PLoS ONE: Monimuotoisuus ja haplotyypin HEPARANASE Gene Associations kanssa Progression ja prognoosi mahasyövän pohjoisen Chinese Väestö

tiivistelmä

Background

Human heparanaasin on tärkeä rooli syövän kehittymisessä ja yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) in HEPARANASE geeni (HPSE) on osoitettu korreloivan mahasyöpä. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin yhdistysten yksittäisten SNP tai haplotyyppien HPSE ja alttius, kliinis parametrit ja ennusteen mahasyövän suuri otos Han väestöstä Pohjois-Kiinassa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Genominen DNA uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu normaaliin mahalaukun kudosnäytteitä 404 potilasta ja verestä 404 tervettä verrokkia. Kuusi SNP genotyypattiin matriisiavus- laserdesorptio /ionisaatio-of-lennon massaspektrometriaa. Chi-neliö (χ2) testi ja ehdoton logistista regressiota käytettiin analysoimaan mahalaukun syövän riski; Log-rank-testiä ja Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin tuottamaan selviytymisen analyysin ja Kaplan-Meier menetelmää käytettiin kartoittamaan eloonjäämiskäyrien. Keskimääräinen genotyypitys onnistumisprosentteja oli yli 99% molemmissa ryhmissä. Haplotyypin CA lohkossa koostuu rs11099592 ja rs4693608 oli suurempi jakauma ryhmässä Borrmann tyyppejä 3 ja 4 (P = 0,037), ryhmä suurempi määrä imusolmukemetastaaseja (N3 vs N0 ryhmä, P = 0,046), ja lisäksi korreloi huonoon säilymiseen (CG vs CA: HR = 0,645, 95% CI: 0,421-0,989, P = 0,044). Lisäksi genotyypit rs4693608 AA ja rs4364254 TT olivat yhteydessä huonoon säilymiseen (p = 0,030, HR = 1,527, 95% CI: 1,042-2,238 for rs4693608 AA; P = 0,013, HR = 1,546, 95% CI: 1,096-2,181 varten rs4364254 TT). Ei ollut korrelaatiot yksittäisten SNP tai haplotyyppien ja mahasyövän riskiä.

Johtopäätökset /merkitys

Toimiva haplotyypin HPSE todettiin, johon sisältyi tärkeitä SNP rs4693608. SNP HPSE tärkeä rooli mahalaukun syövän etenemisessä ja selviytymistä, ja ehkä voi olla molekyyli- merkkiaine ennusteen ja hoidon arvoja.

Citation: Li AL, Song YX, Wang ZN, Gao P, Miao Y, Zhu JL, et ai. (2012) polymorfismit ja haplotyypin HEPARANASE Gene Associations kanssa Progression ja prognoosi mahasyövän pohjoisen Kiinan väestön. PLoS ONE 7 (1): e30277. doi: 10,1371 /journal.pone.0030277

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 13 lokakuu 2011; Hyväksytty: 12 joulukuu 2011; Julkaistu: 20 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation of China (nro 30972879 ja nro 81172370), joka on erikoistunut Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen korkeakoulutusalueen (nro 200801590006) ja Natural Science Foundation of Liaoningin maakunnassa (nro 20092129). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä maailmassa ja toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus [1]. Edistysaskelista huolimatta diagnoosin ja hoidon, ennuste potilaille, joilla on edennyt mahasyöpä edelleen synkkä [2]. Lisäksi mahasyöpä on sairaus geenien ja ympäristön vuorovaikutukset ja geneettiset tekijät on tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja etenemisessä [3]. Siksi löytö ja soveltaminen biomarkkerit yhdistetty perinteiseen syöpädiagnoosin, lavastus, ja ennuste voidaan pitää paras vaihtoehto valvoa tämän hengenvaarallinen tauti [4].

Yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) on ajateltu houkutteleva biomarkkereita syövän riskin arvioinnissa, seulonta, lavastus, tai lajitteluun [5]. Myös ihmisen genomi koostuu sarjasta "haplotyypin lohkojen, jotka ovat sattumanvaraisen yhdistyksiä alleelien johtuu kytkentäepätasapaino- (LD) ja on mahdollista hyödyntää paljon tietoa pohtivat näitä haplotyyppi lohkojen [6], [7 ]. Vaikka soveltaminen yksittäisten SNP-analyysi on rajoitettu toistaiseksi, haplotyyppi-pohjainen yhdistys tutkimus on ehdotettu tehokas ja kattava lähestymistapa tunnistaa syy geneettisen vaihtelun taustalla olevia monimutkaisia ​​sairauksia [8], [9].

HEPARANASE on ainoa tunnettu nisäkkään entsyymi, joka hajottaa heparaanisulfaatti (HS) proteoglykaanien tyvikalvoissa ja soluväliaineen [10]. Tämä johtaa purkamista ekstrasellulaarisen esteitä, vapautumista HS-sitoutuneen bioaktiiviset tekijät ja sukupolvi HS-fragmentteja, jotka edistävät kasvutekijä-reseptoriin sitoutumisen ja signalointi [11], [12]. HEPARANASE liittyy vahvasti syövän etenemiseen ja etäpesäkkeitä, kuten solun selviytymisen, invaasio, proliferaatio, uudissuonittumisen, ja luomalla kasvuun salliva mikroympäristölle [13], [14] ja sillä on sekä ennustetekijöitä ja terapeuttisia sovelluksia [15]. HEPARANASE geeni (HPSE), ensimmäinen kloonattu vuonna 1999, sijaitsee kromosomissa 4q21.3 [16]. On ollut muutamia tutkimuksia SNP HPSE geenissä. Molecular epidemiologisissa tutkimuksissa on osoitettu jakelu eroja SNP HPSE eri Israelin juutalaisväestöt [17]. Associations kasvaimen herkkyys on myös osoitettu, mukaan lukien hematologiset maligniteetit ja mahasyövän, mutta tuloksia ei ole yhtäpitävä [18] - [20]. Lisäksi, Shirley Ralphand [21] on osoittanut HPSE haplotyyppi korreloi vaiheisiin munasarjasyövän ja Yue et ai. [20] ovat osoittaneet, SNP: tä korreloi kliinis parametrien ja eloonjäämisaste. Erityisesti tutkimus osoitti, että SNP HPSE liittyi heparanaasin ekspressiotasot ja tarjosi perustan lisätutkimuksia assosiaatiot SNP ja sairauksien [22]. Nämä yhdistys kesto oli pieniä näytteitä.

Äskettäin Hennig G [23] ja Horn H [24] havaittu korkeita genotyypityksen havaitseminen hinnat (93,5% ja 94-97%) ja täysin yhtäpitäviä nopeudella 100%: n DNA: ta normaalista formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset (FFPETs) verrattuna ituradan DNA matrix laserdesorptio /ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrialla (MALDI-TOF MS). Lisäksi muita raportteja myös osoittaneet korkeita genotyypityksen havaitseminen hinnat ja täysin yhtäpitäviä nopeuden kanssa FFPET johdetun DNA lukien vuosikymmeniä vanha lohkojen verrattuna veren samasta yksilöstä muilla menetelmillä, jopa genominlaajuisten genotyypitys [25] - [28]. On todettu, että FFPET johdettuja DNA riitti geneettistä polymorfismia analyysiä. Tässä tutkimuksessa käytimme laaja kokoelma FFPET johdettujen DNA-näytteitä potilaista ja verestä peräisin DNA kontrollit MALDI-TOF MS menetelmä genotyypin ja tutkia mahdollisia yhdistysten kuudesta SNP (rs4693602, rs6856901, rs4364254, rs11099592 , rs4693608 ja rs4328905) tai haplotyyppien HPSE ja kasvaimen herkkyys, kliinis parametrit, ja selviytyminen mahasyövän on suuri näyte Han väestöstä Pohjois-Kiinassa. Tämän seurauksena yksittäisten SNP ja haplotyypiksi havaittiin olevan assosiaatioita etenemisen ja ennusteen mahasyövän.

Tulokset

Aihe ominaisuudet

Keski-ikä oli 56,67 ± 11.923 y ja urosten osuus oli 70,54%, kun kyseessä ryhmässä. Keski-ikä kontrolliryhmässä oli 56,91 ± 11,477 y ja urosten osuus oli 70,54%. Ei ollut jakelu eroja sukupuolen ja iän välillä potilaiden ja verrokkien (P = 1,00 sekä sukupuoli ja ikä). Niistä 404 potilasta, vaiheessa I mahasyövän tapaukset oli 21,0% (85/404), vaihe II mahasyövän tapaukset osuus oli 26,5% (107/404) ja vaiheen III mahasyövän tapaukset oli 52,5% (212/404) ( Taulukko 1).

genotyypin onnistumisprosentteja

Käytimme MassArray typer Analyzer ohjelmisto 4.0.4.20 automaattista spektrien käsittelyä ja genotyypin tunnistaminen. Edustavia MALDI-TOF-MS-profiilit kunkin genotyypin kuuden SNP HPSE oli kuvassa S1. Kaikki SNP olivat polymorfinen vähäisin alleelifrekvensseiltään > 10% ja genotyyppi jakaumat olivat kaikki yhtä mieltä Hardy-Weinberg tasapaino (tuloksia ei ole esitetty). Suuri menestys hinnat, jotka vaihtelevat välillä 96,29% ja 100% (keskiarvo: 99.09%) vuonna FFPETs ryhmässä ja välillä 99,50% ja 100% (keskiarvo: 99.79%) kontrolliryhmässä, olivat (taulukko S1).

Yhdistykset yksittäisten SNP ja kliinis parametrit ja eloonjäämisen

Alleelifrekvenssien ja genotyypin taajuudet kuuden SNP eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä potilaiden ja verrokkien (P > 0,05 ja P > 0,05, kun permutaatio testi Alleelifrekvenssien; P >0,05 ja P > 0,05 kun se on säädetty sukupuolen ja iän genotyypin taajuuksilla, taulukot S2 ja S3).

SNP arvioitiin yhdistysten kanssa kliinis parametreja. rs4364254 genotyypit liittyy histologisia (P = 0,002; taulukko S4), genotyyppi TT korreloi hyvin solujen erilaistumista verrattuna genotyyppi TC /CC (OR = 0,482; 95% CI: 0,300-0,774). Muita SNP ei ollut merkittävää korrelaatioille kliinis parametreja.

univariate analyysissä potilailla kantaen rs4693608 AA genotyyppi oli huono mahasyövän erityisiä eloonjäämisen verrattuna potilaisiin, joiden AG + GG-genotyyppi (P = 0,049, HR = 1,387 , 95% CI: 1,001-1,923, taulukko 2, kuva 1 ja kuva S2). Monimuuttuja analyysissä rs4693608 AA genotyyppi ja rs4364254 TT genotyyppi molemmilla oli huono mahasyövän erityisiä eloonjäämisen (P = 0,030, HR = 1,527, 95% CI: 1,042-2,238 for rs4693608; P = 0,013, HR = 1,546, 95% CI: 1,096-2,181 ja rs4364254; taulukko 2). Myös Borrmann tyyppi (P < 0,001), pT luokka (P < 0,001), pN luokka (P < 0,001), ja lymphovascular invaasio (P < 0,001) olivat merkitsevästi korreloivat selviytymistä univariate analyysiin. Borrmann tyyppi (P = 0,021), pT luokka (P < 0,001), ja pN luokka (P < 0,001) pysyivät merkittävästi korreloi selviytymisen monimuuttujamenetelmin (taulukko 2).

Olotila haplotyypin liittyvä ennusteeseen viittaavia ominaisuudet ja selviytyminen

oli kaksi kahden markkerin haplotyyppi lohkojen välille rakennetaan kuusi SNP meidän tulokset (kuva 2). Lohko 1 koostui rs4693602 ja rs6856901 ja sisälsi kolme yhteistä haplotyyppien (taajuusalue: ,025-+0,850), mikä oli noin 99,9%: lla koehenkilöistä; lohko 2 koostui rs11099592 ja rs4693608 ja sisälsi myös kolme yhteistä haplotyyppien (taajuusalue: 0,091-0,798), mikä oli noin 99,9%: lla koehenkilöistä. Kaikki kuusi yhteistä haplotypes ollut mitään korrelaatiota mahalaukun syövän riski (P > 0,05 ja P > 0,05, kun permutaatio kokeen Taulukko S5).

Associations välillä haplotyyppien HPSE ja mahasyövän viittaavia tekijöitä aikaan diagnoosi oli arvioidaan. Haplotyypin CA lohkossa 2 oli suurempi jakautuminen ryhmässä Borrmann tyyppejä 3 ja 4 verrattuna TG + CG haplotyyppien (P = 0,037; taulukko 3). Haplotyypin jakelu eroja havaittiin PN luokassa (P = 0,045; taulukko 3), CA oli suurempi jakelua N3 ryhmässä kuin N0 ryhmässä verrattuna CG (OR = 1.837,95% CI: 1,010-3,341, P = 0,046 ), mutta ei ollut merkittäviä jakelu eroja N2 ja N0 ryhmien välillä sekä N1 ja N0 ryhmät (P = 0,671 ja P = 0,496, vastaavasti).

haplotyyppien lohkon 2 osoitti merkitsevää eroa kasvaimeen liittyvä selviytymisen. Potilaat kuljettavat CA haplotyyppi oli huono mahasyövän erityisiä eloonjäämisen (CG vs CA: HR = 0,645, 95% CI: 0,421-0,989, P = 0,044; taulukko 4).

Keskustelu

Kuten olemme tienneet, FFPET johdettu DNA: lla on pienempi louhinta tehokkuus ja laatu (pirstoutunut DNA) johtuen osittaisesta nukleiinihapon ristisilloitukseen ja hajoamista kuin verestä peräisin DNA. Mutta arkistoitu FFPETs tarjota korvaamaton lähde molekyyligenetiikan tutkimuksissa useita etuja, kuten (i) ainoa näytteiden saatavilla henkilöille, jotka eivät voi muuten tarjota DNA-näyte, (ii) erinomainen resurssi laajamittainen retrospektiivinen biologisten merkkiaineiden tutkimuksessa ( iii) suuri määrä näytteitä conjunct pitkäaikaisia ​​kliinistä seurantaa data, (iv) arvokas resurssi diagnoosi ja histologinen tunnistus, (v) saatavana resurssi patologian arkistoista. Äskettäin FFPET-uutettua DNA: ta on raportoitu olevan riittävä genotyypin, ja on sallittu biomarkkereiden ja funktionaalinen genomiikka tutkimuksia [23] - [29].

MALDI-TOF-MS-menetelmällä, joka tarjoaa noin 100% tarkkuudella SNP genotyypin pidetään tällä hetkellä kultakantaan [29], [30]. Genotyypin FFPET peräisin olevien DNA-MALDI-TOF MS on osoittautunut luotettavaksi ja toistettavissa. Aiemmin raportit osoittivat, että ei ollut alleelifrekvenssi eroja FFPET johdetut DNA- ja verestä peräisin olevia DNA samasta yksilöstä useilla erilaisilla menetelmillä, mukaan lukien MALDI-TOF MS: [24] - [26], [28]. Pyrkimyksemme osoitti suuri menestys hinnat vaihtelivat 96,29% ja 100% (keskiarvo: 99.09%), jotka olivat yhtäpitäviä aiempien raportoitujen tietojen [23], [24], [29].

SNP stabiilisti periytyvät , erittäin runsas ja osoittaa monimuotoisuutta ja väestöryhmistä, joiden arvellaan olevan houkutteleva biomarkkereita. Kuitenkin soveltaminen yksittäisten SNP on rajoitettu, koska ne ovat alhaiset penetrance ja niiden vaikutukset ovat melko vaikea tunnistaa [5], [31]. Näin ollen, on tärkeää haplotyypin tiedot on yhä yhdistää DNA-sekvenssin vaihtelu taudin [32]. Artikkelit ovat ilmoittaneet, että funktionaalinen SNP HPSE liittyi heparanaasin ilme eroja ja heparanaasin on osoitettu olevan tiiviisti mukana patologisen prosessin etenemistä ja tuloksia taudin [10], [22]. Miten sisällyttää SNP kuitenkin tutkimuksia mahasyövässä alttius ja ennustetta ja miten määrittää todellisen yhdistykset ovat edelleen haastavia tehtäviä.

Ei ollut yksittäinen SNP korreloi mahalaukun syövän riskiä tuloksemme. Liitot neljästä yksittäisten SNP (rs4328905, rs4693608, rs11099592 ja rs6856901) ja mahasyövän riski 155 potilasta ja 204 ohjaa raportoineet Yue et al. [20] olivat mukaisesti tuloksemme. Lisäksi kaikki kuusi yhteistä haplotypes ei ollut merkittäviä eroja mahasyövän riskiä. Tämä johdonmukaisuus osoitti SNP HPSE ollut korrelaatiota esiintyvyys mahasyövän etnisten Han Pohjois-Kiinassa, ei vain näkökulmasta yksittäisten SNP, mutta myös näkökulmasta haplotyyppien.

Meidän olevassa tutkimuksessa, genotyyppi rs4364254 TT korreloi hyvin solujen erilaistumisen. Lisäksi, Ostrovskii et ai. [22] löydetty yksilöiden genotyypin TT hallussaan suhteellisen suuri mRNA tasolla (P = 0,0029). Kuitenkin on ollut ristiriitaisia ​​tuloksia raportoidaan yhdistyksille välillä heparanaasin ilmaisun ja histologisia erilaistumista. Endo K et ai. [33] todettiin, että histologinen eroavuus oli huonompi HEPARANASE mRNA-positiivisia mahasyövän kudoksiin (p < 0,01). Chen JQ et ai. [34] havaitsivat, että histologinen eriyttäminen ei liittynyt heparanaasin mRNA ilmaisun mahasyövän (P = 1,000). Takaomi Ohkawa et ai. [35] osoitti, että heparanaasin ilmentymistä havaittiin kuten vahvempi hyvin erilaistuneita soluja (P = 0,0277), mikä on havainto, että consistents meidän tuloksia. Siksi HEPARANASE saattaa olla mukana solujen erilaistumista, mutta mekanismit eivät ole selviä tällä hetkellä.

univariate analyysissä, potilaat kuljettaa rs4693608 AA genotyyppi oli huono selviytyminen (P = 0,049); monimuuttuja-analyysi, rs4693608 AA ja rs4364254 TT molemmat korreloi merkitsevästi huono selviytyminen (P = 0,030 varten rs4693608 AA ja P = 0,013 varten rs4364254 TT). Mahdollisesti puuttuminen yksimielisyys yhden ja usean analyysi johtui heikosta vaikutuksesta yksittäisten SNP, mutta kun yksittäiset SNP pidettiin yhdessä muiden SNP, Borrmann tyyppi, pT luokka, ja pN luokkaa Monimuuttuja-analyysissä se generated vaikutusta ennusteeseen. On runsaasti todisteita siitä, että geneettiset tekijät edistävät taudin kulkuun yhteistä monimutkainen piirre sairauksia, mutta vaikutus yksittäisen variantin lienee pieni [36]. Lisäksi Ostrovskii et ai. [37] luotiin ensimmäistä kertaa todisteita korrelaatio toiminnallisten SNP rs4693608 ja rs4364254 ja riskien akuutin Käänteishyljintä (GVHD) kehittäminen, ja rs4693608 oli tärkein. Niiden tulokset olivat mukaisesti meidän. Lisäksi, Ostrovskii et ai. [22] ilmoitetaan molemmat rs4364254 TT genotyypin ja myös rs4693608 AA genotyyppi korreloivat suhteellisen korkean mRNA tasolla (P = 0,0029 ja 0,004, tässä järjestyksessä), mikä saattaa osittain selittää huonompi ennuste potilailla, joilla rs4693608 AA tai rs4364254 TT esillä olevassa tutkimuksessa . Nämä havainnot olivat biologisesti uskottava, koska yli-ilmentyminen HPSE oli tiiviisti suurempi invasiivisuus mahasyövän [38] - [40]. Tämänhetkiset tulokset osoittivat meidän olettaa, että SNP olivat mukana säätelyyn heparanaasin ilmaisun, mikä vaikuttaa hyökkäyksen kykyä ja selviytymistä mahasyövässä.

Vaikka kumpikaan genotyyppi rs11099592 CC eikä rs4693608 AA osoitti tilastollista eroa Borrmann tyyppi, haplotyypin CA kokoonpanossa mukanaan teki osoittanut merkittävää eroa. Haplotyypin CA oli suurempi jakauma ryhmässä Borrmann tyyppejä 3 ja 4 (P = 0,037). Kenties potilaalla on haplotyyppi CA olivat todennäköisemmin kehittää huonompi yleinen tyyppi. Sitä paitsi, haplotyypin CA oli suurempi jakelua N3 ryhmässä (P = 0,046 verrattuna N0 ryhmä). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä jakelu eroja N2 ja N0 ryhmien välillä sekä N1 ja N0 ryhmiä. Ehkä oli yhdistyksen välillä haplotyypin CA ja suurempi määrä imusolmukemetastaaseja, mutta se on vielä tutkittava. Lisäksi potilaat kuljettavat CA haplotyyppiä osoitti myös huono mahasyövän erityisiä säilymiseen, mikä oli sopusoinnussa eroja Borrmann tyyppi ja määrä imusolmukemetastaaseja. Lisäksi Ostrovskii et ai. [22] ilmoitti, että rs11099592 CC genotyyppi ja rs4693608 AA genotyyppi korreloivat korkean mRNA: n ilmentymisen (P = 0,0167 ja p = 0,004, tässä järjestyksessä), jotka olivat mukaisesti tuloksemme noin haplotyypin CA. Ehkä absoluuttinen riski liittyy jokaiseen SNP oli pieni, mutta yhdistettynä haplotyyppianalyysissä voivat olla avuksi tunnistamaan yksilöitä on suuri riski taudin etenemistä. Ehkä se oli erityinen haplotypes että on merkittävä rooli mahasyövän invaasiota ja etäpesäkkeiden edelleen vaikuttavat ennusteeseen.

Toimiva haplotyypin lohko koostuu rs11099592 ja rs4693608 löydettiin tuloksemme, joka liittyi Borrmann tyyppi PN luokka ja ennusteen mahasyövän. Toisaalta, SNP rs11099592 on A-G vaihdosta nonsynonymous SNP sijaitsee eksonissa 8, ja tämä muutos johtaa arginiini-to-lysiinin korvaaminen asemassa 307, ehkä johtaa toiminnallinen ero proteiinissa. Toisaalta, SNP rs4693608 sijaitsee intronin 3 ja osoittivat korrelaation selviytymiseen. Yhä enemmän näyttöä siitä, että genomista variantteja ei-koodaavat sekvenssit voivat muuttaa ilmentymistä geenituotteiden muuttamalla geenisäätelyn, eksonin silmukoinnin, mRNA vakautta, arvoituksellinen silmukointikohdista aktivointi ja niin edelleen, mikä voi siksi aiheuttaa taudin fenotyyppejä. Lisäksi haplotypes voivat tarjota osuvampia tietoja kuin yksittäisen SNP [7], [41]. Lisäksi onko geeni transkriptio, säilyttäen solujen erilaistumisen ja induktioon invasiivisen metastaattisen fenotyypin johtuvat suoraan vuorovaikutukseen heparanaasin DNA on vielä osoitettava.

Ostrovskii et al. [22] osoitti tärkeä yhdistyksen välillä yhdistettynä genotyyppien varten rs4693608 ja rs4364254 SNP ja heparanaasin mRNA ilmaisun tasolla. Lisäksi ne jaetaan kaikki yhdessä genotyypit kolmeen alaryhmään (LR-alhainen ilmentyminen, MR-väli ilmaisu, HR-korkea lauseke) mukaan heparanaasin mRNA: n ilmentymisen taso kunkin genotyypin ja he vahvistivat merkittäviä eroja kolmeen alaryhmään yhdistetyn genotyyppien kantajia ja mRNA tasoilla. Lisäksi Ostrovskii et ai. [37] Ensimmäinen havaittu korrelaatioita yhdistetyn genotyyppien varten rs4693608 ja rs4364254 SNP ja Akuutin GVHD kehitystä niiden Seuraava tutkimus tällä alaryhmät analyysillä. Se on tärkeä ja arvokas menetelmä. Lisäksi tämä menetelmä on käyttökelpoinen riskin ennustamiseen liittyy haplotyypin lähestymistapaa seuraavissa kliinisessä käytännössä. Tuleva tutkimus, joka yhdisti mRNA ilmaisun tasolla genotyyppejä tai haplotyyppien HPSE Han väestöstä Pohjois-Kiinassa, voisi käyttää tätä menetelmää.

Koska otoskoko villityypin homozygoottisia oli suhteellisen liian pieni kerrostunut analyysiä kustakin genotyypistä kaikkien kuuden SNP tutkittu tutkimuksessamme emme voineet näyttää tulokset SNP-analyysi kustakin genotyypistä, mutta suoritimme analyysin yhdistettynä heterotsygoottianalyysiin villityypin homotsygootti. Se oli rajoitus Tämän tutkimuksen.

Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa arvioitiin polymorfismia HPSE geenin mahasyövän kanssa MALDI-TOF MS -menetelmää ja arkistoidaan FFPETs suuri Pohjois-Kiinassa tapauskohtaisesti ohjattu kohortti. Löysimme toiminnallinen haplotyypin lohkon koostuu rs11099592 ja rs4693608, joka liittyi Borrmann tyyppi PN luokka ja ennusteeseen; ja SNP rs4693608, joka oli mukana lohkoon osoitti korrelaation selviytymiseen. Nämä tulokset tukevat assosiaatioita SNP HPSE ja mRNA: n ilmentymisen tasoja raportoinut aiemmin Ostrovskii et al. [22]. Lisäksi kuusi yksittäistä SNP ja haplotypes eivät korreloi mahalaukun syövän riskiä. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​alkuperäistä oletukseen, että heparanaasin oli mukana syövän eteneminen ja metastaasit ja vaikuttaa ennusteen lopulta, mutta se ei ollut osallisena syöpätapausten.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden kerääminen

404 potilaalla on histopatologisesti vahvistettu mahasyöpä, jotka olivat saaneet radikaaleja välillä tammikuun 1998 ja joulukuun 2004 on peräkkäin valittu. Potilaat olivat Pohjois-Kiinassa ja uskottiin olevan hyvä edustajia tämän alueen. 404 normaali mahan kudosnäytteitä saatiin segmentti resektoitua yksilöitä kauimpana kasvain (> 10 cm) ja FFPETs oli arkistoitu Surgical Oncology osaston ensimmäinen sairaala Kiinan Medical University Pohjois-Kiinassa. Kaikki näytteet kiinnitetään ja imeytetään tavanomaisissa kliinisissä histologisia olosuhteet ja säilytettiin huoneen lämpötilassa. Parafiinileikkeitä FFPETs värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H &E) ja patologisia tarkastus vahvistaa puuttuessa kasvainkudos. Kasvain histologinen arvosana arvioitiin mukaan Maailman terveysjärjestön kriteerien ja kasvaimia lavastettuja käyttäen seitsemäs painos TNM lavastus International Union Against Cancer (UICC) /American sekakomitean Cancer (AJCC) järjestelmä (2010), joka perustuu leikkauksen jälkeisiä patologisen tarkastelu yksilöitä. Täydellinen patologinen tulokset saatiin kuten ikä, sukupuoli, päivämäärä leikkaus, sijainnista primaarikasvaimen, histologinen, laskimoiden invaasio, lymphovascular invaasio, syvyys hyökkäystä, määrä LNS haetaan, useita metastaattisen LNS, ja useita kasvain talletusten noudetaan. Ne (i) kanssa synkroninen tai metachronous pahanlaatuiset kasvaimet, (ii) etäpesäkkeiden havaittu ennen leikkausta, (iii), joille tehtiin preoperatiivinen sädehoitoa tai kemoterapiaa, tai (iv) puutteellisilla patologinen syötetyt tiedot jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Seuranta valmistui koko tutkimuksen väestöstä tammikuussa 2010. Kaksi potilasta kuoli leikkauksen jälkeen ja 21 potilasta menetettiin seuranta-aikana, siis 381 potilasta osallistui selviytyminen analyysiin. Mediaani ja keskimääräinen seuranta-aikoja olivat 90,0 kuukautta ja 93,3 ± 20,24 kuukausi (vaihteluväli: 61-136 kuukautta), tässä järjestyksessä. Seuraavat tulokset saatiin kaikille potilaille: kuolinpäivä (tarvittaessa), kuolinsyy (tarvittaessa), ja päivämäärä seurannan. Ensisijainen päätepiste oli syy-specific eloonjäämisen kesto alkaen mahasyövän diagnoosi kuolinpäivä. 5 vuoden eloonjäämisaste 404 potilaista oli 54,2%.

404 verinäytteitä saatiin syöpää vapaa henkilöt valittiin satunnaisesti perustuen lääkärintarkastuksissa joulukuussa 2009 elokuussa 2011 kuin kontrolliryhmässä, ja tämä ryhmä uskottiin olevan hyvä edustus väestöstä Pohjois-Kiinan alueella. Valintakriteerit ei sisältynyt yksilöllinen syöpä, taajuus vastaa tapauksiin sukupuoleen ja ikään ja yksilöt eivät liittyneet etnisen Han-kiinalaisia. Näytteet (etyleenidiamiinitetraetikkahappo [EDTA] anticoagulate) säilytettiin -20 ° C: ssa 30-40 minuuttia, ja siirretään sitten pakastimessa -80 ° C: seen 2 tai 3 päivän ajan sen jälkeen.

tutkimuksen hyväksyi Research Ethics komitean Kiinan Medical University, Kiina. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikista potilaista ennen tutkimukseen osallistuneiden.

DNA: n eristämiseksi

Perimän DNA uutettiin FFPET koekappaletta ryhmässä. Osiot jonka paksuus on 8 um ja pinta-ala on enintään 250 mm ^{2 valmistettiin mikrotoomin DNA eristettiin 6 ja 12 kohdat, riippuen kudosten kokoa ja solumäärät. Mikrotomiin puhdistettiin ja terät muutettiin välttämiseksi intersample saastuminen. DNA uutetaan FFPETs suoritettiin QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) [29], noudattamalla valmistajan kuvaamaa, mukaan lukien (i) liukenevat parafiinia ksyleenissä ja poistaa, (ii) hajottavat näyte denaturoivissa olosuhteissa proteinaasi K, (iii) kääntämiseksi formaliinilla silloittamalla inkuboinnin 90 ° C: ssa, (iv) sitoutuvat DNA kalvolle ja mahdollistaa epäpuhtauksien virrata, (v) pestään jäljellä epäpuhtauksia, ja (vi) eluoidaan puhdas ja konsentroitiin DNA kalvon (tris-EDTA-puskuriin [TE]). Noin 2-10 ug DNA otettiin talteen 50 ul: aan lopullista liuosta, ja sitä säilytettiin -80 ° C: ssa.}

Genominen DNA uutettiin verinäytteet kontrolliryhmän kanssa Universal Genominen DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TAKARA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Noin 2-6 ug DNA: erittyi TE ja sitä säilytettiin -80 ° C: ssa.

Valikoima SNP ja genotyypityksen

Tutkimuksessa oli mukana kuusi SNP HPSE, joka otettiin NCBI SNP tietokanta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) ja HapMap tietokanta (faasi III-tietokanta) (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.zh ). Nämä SNP: t olivat kartoitettu HPSE geenin (kuvio 2). rs 11099592 oli ainutlaatuinen, paitsi pieni alleelin taajuus (MMM) > 1%, mutta myös polymorfinen Han Kiina Peking (HCB) väestö kaikille koodausalue SNP (cSNPs) in HPSE, joka rekisteröitiin tietokannoissa. Lisäksi muut viisi SNP sijaitsivat introni- ja 3'-UTR alueilla. Lisäksi muut tutkijat ovat osoittaneet, että rs11099592, rs4693608, ja rs4364254 korreloivat heparanaasin mRNA: n ilmentymisen [22]. Myös yhdistysten yksittäisten SNP tai haplotyyppien HPSE ja alttius, kliinis parametrit ja ennusteen kasvaimen raportoitu näissä artikkeleissa oli monimutkainen, mutta enimmäkseen keskittynyt kuuteen SNP valitsimme [17] - [22].

SNP genotyypitettiin käyttäen MALDI-TOF-MS-järjestelmä (MassARRAY, Sequenom, San Diego, CA, USA) käyttäen alukkeita ja koettimia (taulukko S6), kuten aiemmin on kuvattu [29], [42]. Varmistaakseen kirjoittamalla laatu, 1% positiivisia näytteitä (Yanhuang -solukanta) sisällytettiin jokaiseen genotyyppitestien levy vahvistaa luotettavuutta alukkeiden ja 1% negatiivisista näytteistä (vesi ilman DNA: ta) valvoa saastumista. 5% satunnaisotoksia testattiin kahtena eri henkilöt toistettavuus oli 100%. Laboratorion henkilökunta sokaisi näytteeseen järjestely prosessin aikana. Oli kuusi vaihetta, mukaan lukien PCR-monistus, katkaravun alkalisella fosfataasilla käsittely, base extension, suola poisto hartsista, SpectroCHIP annostelu (Sequenom, San Diego, CA, USA), ja tiedot yrityskauppojen MALDI-TOF-MS mukainen Justenhoven et ai. [43]. Lopuksi, data-analyysi suoritettiin käyttäen MassArray typer Analyzer ohjelmisto 4.0.4.20 (Sequenom, San Diego, CA) [44].

LD lohkon määrittämistä ja haplotyyppi rakentaminen

Haploview 4.2 ohjelmistoa käytettiin arvioida LD ja rakentaa haplotypes [31]. LD että kuuden SNP käytetty haplotyyppianalyysissä mitattiin pareittain D 'tilastotieto. Rakenne LD lohkon tutkittiin käyttäen menetelmää, Gabriel et ai. [45], käyttäen 80%: n luottamusväli rajat D "määritellä historiallisesti välisen rekombinaation SNP. Haplotypes konstruoitiin genotyypin tietojen täysikokoinen tapauskohtaisesti ohjauspaneelin sisällä lohkoja käyttämällä nopeutettua EM-algoritmi menetelmä [46]. Lyhyesti, tämä menetelmä tuottaa erittäin tarkkoja väestön frekvenssiarviot vaiheittaisen haplotyyppien perustuu suurimman uskottavuuden joka määritetään unphased input [47].

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen PASW Statistics 18.0 ohjelmisto (SPSS, Inc., Somers, NY, USA). Kaksipuolinen chi-neliö (χ2) testiä käytettiin arvioimaan populaatiojakauman ominaisuudet, vertailla eroja alleeliset ja genotyyppisten taajuudet tapausten ja kontrollien välillä sekä arvioida assosiaatioita yksittäisten SNP ja kliinis parametrit. Permutaatio menettely (1000 testit) käytettiin korjaamaan P-arvo on yhden lokuksen assosiaatiotulosten. Kertoimet suhde (OR) ja luottamusvälit (CI 95%) laskettiin ehdoton logistinen regressio analysoida yhdistyksen välillä genotyypin taajuuksien ja mahalaukun syövän riskiä, ​​ja korjattiin sukupuolen ja iän mukaan. Yhden ja usean eloonjääminen analyysi tehtiin siksi, että log-rank-testi ja Coxin suhteellisten riskien mallia käyttäen kliinis parametreja ja SNP. Tämä johti tunnistamiseen kovariaatit joka korreloi merkitsevästi selviytymisen potilaista. Monimuuttuja eloonjääminen analyysi suoritettiin erikseen lisäämällä SNP muuttujat kaikille kliinis parametrit. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin kartoittamaan eloonjäämiskäyrät. Haploview 4.2 ohjelmistopaketti käytettiin: arvio pareittain kytkentäepätasapaino- (LD), havaita poikkeamat Hardy-Weinberg tasapaino, rakentaa haplotyypin ja laskea haplotyyppifrekvenssit ja arvio assosiaatioita haplotypes ja mahasyövän riskiä.

• PLoS ONE: S100A6 proteiini säätelee negatiivisesti CacyBP /SIP-estoa mahasyövän Cell Proliferation ja Tumorigenesis
• PLoS ONE: Meta-analyysi interleukiini-8 -251 Promoottori polymorfismi Associated kanssa mahasyövän Risk