela idade e sexo dos pacientes, verificou-se que a associação significativa foi observada, os indivíduos com genótipos TC /CC foram associados com a susceptibilidade genética para GC tanto no masculino e grupo feminino. Portanto, alelo rs7560488 C foi um aumento significativo do factor de risco em comparação com o alelo T (Tabela 4). Além disso estratificação avaliaram a associação de rs7560488 T > C com câncer gástrico em diferentes idades. genótipos TC /CC foram associados com a susceptibilidade genética para a GC na faixa etária ≤ 60 anos (OR = 1,794, IC 95% = 1,118-2,877; P = 0,015) que não mais de 60 anos, da mesma forma, também observamos que a C freqüências alélicas foi significativamente maior do que os controles (OR = 1,720; IC95% = 1.127-2.622; P = 0,011). Estes resultados sugerem que os genótipos TC e CC foram associados com a susceptibilidade genética para a GC, particularmente em indivíduos há mais de 60 anos (Tabela 4)

O rs7560488 T >. Afeta C Variant DNMT3A1 transcricional Atividade

para avaliar o efeito funcional biológica do polimorfismo rs7560488 na transcrição DNMT3A1, construímos vetores repórter da luciferase (pGL3), que mede o 4.389.823-4.390.770 base DNMT3A1
promotor, com qualquer tipo selvagem (alelo T) ou tipo de mutante (alelo C) e transfectado-los em BGC-823, células de AGS (Figura 3A). Como mostrado na Fig. 3B, observou-se que a actividade de transcrição do alelo T foi mais elevado do que o alelo C com um aproximadamente 2 vezes em cima duas linhas celulares, sugerindo que o alelo rs7560488 t trabalhado como uma defesa para o cancro gástrico, aumentando a transcrição da DNMT3A1

o rs7560488 T >. C Variant Atenua Fator de Transcrição Affinity

Tendo em conta rs7560488 tagSNP está localizado no região promotora DNMT3A1
; a hipótese de que ele pode alterar a ligação do factor de transcrição (TF). De facto, usando o algoritmo de busca de TF-(www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), previmos que rs7560488 t cria um local de ligação de TF para o AP-1. Para determinar se este polimorfismo tem um efeito sobre a capacidade de ligação do factor de transcrição, foi realizada a teste de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) para analisar a ligação de sondas oligo contendo alelo C, quer T ou para as proteínas nucleares de células extraídas da AGS. Como mostrado na Fig. 4A, uma específica deslocado DNA /banda complexo de proteína nuclear foi gerado por ambos C e T sondas alelo (pistas Fig. 4 A 2, 5). No entanto, t alelo ainda não foram completamente inibidas competitivamente (Fig. 4A pista 4), embora a banda deslocada foi abolida por sondas C não etiquetados de 50 vezes (Fig. 4A pista 1), sugerindo que a actividade de ligação da sequência contendo rs7560488 T alelo foi mais forte em comparação com o alelo C e o factor de transcrição pode ligar-se preferencialmente ao alelo T em vez de alelo C. Além disso, utilizando o anticorpo de super-EMSA AP-1 não causou uma supershift da sonda de proteína marcada com biotina /nuclear (Fig. 4 B pista 2, 5), indicando que a AP-1 pode não ser o factor de transcrição que se liga à região promotora contendo o alelo T ou C. Estes resultados indicaram que o alelo rs7560488 C pode diminuir a actividade de ligação de proteínas nucleares, embora o impacto não é afectada pelo factor de transcrição AP-1.

Associação entre DNMT3A1rs7560488 Polimorfismo e os níveis de expressão de DNMT3A1
mRNA

Quarenta e quatro tecidos de câncer gástrico com diferentes genótipos de rs7560488 DNMT3A1 estavam disponíveis em nosso estudo. Por causa da baixa frequência do genótipo CC, nós adicionamos em amostras com genótipo TC para análise. Como mostrado na Fig. 5, os níveis de mRNA DNMT3A1 expressão foi menor em indivíduos com genótipo TC ou CC do que naqueles com genótipo TT (P < 0,05)

Discussão

Genome-wide hipometilação e promotor hipermetilação são. características de uma grande variedade de cancros que contribuem para a tumorigênese e de metilação do DNA desempenha um papel-chave na regulação da expressão gênica e manutenção da estabilidade genômica [21], [22]. A metilação do DNA é realizada por metiltransferases de DNA (DNMTs) DNMT1
, DNMT3B
e DNMT3A
[23], [24]. O De Novo
metiltransferases dnmt3a
são altamente expressos durante o desenvolvimento embrionário precoce e sub-regulada em células somáticas mais diferenciadas [25]. O papel da DNMT3A
no câncer humano foi destacada por relatos de DNMT3A
mutações em cerca de 20% dos pacientes com leucemia mielóide aguda [26], [27]. A ocorrência destas mutações correlacionados com a actividade enzimática reduzida e regiões genómicas com diminuição da metilação. dnmt3a
mutações também foram identificadas em 8% dos pacientes com síndrome mielodisplásica [28]. DNMT3A
também desempenha um papel crítico no silenciamento epigenético de células-tronco hematopoiéticas (HSC) genes reguladores e permitindo uma diferenciação eficiente [29].

O DNMT3A
local genómico produz dois transcritos dando origem a duas proteínas, quanto mais tempo DNMT3A1
e o mais curto DNMT3A2
, que diferem pelo facto de um grupo amino de 219 aminoácidos (N) cauda -terminal está presente apenas em DNMT3A1
[30], [31]. O domínio N-terminal de DNMT3A1
é chamado um domínio de "regulação" porque não possuem actividade enzimática da DNA metiltransferase. Este domínio não partilha uma homologia significativa com qualquer outra proteína conhecida. DNMT3A1
é concentrada em heterocromatina, o que é considerado ser transcricionalmente silencioso, e funciona principalmente como uma repressão transcricional [30]. Mas outra pesquisa mostrou que DNMT3A1
foi eficiente recrutados para o OCT3 /4 e ativado vitronectina silenciados (VTN) promotores de genes através do seu domínio exclusivo N-terminal [32].

Tem sido relatado que as variações genéticas no DNMT3A
gene contribuir para a carcinogênese, especialmente associado com GC [15], [33] - [36]. Em seguida, uma maior exploração da relação entre SNPs e regulação de translação de seus genes-alvo é proposto. Mas, determinar função biológica para cada SNP exige muitas vezes, experiências de biologia molecular demoradas. Assim, analisando os grandes SNPs números ligados a qualquer lugar especial na prática requer uma avaliação sistemática bioinformática e priorização para reduzir o conjunto de variantes candidatos funcionais prováveis. Porque a maioria dos SNPs estão em LD, os estudos de associação à base de haplótipos são considerados mais poderosa do que a análise de SNP única para identificar variantes genéticas causais subjacentes a etiologia de doenças complexas como o câncer [37] Além disso, o uso de tagSNPs que capturam a maior parte da diversidade haplotípica em estudos de associação tem sido sugerido [38]. Embora GWAS rendeu inúmeras SNPs ou tagSNPs significativamente associados com o câncer, a maioria dos tagSNPs são encontradas em regiões de codificação não-protéicos (regiões intron intergênico e), identificando suas variantes funcionais e /ou causais tem uma importante limitação da interpretação dos dados GWAS apesar de atribuir funcionalidade putativa a muitos outros GWAS tagSNPs só foi bem sucedida quando o mapeamento fino em torno de uma região de risco conhecido foi realizada [39] - [41].

no presente estudo, foi selecionada uma putativos rs7560488 tagSNP funcional que pode representam SNPs do DNMT3A1
promotor com desequilíbrio de alta ligação, é possível identificar a variação genética, sem a genotipagem cada SNP em DNMT3A1 e região promotora e melhorar a eficiência da associação. Observou-se que os indivíduos portadores tagSNP genótipos rs7560488 TT expostas reduziu significativamente o risco de câncer gástrico comparados com indivíduos com TC ou genótipo CC, indicando que o alelo T é um efeito protector potencialmente mostrada por esse tagSNP. Além disso, os ensaios que realizamos forneceu mais evidências que demonstram que o genótipo TC e CC associada à diminuição dos níveis de expressão DNMT3A1
mRNA em tecidos com câncer gástrico, os resultados sugerem que o DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T > polimorfismo C podem regular a expressão de DNMT3A1
e, assim, contribuir para a susceptibilidade GC. Estes dados também indicam que DNMT3A1 pode desempenhar um papel na progressão do cancro gástrico, mas esta descoberta tem de ser confirmada por um estudo populacional maior. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório e demonstra que o DNMT3A1
transcrição é diretamente influenciada pela rs7560488 tagSNP funcionais de DNMT3A1 e região promotora e a tagSNP rs7560488T > C foi associado com um aumento significativo risco de GC. Em seguida, foi realizado um experimento EMSA analisar as consequências biológicas do polimorfismo rs7560488 tagSNP em células BGC-823. Tanto o alelo T e as sondas alelo C mostrou duas bandas de desvio em gel, mas experiências de competição mostraram a afinidade de ligação às proteínas nucleares pela variante da sonda alelo T era maior do que a observada com o homólogo C sonda de alelo. Assim, a capacidade melhorada de alelo T de ligação ao ADN-proteína podem ser responsáveis ​​pelo aumento da DNMT3A1
actividade do promotor que observado nos nossos ensaios de promotor. experimento Super-EMSA utilizados anticorpos AP-1 não tem um deslocamento de super-gel indicou que factores de transcrição AP-1 pode envolver na formação de complexos de transcrição no local rs7560488 o tagSNP. Outro resultado novela vem da associação entre idade e rs7560488 T > C polimorfismo em análise estratificada implícito que menos de 60 anos de idade foram mais suscetíveis ao câncer gástrico com rs7560488 tagSNP T > C. É provável que DNMT3A1
afecta a transcrição de genes específicos e especialmente alterações em certos genes aumentam o risco de GC. Esses resultados também mostram que o fator de risco mais forte para GC é rs7560488 tagSNP T > C, especialmente em idade jovem

No seu conjunto, este estudo fornece a primeira visão mecanicista de como este romance funcionais rs7560488 tagSNP T >. Variante C é significativamente associada com o risco de câncer gástrico em uma população chinesa. Descobrimos que a troca de T por C alteraram substancialmente a actividade de transcrição de gene DNMT3A1
através de influenciar a ligação de alguns factores de transcrição e, assim, alterar o nível de expressão DNMT3A1, embora um factores transcricionais definidas continua a ser estabelecida. Nossos resultados fornecem uma visão que DNMT3A1
promotor rs7560488 T >. Variação C é um promissor biomarcador para avaliar a população suscetível a GC e fornecer informações valiosas para a pesquisa futura na patogênese do câncer gástrico

Agradecimentos

Agradecemos ao professor Yaping Wang, Dr. Zhenming Cai, Lili Cao (Universidade de Nanjing, Nanjing, China) e Zhenghao Zhang (Universidade do Sudeste, Nanjing, China) para genotipagem HRM.

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