PLOS ONE: Ciblage cadhérine-17 Ras inactive /Raf /MEK /ERK Signalisation et Inhibe la prolifération cellulaire dans gastrique Cancer

Résumé

cadhérine-17 (CDH17), un membre du 7D-cadhérine superfamille, a été surexprimé dans le cancer gastrique (GC) et a été associée à une mauvaise survie, la récurrence de la tumeur, les métastases, et le stade de la tumeur avancée. Jusqu'à présent, la fonction cellulaire et de signalisation mécanisme de CDH17 en GC reste incertaine. Dans cette étude, nous avons montré que plus de 66% des lignées cellulaires GC (20/30) étaient CDH17 positive. microréseau tissulaire (TMA) analyse a montré que 73,6% des tissus du GC chinois (159/216) étaient CDH17 positif, alors que 37% des tissus normaux adjacents respectifs étaient CDH17 positive. Knockdown de CDH17 a inhibé la prolifération cellulaire, la migration, l'adhésion et la formation de colonies, et a également induit un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans les cellules AGS de GC humaine. D'un autre côté, la surexpression de CDH17 a facilité la croissance tumorale GC MGC-803 chez des souris nude. matrice d'anticorps et un essai par Western blot ont montré que knockdown de CDH17 dans les cellules AGS de l'intégrine β protéines série régulée à la baisse, en outre inactivés la /Raf /MEK /ERK Ras et a conduit à la p53 et l'accumulation de p21, ce qui a entraîné l'inhibition de la prolifération du cycle cellulaire arrêter et induction de l'apoptose. Collectivement, nos données démontrent d'une part la capacité du CDH17 de réguler l'activité de Ras /Raf /MEK /ERK pour la prolifération des cellules en GC, et suggèrent que CDH17 peut servir de cible thérapeutique attrayante pour la recherche future.

Citation: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Z Zhou, et al. (2014) Ciblage cadhérine-17 Ras inactive /Raf /MEK /ERK signalisation et inhibe la prolifération cellulaire dans le cancer gastrique. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10.1371 /journal.pone.0085296

Editeur: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, France

reçues: 10 Juin 2013; Accepté 26 Novembre 2013; Publié 20 Janvier, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Lin et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents: Tous les auteurs sont des employés ou anciens employés de Roche R & D Center (Chine), sauf Yanfen Fang, qui est employé de East China normal University, Shanghai, Chine.. Cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs à tous les PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage.

Le cancer gastrique Introduction (GC) est classée comme la deuxième cause de mortalité dans le monde du cancer et le quatrième cancer le plus répandu dans le monde entier [1], [2]. La durée médiane de survie des patients atteints de GC est 7~10 mois. La plupart des patients atteints de GC présent avec la maladie à un stade avancé avec une survie globale à 5 ans d'environ 20% et les taux de réponse objective à classique chimiothérapeutique gamme de régimes peuvent être améliorés de 20% à 40% [1], [3]. Actuellement, la thérapie à base de cisplatine est encore largement utilisé dans les milieux cliniques pour GC avancé ou métastatique. En outre, pour HER2-neu surexprimant adénocarcinomes gastriques, trastuzumab (Herceptin) en combinaison avec la chimiothérapie prolonge la survie globale médiane de 11,1 mois (chimiothérapie seule) à 13,8 mois [4]. Compte tenu du taux de mortalité élevé de GC, il y a encore un énorme besoin médical non satisfait pour trouver le biomarqueur sensible et fiable pour le diagnostic précoce du GC et cible thérapeutique efficace pour le traitement de GC.

CDH17, un membre du 7D-cadhérine superfamille, présente dans le foie du fœtus et du tube digestif pendant l'embryogenèse, ainsi est également nommé comme le foie-intestinal cadhérine (LI cadhérine). CDH17 est surexprimée dans le carcinome hépatocellulaire [5], [6], le cancer gastrique [7], le cancer canalaire pancréatique [8] et le cancer colorectal [9] - [11]. Comme indiqué, CDH17 est principalement présent sur la membrane cellulaire et absente dans les tissus gastriques normaux et le taux positif était à peu près 78,4% [12]. Le niveau de CDH17 d'expression était caractéristique du cancer gastrique avancé qui a été associée à un mauvais pronostic [13]; et il a également été significativement associée à la métastase des ganglions lymphatiques dans le cancer gastrique [14]. CDH17 knockdown médié par lentivirus miARN a inhibé la prolifération, l'adhésion, la croissance tumorale et les métastases des cellules humaines BGC823 gastriques cancéreuses in vitro et in vivo [15] - [17]. CDH17 a été proposée comme un oncogène et un marqueur utile pour le diagnostic des cancers gastriques [18]. Il a été mis en évidence que la signalisation oncogénique CDH17 médiation dans le CHC est en relation avec la voie de signalisation Wnt [5]. Récemment, il a été signalé que CDH17 induit la tumorigenèse et la métastase lymphatique dans GC par l'activation de NFkB voie [19] signalisation. CDH17 réglementé α2β1 intégrine de signalisation pour induire la kinase d'adhésion focale spécifique et l'activation de Ras, ce qui conduit à l'augmentation de l'adhésion et la prolifération cellulaire dans les cellules cancéreuses du côlon [11]. Cependant, le principal mécanisme de rôle et la signalisation de CDH17 GC reste incertaine. Dans cette étude, pour valider CDH17 comme une cible thérapeutique potentielle pour GC et d'étudier le mécanisme de signalisation du CDH17 GC, nous avons caractérisé l'expression de CDH17 dans des lignées cellulaires de GC et de tissus humains GC chinois, vérifié l'influence du CDH17 knockdown ou sur- expression sur l'effet tumorigène et métastatique de lignées cellulaires de GC, et a exploré les cascades de signaux possibles liés à CDH17. Nous avons observé une forte expression CDH17 dans des lignées cellulaires de GC et de tissus humains GC chinois et une nette inhibition de la prolifération cellulaire, la migration, l'adhérence, la formation de colonies, induction de l'apoptose, et l'arrêt du cycle cellulaire après silence de CDH17 dans des lignées cellulaires de GC humaines. De plus, nos résultats montrent tout d'abord la capacité de CDH17 de réglementer l'activité de l'intégrine-Ras /Raf /MEK /ERK pour la prolifération des cellules en GC, et suggèrent que CDH17 peut servir de cible thérapeutique attrayante pour la recherche future.

Matériel et méthodes

éthique déclaration

l'utilisation et le soin des animaux de laboratoire a été approuvé par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC), Roche R & D Center (Chine). Les blocs de tissus GC humains avec des blocs de tissus adjacents correspondants ont été obtenus à partir de Shanghai biopuces Company, une société de services de CRO. Tous les tissus humains ont été recueillies avec le consentement écrit des patients source. Toutes les lignées cellulaires ont été achetées auprès de l'ATCC, USA, Collection japonaise de bioressources de recherche, et Shanghai Instituts de biochimie et de biologie cellulaire, l'Académie chinoise des sciences.

Les lignées cellulaires et

Toutes les lignées cellulaires de Réactifs de la Collection américaine cellulaire typique (ATCC), Collection japonaise de bioressources de recherche, et Shanghai Instituts de biochimie et de biologie cellulaire, l'Académie chinoise des sciences ont été maintenues dans un milieu de croissance respectif qui ont été recommandés par les vendeurs. PMD-18T-CDH17 plasmidique était de Sino biologique Inc. tétracycline (Tet) était de sigma, Cell Counting Kit-8 était de Dojindo moléculaire Tech. La fibronectine de plasma humain a été de R &D Systems. chambre Transwell était de Corning (6,5 mm de diamètre, la taille des pores de 8 pm). CDH17 siRNA oligo était de Genepharma Co. avec la séquence 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Scram contrôle de l'ARN (Allstar®) était de QIAGEN.

Tissue micro réseau immunohistochimie

Deux cent seize paraffine gastriques blocs de tissus cancéreux conjointement avec des blocs de tissus adjacents correspondant (tissu adjacent a été échantillonnée au moins 5 cm des tumeurs primaires) ont été recueillies et déposées par Shanghai biopuces Company. Les tissus ont été sectionnés et préparés de manière aléatoire sur 3 diapositives de tableau micro. L'âge des patients étaient 32-84 ans (médiane de 65 ans) avec la mise en scène de 1A-4 selon American Joint Committee on Cancer (AJCC) des lignes directrices ver.7. Tous les cas ont été diagnostiqués par deux pathologistes supérieurs avec spécialité expérimenté en pathologie du cancer gastrique. Les lames ont été incubées dans un sérum de blocage pendant 20 min, puis recouverte de 100 pi de cadhérine-17 purifiée par affinité monoclonal anti-humain Ab IgG de souris (R & D MAB1032 1:2000 dans TBS /T) à 4 ° C pendant une nuit. Les lames ont été couverts par 100 pi DAKO Envision + /HRP, lapin /souris après avoir été soigneusement lavés avec du TBS. Cent microlitres de solution de substrat chromogène (DAB) ont été appliquées sur les lames et mises en incubation à température ambiante pendant 10 min. diapositives colorées ont été examinées au microscope par deux experts d'immunohistochimie. L'IgG de souris normale a été utilisé comme témoin négatif. La coloration a été considéré comme négatif en l'absence de coloration de la membrane cellulaire positive pourrait être identifiée et positive lorsque plus de 10% des cellules tumorales a montré la membrane cellulaire positive immunocoloration.

TR lignées cellulaires stables

Le pLenti6 /TR vecteur (Invitrogen, No. cat. V48020) et pLenti3.3 /TR vecteur (Invitrogen, Cat. n ° A11114) ont été utilisées pour générer des lignées cellulaires stables qui expriment constitutivement des taux élevés du répresseur Tet. Ces plasmides d'expression contiennent des éléments qui permettent l'emballage de la construction dans les virions et la blasticidine ou d'un marqueur de résistance à la généticine pour la sélection de lignées cellulaires transduites de manière stable. En bref, les cellules d'emballage 293FT (Invitrogen, Cat. N ° R700-07) ont été transfectées avec le pLenti6 /TR ou pLenti3 /TR et ViraPower ^{TM Packaging Mix (Invitrogen, Cat. No. K4975-00) pour produire lentiviral particules. Lentivirus ont été utilisés pour transduire des cellules AGS ou MGC-803 et de la blasticidine (8 pg /ml, Invitrogen, Cat. N ° R210-01) ou de généticine (200 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. 10131-027) était utilisé pour sélectionner pendant les cellules AGS TR exprimant stables nommés TR-AGS lignée cellulaire stable ou TR exprimant MGC-803 cellules nommé TR-MGC-803 lignée cellulaire stable. Ces lignées cellulaires TR exprimant ont été utilisés comme hôtes pour des constructions d'expression qui facilitent l'expression Tet-régulée de CDH17 shRNA (ARN en épingle à cheveux courte) ou le gène CDH17, respectivement}

. Cellules AGS stables avec l'expression Tet-régulée shRNA du gène CDH17

oligonucléotides Quatre miARN ciblant le gène CDH17 ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) ont été conçus à l'aide d'un système d'application Internet (Invitrogen). Ces ADN double brin a été ligaturé dans le pcDNA6.2 ™, système d'expression -GW /EmGFP-miR (Invitrogen, No. cat. K4936-00) qui ont ensuite été transitoirement transfecté dans les cellules AGS par les procédures standard de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat . No. 11668-027). Selon l'analyse PCR en temps réel, la séquence 90-2 (Amorce sens: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; amorce inverse: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') de miARN a montré la plus grande efficacité et a été choisi pour la forme par BP recombinaison pour obtenir pENTR-miARN. Ce vecteur d'entrée a été ensuite utilisé dans LR recombinaison avec pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. K4920-00) pour obtenir pLenti4 /TO /lentivirus V5-miARN en utilisant la technologie Gateway® (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus ont été utilisés pour transduire des cellules stables TR-AGS et 200 pg /ml de zéocine (Invitrogen, No. cat. R250-05) a été utilisée pour sélectionner une écurie CDH17 cellules d'expression shRNA régulés par tet nommés TR-AGS-cellulaire stable CDH17_KD ligne.

Stable MGC-803 cellules avec surexpression Tet-régulé du CDH17 gène

en bref, la séquence CDH17 a été amplifié à partir de PMD-18T-CDH17 plasmidique (sino biologique Inc.) et sous-cloné dans IRES vecteur -EGFP pour obtenir CDH17-IRES-EGFP en utilisant amorces: amorce sens: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; amorce inverse: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Cette construction a été utilisée pour effectuer une recombinaison BP pour obtenir pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Ensuite, le vecteur d'entrée et pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. V370-06) vecteur ont été utilisés dans LR recombinaison pour obtenir pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Puis le lentivirus ont été produits pour la transduction-MGC-803 TR cellules stables et 4 ug /ml de blasticidine a été utilisé pour sélectionner un stables cellules d'expression génique CDH17 Tet réglementés nommés TR-MGC-803-CDH17_Over lignée cellulaire stable.

la prolifération cellulaire test

Pour siARN essais de transfection transitoire, les cellules ont été ensemencées dans 10 cm plat avec une densité de 5 x 10 ^{6 cellules /boîte et transfectées avec 20 nM siCDH17 ou scramble siRNA. Après 48 heures d'incubation, les cellules ont été dissociées et transférées à la plaque de 96 puits à la densité de 3000 cellules /puits, puis incubés pendant une autre 72 h. La viabilité cellulaire a été testée avec la CCK-8 kit (Donjindo, Japon). Pour les cellules AGS stables CDH17_KD TR inductible, les cellules ont été ensemencées dans 60 mm x 15 mm, plat et traitées avec ou sans Tet (0, 2,5 et 5,0 pg /ml) pendant un temps différent. Les cellules ont été récoltées au bout de 2, 3, 4, 5 et 6 jours et le nombre de cellules ont été comptées par Cell ScepterTM poche automatisé Compteur (Millipore). Pour l'essai de sauvetage de prolifération, des cellules stables AGS CDH17_KD TR inductibles ont été ensemencées dans 60 mm x 15 mm, plat et cultivés pendant 10 jours avec ou sans 5,0 pg /ml Tet. Pour le groupe de sauvetage, le milieu de culture contenant Tet a été remplacé par un milieu frais le jour 4, et les cellules ont continué à être cultivées au jour 10. Les cellules de chaque groupe ont été récoltés le jour 2, 4, 6, 8 et 10 pour le nombre de cellules de comptage et l'analyse Western blot.}

la migration cellulaire test

TR-AGS-CDH17_KD cellules stables ont été ensemencées dans 10 cm plat et traités avec ou sans Tet (5 ug /ml). Après 120 h de culture, les cellules ont été recueillies et comptées. 0,1 ml de suspension de cellules (1, 2, 3 x 10 ^{4 cellules /ml) ont été ajoutés au compartiment supérieur de la chambre. 0,6 ml de milieu à 10% de FBS a été ajouté au compartiment inférieur comme un attractant chimio. Après 24 h d'incubation à 37 ° C, les cellules ont été fixées avec 90% d'EtOH à 4 ° C pendant 30 min, puis colorées avec du violet cristal à 0,1% pendant 15 min. Les cellules non migrantes ont été retirées de la face supérieure de la membrane Transwell avec un coton-tige. Les cellules colorées ont ensuite été photographiées et comptées en microscopie optique.}

L'adhésion cellulaire test

cellules stables TR-AGS-CDH17_KD ont été ensemencées en boîte de 10 cm et traités avec ou sans Tet (5 ug /mL). Prérevêtement des plaques à 96 puits a été effectué par des puits d'incubation avec 25 ug /ml de fibronectine à 4 ° C pendant une nuit. Afin de réduire la liaison non spécifique, 1% de sérum albumine bovine (BSA) ont été ajoutés à chaque puits et mis en incubation pendant 60 min à 37 ° C, la BSA a été lavé deux fois avec du PBS stérile. 120 heures après l'effet de choc avec CDH17 Tet, les cellules ont été recueillies et ensemencées dans des plaques à 96 puits pré-enduits avec 4 x 10 ^{4 cellules /puits. 2 h plus tard, les cellules non adhérentes ont été éliminées par lavage avec du PBS stérile pour deux fois. Les cellules adhérentes ont été dosés par le kit de CCK-8.}

colonie de test de formation

Tout d'abord, des plaques à 6 puits ont été préparés avec une couche de gélose inférieure (gel à 0,6%). Ensuite, les cellules TR-AGS-CDH17_KD ou siCDH17 cellules transfectées (comme test de prolifération) ont été mis en suspension dans un milieu complet contenant 0,3% -0,4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) et ensemencées dans préparé plaque de 6 puits et cultivées pendant 7 ou 14 jours. Les cellules ont été colorées avec du bromure de thiazolyle tétrazolium (MTT) pendant 2 h. Le nombre de colonies de cellules a été compté.

Analyse du cycle cellulaire

TR-AGS-CDH17_KD cellules stables ont été ensemencées dans une plaque de six à 1,0 x 10 ^{5 cellules /puits et traité avec 5 pg /ml Tet. 120 heures plus tard, les cellules ont été récoltées avec de la trypsine et fixées avec du EtOH à 4 ° C pendant 3 h. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 1500 g pendant 5 minutes et on les lave avec du PBS. Remise en suspension des cellules dans des solutions RNase /PBS (20 pg /ml), incubées à 37 ° C pendant 15 min, puis on a ajouté des solutions PI /PBS (20 pg /ml) et on fait incuber à température ambiante pendant 30 min, a inspecté les cellules colorées avec BD FACS Calibur et analysé les données avec le logiciel BD CellQuest Pro.}

apoptose analyse

TR-AGS-CDH17_KD cellules stables ont été ensemencées dans une plaque de six à 1,0 × 10 ^{5 cellules /puits et traitées avec 5 ug /ml Tet. 120 heures plus tard, les cellules ont été récoltées avec de la trypsine et lavées avec du PBS pré-refroidi une fois. Les cellules ont été remises en suspension dans 500 ul de tampon 1 x 5 pi et pi et 5 pi AnnexinV (BD), on a ajouté de liaison. Après incubation dans l'obscurité (température ambiante) pendant 10 minutes, les cellules colorées ont été examinées avec BD FACS Calibur. Les données recueillies ont été analysées avec le logiciel CellQuest Pro BD.}

Analyse par Western Blot

Les cellules ont été lysées par tampon RIPA [NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,25% de désoxycholate et 10 mM de Hepes (pH 7.4)] contenant un cocktail d'inhibiteurs de protease (Roche Molecular Biochemicals). Les concentrations de protéines ont été quantifiés en utilisant la méthode de l'acide bicinchoninique (BCA) (Pierce). Trente microgrammes de protéine par échantillon ont été bouillies dans un tampon de charge et soumis à une électrophorèse dans des gels à gradient 8-12% de Polyacrylamide SDS (Invitrogen) et transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été sondées avec un anticorps (CDH17 intégrine ß1, β4 intégrine β5 intégrine, p-p53, p53, p21 étaient de R & D, Raf, p-MEK, de la MEK, le p-ERK, ERK était de signalisation cellulaire, et K-Ras est de Santa Cruz) et suivie d'une immunoglobuline conjuguée à la peroxydase. Western blots ont été visualisées avec une chimioluminescence amplifiée (ECL) kit (GE, Santé)

Les puces à anticorps test

Trois types de tableaux d'anticorps ont été obtenus à partir de R &. D Systems, Inc. pour l'anticorps matrices dosage. Human Phospho-Kinase Kit Array (Cat. No. ARY003) contient 43 kinases différentes. Kit Array récepteur soluble humain Panneau de non-hématopoïétiques (Cat. No. ARY012) contient 119 récepteurs solubles différents. Human Kit Array Apoptose (Cat. No. ARY009) contient 35 anticorps de l'apoptose différents. Des informations plus exhaustives sur ces tableaux peuvent être trouvées dans le lien de la R & D Systems: http://www.rndsystems.com/. cellules stables TR-AGS CDH17_KD ont été récoltées au bout de 120 h traitées avec ou sans Tet (5 pg /ml) et les protéines ont été lysées par un tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase, des extraits cellulaires ont été dilués et incubés avec les trois types de matrices d'anticorps durant la nuit . Les matrices ont été lavées pour éliminer les protéines non liées, suivie d'une incubation avec un cocktail d'anticorps de détection biotinylé. Toutes les procédures sont selon les instructions du kit. Les transferts ont été analysés par densitométrie, et l'expression de la protéine a été normalisée à un contrôle positif qui a été représenté dans chaque membrane.

Mesure de l'activité in vivo

cellules TR-MGC803-CDH17_Over (1 × 10 ^{7 cellules dans 0,2 ml de PBS) ont été injectés dans l'aisselle gauche de 5~6 semaines BALB /c nu /nu athymiques souris femelle (SIPPR sino-britannique /BK Lab. animale Ltd, Chine). Le volume des tumeurs (mm 3) a été mesurée avec des pieds à coulisse et calculé en tant que (W 2 x L) /2, où W est la largeur et L la longueur. Lorsque le volume tumoral a atteint ~ 100 mm 3, les souris ont été randomisés en deux groupes (9 souris dans chaque groupe). Tetracylcine induction (Invitrogen, 0,2 mg /ml, fourni dans l'eau potable stérile contenant 2,5% de saccharose) a été initialisé au jour le regroupement. stérilise l'eau potable contenant 2,5% de saccharose a été fourni aux souris du groupe non induit. Les volumes des tumeurs ont été enregistrés tous les 3 jours jusqu'à ce que les animaux ont été sacrifiés. Après 35 jours d'induction, les tissus tumoraux de xénogreffe ont été recueillies et soumises à une analyse Western blot pour l'expression relative de la protéine.}

L'analyse statistique

Les données ont été exprimées en moyenne ± e.t. et statistiquement soumis à un test t de Student non apparié. Un niveau de P < 0,05 a été considérée comme significative

Résultats

profil d'expression de CDH17 dans le cancer gastrique

Le niveau d'expression des protéines CDH17 dans 30 lignées cellulaires ont été classés. en 4 groupes en fonction des données provenant de l'analyse de la densité optique contre la bêta-actine. lignée de cellules AGS a été utilisé comme étalon interne pour éviter l'écart entre les gels. Plus de 66% des lignées de cellules de GC (20/30) étaient CDH17 positive (figure 1A).

L'expression et la localisation de CDH17 dans la section de paraffine de tissu primaire a été détectée par immunohistochimie sur des microréseaux de tissus. Par rapport aux lames de contrôle colorées par IgG de souris normale, CDH17 mAb coloration a été démontré clairement la localisation de la membrane cellulaire (figure 1B). Parmi 216 cas avec confirmé le rapport de diagnostic de la pathologie, 73,6% des tissus cancéreux (159/216) hébergeaient tache CDH17 positive avec la notation de + à +++, tandis que 37% positif tache CDH17 dans les tissus normaux adjacents respectifs (tableau 1). Dans les cas positifs CDH17, le niveau de CDH17 d'expression a une corrélation positive avec métastases ganglionnaires. Cependant, le niveau d'expression est associée à une invasion inverse gastrique de paroi, une tumeur des métastases à distance, et les étapes TNM des tumeurs. Notre observation était conforme aux précédents rapports cliniques [20] - [22]. Parmi les cas positifs CDH17, les tissus cancéreux ont présenté une coloration plus forte de CDH17 (32,1% en notation + 25,2% avec le ballon ++ et 42,8% en notation +++) que celle des tissus normaux adjacents (62,5% en notation + 21,3% avec marquant ++ et 16,3% en notation +++). Même si aucune relation significative n'a été observée entre le score de coloration et le stade clinique. Prenant tout cela en évidence ensemble, CDH17 peut être un marqueur de diagnostic pour le cancer gastrique à un stade précoce dans les populations chinoises.

ARNi médiée abattre CDH17 sur des lignées cellulaires de GC a montré la suppression de la prolifération cellulaire et la formation de colonies in vitro

sur la base des résultats du CDH17 profil d'expression dans un panel de lignées cellulaires de GC (figure 1A), AGS (CDH17 supérieur), BGC-823 (CDH17 inférieur) et HGC-27 (aucun CDH17) lignées cellulaires ont été sélectionnés pour des dans l'évaluation fonctionnelle cellulaire in vitro avec l'ARNi médiée par silençage CDH17. Western blot a montré que les cellules AGS avaient haut niveau de protéine CDH17 et l'expression de CDH17 a été renversé presque totalement par siCDH17. cellules BGC823 avaient un faible niveau de protéines CDH17 et HGC-27 avait aucune protéine CDH17 (figure 2A). En comparaison avec les cellules de contrôle de brouillage, CDH17 abattre eu peu d'effet sur la capacité proliférative des cellules BGC823 et HGC27, avait alors effet dramatique sur AGS (de 60% à 72 h, la figure 2B). dosage agar mou a montré que la capacité de former des colonies a été inhibée dans les cellules AGS si CDH17 était knock down (de 66% à 14 d), mais en BGC823 cellules et HGC27 cellules, CDH17 abattre avait peu d'effet sur la capacité de formation de colonies (Figure 2C). Il n'y avait pas de différence évidente entre les BGC823 cellules (faible niveau CDH17) et HGC-27cells (non CDH17) dans l'inhibition de la prolifération et la formation de colonies induite par le siRNA CDH17 effet de choc.

lignées cellulaires stables portant TR knock-down inductible CDH17 dans les cellules AGS et surexpression de CDH17 dans MGC-803 cellules

La séquence cible dans exon13 (90-2) n'a donné ci-dessus 90% de réduction dans le niveau d'ARNm (figure 3A). Ensuite, nous avons utilisé pLenti4 /TO /V5-miARN-90-2 CDH17 lentivirus pour transduire des cellules stables TR-AGS et nous avons obtenu une expression stable Tet-régulée shRNA des cellules de gènes CDH17 (TR-AGS-CDH17_KD) que le niveau de la protéine CDH17 a été réduite environ 90% après induite avec 5 pg /ml TET (figure 3B). Le pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus a été utilisé pour la transduction TR-MGC-803 cellules stables et sélectionné avec blasticidine pour obtenir une expression stable Tet-régulée des cellules de gènes CDH17 (TR-MGC-803-CDH17_Over) . La surexpression de CDH17 dans cette cellule stable a été confirmée au niveau des protéines par Western blot (figure 4A).

Knockdown de CDH17 inhibition induite par la prolifération cellulaire, la migration, l'adhérence, la formation de colonies et de l'induction en arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose

les cellules TR-AGS (cellules de contrôle) et les cellules TR-AGS-CDH17_KD ont été utilisés pour évaluer les effets fonctionnels cellulaires potentiels de shRNA médiation knockdown CDH17 dans les cellules AGS. des cellules TR-AGS CDH17_KD traitées avec 5 pg /ml Tet a montré une réduction de la prolifération cellulaire (par 75,8% à 5 jours), la capacité de migration des cellules (de 68,1% à 16 h), la capacité d'adhérence cellulaire (de 46,8% à 30 minutes ) et la capacité de formation de colonies (de 92,7% à 7 jours) par rapport à Tet libre (figure 3C). Dans la prolifération étude de sauvetage, CDH17 knockdown dans les cellules TR-AGS-CDH17_KD induites par Tet peut être sauvé en retirant Tet. Après avoir retiré Tet le jour 4, ré-expression de CDH17 a été observée le jour 8 et 10 de la culture dans les cellules AGS knockdown CDH17 shRNA. Re-expression de CDH17 pourrait sauver la capacité de prolifération des cellules TR-AGS-CDH17_KD (Figure 3D). Par rapport aux cellules libres TR-AGS CDH17_KD Tet, Tet sur des cellules a montré un pourcentage nettement plus élevé de cellules en G0 /G1 et G2 /M en phase et un pourcentage considérablement décédé de cellules dans la phase S (figure 3E). Entre-temps, nous avons également observé que le nombre de cellules apoptotiques (de 52,2% à 5 jours) a été augmentée par régulation négative de CDH17 dans les cellules TR-AGS-CDH17_KD (Figure 3F). Aucune différence significative n'a été trouvée dans TR-AGS lignée cellulaire stable avec ou sans Tet incubation.

surexpression de CDH17 a favorisé la croissance de xénogreffes tumorales dans

cellules TR-MGC-803-CDH17_Over de souris nude ont été injectées par voie sous-cutanée dans les flancs de souris BALB /c nu pour former une tumeur solide. L'expression de la CDH17 était sous le contrôle du Têt dans l'eau potable. Les résultats ont montré que, après 35 jours d'induction, Tet induite par groupe (volume de la tumeur = 1849,08 ± 423.46m3) présentaient une fois 2,27 taux plus élevé de croissance de progression par rapport au groupe Tet-libre (volume de la tumeur = 814,04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( la figure 4B), et l'expression induite CDH17 dans les tissus tumoraux peuvent être analysés par transfert de Western (figure 4C). Elle a indiqué que CDH17 joue un rôle important dans la carcinogenèse du cancer gastrique. Nous avons également utilisé les cellules TR-AGS-CDH17_KD d'observer si taire de CDK17 peut affecter la tumorigène chez la souris nude. Malheureusement, la tumeur prend taux de cette lignée cellulaire a été très faible et pas fiable résultats in vivo ont été observés avec la lignée cellulaire TR-AGS-CDH17_KD.

Détermination des niveaux de protéines apparentées après knockdown CDH17 par dosage des matrices d'anticorps

d'après les effets tumorigènes (inhibition de la prolifération cellulaire, la formation de colonies et la croissance tumorale in vivo) et des effets métastatiques (inhibition de la migration cellulaire et l'adhérence) de CDH17 effet de choc, on choisit trois réseaux d'anticorps (de R & D Systems ) pour tester les variations relatives des protéines et l'espoir de trouver des protéines apparentées réglementés CDH17 puissant. Dans la matrice de l'apoptose, phospho-p53 (S15, S46 et S392) et p21 /CIP1 /CDNK1A expression a augmenté d'environ deux fois après 5 ug /ml traitement Tet pendant 5 jours par rapport aux cellules non traitées (figure 5A (a) et 5B). Dans le tableau de phospho-kinase, phospho-p53 (S15, S46 et S392) l'expression a également augmenté après le traitement Tet et, en même temps, l'expression de phospho-ERK1 /2 (T202 /Y204) a diminué (figure 5A (b), et 5B). Dans le réseau de récepteur soluble, knockdown de CDH17 dans les cellules AGS pourrait diminuer de façon significative l'expression de l'intégrine β1, β4, β5, tout n'a pas un impact sur l'expression de l'EGFR (figure 5A (c) et 5B). Les ratios d'altération des protéines intéressées entre Tet-on et Tet sans cellules AGS ont été résumées dans la figure 5B.

Knockdown de CDH17 dans AGS downregulated ß-intégrines et Ras /Raf /MEK /ERK voie

Les protéines changements de dosage de réseau d'anticorps ont été confirmés par l'analyse Western blot. Les résultats indiquent une réduction significative de l'intégrine β1, β4, β5 et phospho-ERK dans CDH17 knockdown cellules AGS, mais aucun changement significatif dans la ERK totale (Figure 5C). Ensuite, nous avons évalué l'implication de Ras /Raf /MEK /ERK autres composants de la voie de signalisation. Knockdown de CDH17 a donné lieu à une régulation négative de la Raf, phospho-MEK, et les protéines phospho-ERK (Figure 5C). De TR-MGC-803-CDH17_Over étude in vivo, nous avons observé la surexpression de CDH17 amélioré la β1 intégrines, β4, expression β5 et ERK activation (figure 4C) et il est compatible avec les résultats ci-dessus. Afin de déterminer si l'effet de CDH17 sur intégrines ou protéine Ras est une interaction directe ou non, une co-immunoprécipitation de CDH17 avec intégrine β1, intégrine β4, intégrine β5, intégrine α2 et Ras a été menée dans les cellules AGS de cancer gastrique, respectivement. Sur attente, contrairement au résultat de Bartolome [11], il n'y avait pas d'association directe entre CDH17 et l'un quelconque de ces intégrines ou protéine Ras (données non présentées).

Discussion

Il est un grand défi pour les cliniciens et les scientifiques de base pour déterminer les marqueurs moléculaires associés à la progression et le pronostic des cancers liés. Dans le foie et les cancers gastriques, on pense que l'expression élevée de CDH17 a été associée à une faible survie, la récurrence de la tumeur, l'invasion tumorale, les métastases et le stade tumoral avancé [23] - [25]. Dans l'étude actuelle, parmi les 30 panneaux GC lignées cellulaires, plus de 66% de nos lignées cellulaires testées (20/30) sont CDH17 positif, et près de la moitié de ces lignées cellulaires ont une meilleure expression CDH17. Dans notre rapport de diagnostic de la pathologie, 73,6% GC chinoise tissus cancéreux (159/216) hébergeaient tache CDH17 positive. Dans les cas positifs CDH17, le niveau de CDH17 d'expression a une corrélation positive avec métastases ganglionnaires. Cependant, le niveau d'expression est associée inverse invasion de la paroi gastrique, une tumeur métastases à distance, et les stades TNM de la tumeur. Notre observation était conforme aux précédents rapports cliniques [20] - [22]. Prenant tout cela en évidence ensemble, CDH17 peut être un marqueur de diagnostic pour le cancer gastrique à un stade précoce dans les populations chinoises.

Pour identifier l'effet de CDH17 dans tumorigensis de cancer gastrique et le potentiel métastatique, deux oligo siARN et TR inductibles vecteurs pLentiviral avec miARN spécifique (en exton13) contre CDH17 ont été utilisés pour knock-down CDH17 expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. CDH17 silençage par oligo ARNsi peut inhiber la prolifération cellulaire et la formation de colonies dans des lignées cellulaires GC avec une expression élevée CDH17. L'effet inhibiteur a été spectaculaire sur AGS qui a une expression plus élevée CDH17, mais pas sur les cellules BGC823 HGC27 et qui ont très peu ou pas d'expression de la protéine CDH17 (figure 2). Elle a indiqué que l'expression CDH17 peut contribuer à la prolifération des cellules cancéreuses et la capacité de formation de colonies dans les cellules AGS. En outre, des résultats similaires ont également été observés dans Tet induite shRNA médiation par effet de choc CDH17 dans les cellules AGS qui a entraîné une inhibition de la prolifération cellulaire, la migration, l'adhérence, la formation de colonies et l'induction de l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire in vitro. Re-expression de CDH17 pourrait sauver la capacité de prolifération des cellules TR-AGS-CDH17_KD (Figure 3). En outre, Tet induite par la surexpression de CDH17 dans des cellules TR-MGC803-CDH17_Over pourrait favoriser la croissance de xénogreffes de tumeur in vivo (figure 4). Prenant tout cela en évidence ensemble, nous pouvons conclure qu'il existe une corrélation significative entre l'expression CDH17 et les capacités tumorigènes et métastatiques de cancer de l'estomac, et CDH17 peut servir de cible thérapeutique potentielle pour la recherche future
.

Bien que plusieurs précédent des études ont rapporté le fait que l'inhibition de CDH17 pourrait inhiber la prolifération cellulaire dans les cellules GC, le mécanisme de signalisation CDH17 reste incertaine. Il a été mis en évidence que la signalisation oncogénique CDH17 médiation dans le CHC est en relation avec la voie de signalisation Wnt [5]. Cependant, il y avait des différences entre nos résultats et les résultats rapportés par Liu dans le CHC. Nos résultats ont montré aucun changement dans la forme phosphorylée de la glycogène synthase kinase 3β (GSK-3β et de retenue de β-caténine dans le noyau après silençage CDH17 (données non présentées). Cette différence peut être expliquée par l'utilisation de différents types et de cellules cancéreuses

• PLOS ONE: microARN 135a Supprime métastase ganglionnaire par régulation négative de ROCK1 dans le cancer gastrique précoce
• PLOS ONE: résultats cliniques pour le cancer gastrique suivants Adjuvant chimioradiothérapie Intensité Utilisant Modulée par rapport à trois dimensions radiothérapie conformationnelle