Cadherin-17 (CDH17), et medlem af 7D-cadherin superfamilien, blev overudtrykt i gastrisk cancer (GC) og var forbundet med dårlig overlevelse, tumor tilbagefald, metastaser, og avanceret tumor stadie. Hidtil den cellulære funktion og signalering mekanisme CDH17 i GC fortsat uklar. I denne undersøgelse viste vi, at over 66% af GC cellelinier (20/30) var CDH17 positive. Tissue microarray (TMA) assay viste, at 73,6% kinesiske GC væv (159/216) var CDH17 positive, mens 37% respektive tilstødende normale væv var CDH17 positive. Knockdown af CDH17 inhiberede celleproliferation, migration, adhæsion og kolonidannelse, og inducerede også en cellecyklus og apoptose i AGS human GC-celler. På den anden side, overekspression af CDH17 lettet MGC-803 GC tumorvækst i nøgne mus. Antistof array og Western blotting assay viste, at knockdown af CDH17 i AGS-celler nedreguleret integrin β serie proteiner, yderligere inaktiverede Ras /Raf /MEK /ERK pathway og førte til p53 og p21 akkumulering, hvilket resulterede i proliferation inhibering, celle-cyklus arrestere og apoptose induktion. Tilsammen vores data først demonstrere evne CDH17 at regulere aktiviteten af Ras /Raf /MEK /ERK pathway for celleproliferation i GC, og antyder, at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for fremtidig forskning.
Henvisning: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Målretning Cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK Signaling og Forhindrer Cell Proliferation i Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296
Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrig
Modtaget: 10 juni, 2013; Accepteret: November 26, 2013; Udgivet: 20 Jan 2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
Konkurrerende interesser: Alle forfattere er medarbejdere eller tidligere medarbejdere i Roche R & D center (Kina), undtagen Yanfen Fang, der er ansat i East China Normal University, Shanghai, Kina.. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.
mavekræft (GC) er rangeret som den næststørste årsag til den globale dødelighed af kræft og den fjerde mest almindelige kræftform i verden [1], [2]. Den mediane overlevelsestid på GC patienter er 7~10 måneder. De fleste patienter med GC stede med sene sygdom med en samlet 5-års overlevelse på ca. 20% og objektive responsrater til konventionel kemoterapeutiske regimer rækkevidde kan forbedres fra 20% til 40% [1], [3]. I øjeblikket er cisplatin-baseret behandling stadig meget udbredt i kliniske indstillinger for avanceret og metastatisk GC. Hertil kommer, for HER2-neu overekspression gastriske adenokarcinomer, trastuzumab (Herceptin) i kombination med kemoterapi forlænger den mediane samlede overlevelse fra 11,1 måneder (kemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. I betragtning af den høje dødelighed af GC, er der stadig stor udækket medicinsk behov for at finde den følsomme og pålidelige biomarkører til tidlig diagnose af GC og potent terapeutisk mål for behandling af GC.
CDH17, et medlem af 7D-cadherin superfamilien, præsenterer i føtal lever og mave-tarmkanalen under embryogenese, således også navngivet som lever-tarm cadherin (LI cadherin). CDH17 er overudtrykt i hepatocellulært carcinom [5], [6], mavekræft [7], duktalt bugspytkirtelkræft [8] og kolorektal cancer [9] - [11]. Som rapporteret, CDH17 var hovedsageligt til stede på cellemembranen og fraværende i normale gastriske væv og den positive rate var næsten 78,4% [12]. Ekspressionsniveauet af CDH17 var karakteristisk for den avancerede gastrisk karcinom, der var forbundet med dårlig prognose [13]; og det blev også signifikant associeret med lymfeknudemetastaser i gastrisk cancer [14]. Knockdown CDH17 med lentivirus-medieret miRNA inhiberede proliferation, adhærens, tumorvækst, og metastase af BGC823 humane gastriske cancerceller både in vitro og in vivo [15] - [17]. CDH17 er blevet foreslået som et onkogen og en nyttig markør til diagnosticering af gastriske cancere [18]. Det er blevet påvist, at CDH17 medieret oncogen signalering i HCC er relateret med Wnt signalering pathway [5]. For nylig blev det rapporteret, at CDH17 tumordannelse og lymfe metastase i GC gennem aktivering af NFKB-signalvejen [19]. CDH17 reguleret α2β1 integrin signalering at inducere specifik fokal adhæsion kinase og Ras-aktivering, som førte til stigningen i celleadhæsion og spredning i colon cancerceller [11]. Men den væsentligste rolle og signaleringsmekanisme af CDH17 i GC fortsat uklar. I denne undersøgelse at validere CDH17 som et potentielt terapeutisk mål for GC og at undersøge signaleringsmekanisme af CDH17 i GC, kendetegnet vi ekspressionen af CDH17 i humane GC cellelinjer og kinesiske GC væv, kontrolleres indflydelse af CDH17 knockdown eller over- udtryk på tumorigen og metastatisk effekt af GC-cellelinjer, og udforskede de mulige signal kaskader relateret til CDH17. Vi observerede en høj CDH17 ekspression i humane GC cellelinjer og kinesiske GC væv, og en klar inhibering i celleproliferation, migration, adhæsion, kolonidannelse, apoptose induktion, og cellecyklusstop efter silencing af CDH17 i humane GC cellelinier. Desuden er vores resultater først demonstrere evne CDH17 at regulere aktiviteten af integrin-Ras /Raf /MEK /ERK pathway for celleproliferation i GC, og antyder, at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for fremtidig forskning.
Materialer og metoder
Etik erklæring
brug og vedligeholdelse af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), Roche R &D center (Kina). De menneskelige GC væv blokke med tilsvarende tilstødende væv blokke blev opnået fra Shanghai Biochip Company, et CRO servicevirksomhed. Alle humane væv blev indsamlet med skriftlig tilladelse fra kilde patienter. Alle cellelinier blev købt fra ATCC, USA, japansk Indsamling af Research Bioressourcer, og Shanghai Institutes of Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Science.
Alle cellelinjer fra amerikansk Typisk Cell Collection (ATCC), japansk Indsamling af Research Bioressourcer, og Shanghai Institutes of Biokemi og Cellebiologi, blev kinesiske Academy of Science opretholdt i respektive vækstmedium, der blev anbefalet af sælgerne. PMD-18T-CDH17 plasmid var fra kinesisk Biological Inc. tetracyclin (Tet) var fra Sigma, Cell Counting Kit-8 var fra Dojindo Molecular Tech. Humant plasma fibronectin var fra R &D Systems. Transwell kammer var fra Corning (6,5-mm diameter, 8-um porestørrelse). CDH17 oligo siRNA var fra Genepharma Co. med sekvensen 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Skrid RNA kontrol (Allstar®) var fra QIAGEN.
To hundrede og seksten paraffin indlejret gastrisk kræft væv blokke sammen med tilsvarende tilstødende væv blokke (tilstødende væv blev udtaget mindst 5 cm fra primære tumorer) blev indsamlet og deponeret af Shanghai Biochip Company. Væv blev snittet og tilfældigt forberedt på 3 micro array-dias. Alderen af patienterne var 32-84 år (median alder 65) med iscenesættelse fra 1A-4 ifølge amerikanske fælles udvalg om kræft (AJCC) retningslinjer ver.7. Alle sager blev diagnosticeret med to højtstående patologer med erfarne speciale i mavekræft patologi. Objektglassene blev inkuberet i blokerende serum i 20 min, derefter dækket med 100 pi anti-humant Cadherin-17 affinitetsoprenset monoklonalt Ab, muse IgG (R &D MAB1032 1:2000 i TBS /T) ved 4 ° C natten over. Glassene var omfattet af 100 pi DAKO Envision + /HRP, Kanin /Mus efter vask grundigt med TBS. Et hundrede mikroliter substrat-kromogen-opløsning (DAB) blev påført objektglassene og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Farvede objektglas blev undersøgt mikroskopisk ved to immunhistokemi eksperter. Den normale muse-IgG blev anvendt som en negativ kontrol. Farvning blev anset for at være negativ, når ingen positiv cellemembran farvning kunne identificeres og positiv, når mere end 10% af tumorcellerne viste cellemembran-positive immunfarvning.
pLenti6 /TR-vektoren (Invitrogen, katalog nr. V48020) og pLenti3.3 /TR-vektoren (Invitrogen, katalog nr. A11114) blev anvendt til at generere stabile cellelinjer, der konstitutivt udtrykker høje niveauer af Tet-repressoren. Disse ekspressionsplasmider indeholder elementer, der tillader pakning af konstruktionen i virioner og blasticidin eller geneticin resistens markør til selektion af stabilt transducerede cellelinjer. Kort fortalt 293FT pakkeceller (Invitrogen, katalog nr. R700-07) blev transficeret med pLenti6 /TR eller pLenti3 /TR og ViraPower TM emballagemix (Invitrogen, katalog nr. K4975-00) til frembringelse af lentiviral partikler. Lentivirus blev anvendt til at transducere AGS celler eller MGC-803 og blasticidin (8 ug /ml, Invitrogen, katalog nr. R210-01) eller geneticin (200 ug /ml, Invitrogen, katalog nr. 10.131-027) blev bruges til at vælge for en stabil TR-udtrykkende AGS celler navngivne TR-AGS stabil cellelinje eller TR-udtrykkende MGC-803 celler opkaldt TR-MGC-803 stabil cellelinje. Disse TR udtrykkende cellelinjer blev anvendt som værter til ekspressionskonstruktioner, som letter Tet-reguleret ekspression af CDH17 shRNA (short hairpin RNA) eller CDH17 genet hhv. Fire miRNA oligonukleotider rettet CDH17 gen ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) blev designet ved hjælp af en internet-ansøgningssystem (Invitrogen). Disse dobbeltstrengede DNA blev ligeret ind i pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP-miR ekspressionssystemet (Invitrogen, katalog nr. K4936-00), som blev derefter kortvarigt transficeret ind AGS celler af Lipofectamine 2000 standardprocedurer (Invitrogen, Cat nr. 11.668-027). Ifølge Real-time PCR-analyse, sekvensen 90-2 (Forward primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; revers primer: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') af miRNA viste den højeste effektivitet og blev valgt til at pr formular BP rekombination til opnåelse pENTR-miRNA. Denne post vektor blev derefter anvendt i LR rekombination med pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr K4920-00) for at opnå pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus hjælp Gateway® teknologi (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus blev anvendt til at transducere TR-AGS stabile celler og 200 ug /ml Zeocin (Invitrogen, katalog nr. R250-05) blev anvendt til at selektere for en stabil Tet-regulerede CDH17 shRNA ekspressionsceller navngivne TR-AGS-CDH17_KD stabil celle linje. Stabil MGC-803 celler med Tet-regulerede overekspression af CDH17 gen Kort fortalt blev CDH17 sekvens amplificeret fra PMD-18T-CDH17 plasmid (Sino Biological Inc.) og subklonet i IRES -EGFP vektor til opnåelse CDH17-IRES-EGFP ved anvendelse af primere: forward primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Reverse primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Denne konstruktion blev anvendt til at udføre BP rekombination til opnåelse pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Så posten vektor og pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr V370-06) vektor blev brugt i LR rekombination at opnå pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Så lentivirus blev produceret til at transducere TR-MGC-803 stabile celler og 4 pg /ml blasticidin blev brugt til at vælge for en stabil Tet-regulerede CDH17 genekspression celler navngivne TR-MGC-803-CDH17_Over stabil cellelinje. Celleproliferationsassay i siRNA transient transfektionsassays blev celler udsået i 10 cm skål med en tæthed på 5 x 10 6 celler /skål og transficeret med 20 nM siCDH17 eller scramble siRNA. Efter 48 timers inkubation blev cellerne adskilles og overført til 96-brønds plade med en densitet på 3000 celler /brønd, derefter inkuberet i yderligere 72 timer. Cellelevedygtigheden blev analyseret med CCK-8 kit (Donjindo, Japan). For TR-inducerbar AGS-CDH17_KD stabile celler blev celler podet i 60 mm x 15 mm skål og behandledes med eller uden Tet (0, 2,5 og 5,0 ug /ml) i forskellige tidsrum. Celler blev høstet efter 2, 3, 4, 5 og 6 dage, og celleantallet blev talt ved ScepterTM Håndholdt Automated Cell Counter (Millipore). For proliferation redning assay blev TR-inducerbare AGS-CDH17_KD stabile celler podet i 60 mm x 15 mm skål og dyrket i 10 dage med eller uden 5,0 pg /ml Tet. Til redning gruppe, blev dyrkningsmediet indeholdende Tet erstattet med frisk medium på dag 4, og cellerne blev fortsat dyrkes til dag 10. Cellerne i hver gruppe blev høstet på dag 2, 4, 6, 8 og 10 for celleantal tælling og Western blotting-analyse. cellemigrationsassay TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i 10 cm skål og behandledes med eller uden Tet (5 ug /ml). Efter 120 timers dyrkning blev cellerne opsamlet og talt. 0,1 ml cellesuspension (1, 2, 3 × 10 4 celler /ml) blev tilsat til det øvre rum af kammeret. 0,6 ml 10% FBS-medium blev tilsat til det nedre rum som kemo tiltrækningsstof. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne fikseret med 90% EtOH ved 4 ° C i 30 minutter og derefter farvet med 0,1% krystalviolet i 15 minutter. De ikke-vandrende celler blev fjernet fra den øvre flade af transwell membran med en vatpind. De farvede celler blev efterfølgende fotograferet og talt under lysmikroskopi. TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i 10 cm skål og behandledes med eller uden Tet (5 ug /ml). Pre-coating af plader med 96 brønde blev udført ved at inkubere brøndene med 25 ug /ml fibronectin ved 4 ° C natten over. For at reducere ikke-specifik binding blev 1% bovint serumalbumin (BSA) tilsat til hver brønd og inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C blev BSA vasket to gange med sterilt PBS. 120 timer efter knockdown CDH17 med Tet, blev celler opsamlet og udsået i præcoatede plader med 96 brønde med 4 x 10 4 celler /brønd. 2 timer senere blev ikke-adhærente celler fjernet ved vask med sterilt PBS for to gange. De adhærente celler blev analyseret ved CCK-8 kit. Først blev 6-brønds plader fremstillet med bund agar lag (0,6% gel). Derefter, TR-AGS-CDH17_KD celler eller siCDH17 transficerede celler (som proliferation assay) blev suspenderet i komplet medium indeholdende 0,3% -0.4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og podet i forberedt 6-brønds plade og dyrket i 7 eller 14 dage. Celler blev farvet med thiazolyl blå tetrazolium (MTT) i 2 timer. Antallet af cellekolonier blev talt. TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i en plade med seks ved 1,0 × 10 5 celler /brønd og behandlet med 5 ug /ml Tet. 120 timer senere blev celler høstet med trypsin og fikseret med EtOH ved 4 ° C i 3 timer. Derefter blev cellerne centrifugeret ved 1.500 g i 5 minutter og vasket med PBS. Resuspenderede celler i RNase /PBS opløsninger (20 ug /ml), inkuberet ved 37 ° C i 15 minutter, derefter tilsat PI /PBS opløsninger (20 ug /ml) og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter, inspicerede de farvede celler med BD FACS Calibur og analyseret data med BD CellQuest Pro-softwaren. Apoptose analyse TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev podet i en plade med seks ved 1,0 × 10 5 celler /brønd og behandlet med 5 ug /ml Tet. 120 timer senere blev celler høstet med trypsin og vasket med forafkølet PBS én gang. Celler blev resuspenderet i 500 pi 1 × bindingsbuffer og 5 pi PI og 5 pi AnnexinV (BD) blev tilsat. Efter inkubation i mørke (stuetemperatur) i 10 minutter blev de farvede celler undersøges med BD FACS Calibur. De indsamlede data blev analyseret med BD CellQuest Pro software. Celler blev lyseret ved RIPA puffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholat og 10 mM Hepes (pH 7,4)] indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Proteinkoncentrationer blev kvantificeret under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) -metoden (Pierce). Tredive mikrogram protein pr prøve blev kogt i ladningsbuffer og elektroforesebehandlet i 8-12% gradient SDS polyacrylamidgeler (Invitrogen) og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev probet med antistoffer (CDH17, Integrin p1, integrin β4, Integrin β5, p-p53, p53, p21 var fra R &D, Raf, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK var fra cellesignalering, og K-Ras var fra Santa Cruz) og efterfulgt af et peroxidase-konjugeret immunoglobulin. Western blots blev visualiseret med et forøget kemiluminescens (ECL) kit (GE, Healthcare) Antistof arrays assay Tre typer af antistof-arrays blev opnået fra R &. D Systems, Inc. for antistof arrays assay. Human Phospho-kinase Array Kit (kat. Nr ARY003) indeholder 43 forskellige kinaser. Menneskelig opløselig receptor Array Kit Ikke-Hæmatopoietisk Panel (kat. Nr ARY012) indeholder 119 forskellige opløselige receptorer. Human Apoptose Array Kit (kat. Nr ARY009) indeholder 35 forskellige apoptose-antistoffer. Mere udtømmende oplysninger om disse arrays kan findes i linket til R &D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabile celler blev høstet efter 120 timer behandlet med eller uden Tet (5 ug /ml), og proteinerne blev lyseret ved lyseringspuffer med proteasehæmmere, blev celleekstrakter fortyndet og inkuberet med de tre typer antistof-arrays overnight . Opstillingerne blev vasket for at fjerne ubundne proteiner, efterfulgt af inkubation med en cocktail af biotinyleret detektionsantistoffer. Alle procedurer er i overensstemmelse med instruktion af sættet. Blots blev analyseret ved densitometri, og proteinekspression blev normaliseret til en positiv kontrol, der var repræsenteret i hver membran. TR-MGC803-CDH17_Over celler (1 x 10 7 celler i 0,2 ml PBS) blev injiceret i venstre armhule af 5~6 uger BALB /c nu /nu atymiske hunmus (kinesisk-britiske SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Kina). Tumorvolumen (mm 3) blev målt med passere og beregnet som (W 2 × L) /2, hvor W er bredden og L er længden. Når tumorvolumen nåede -100 mm 3, blev musene randomiseret i to grupper (9 mus i hver gruppe). Tetracylcine induktion (Invitrogen, 0,2 mg /ml, leveret i steriliseret drikkevand indeholdende 2,5% saccharose) blev initialiseret på grupperingen dag. Steriliseret drikkevand indeholdende 2,5% saccharose blev leveret til musene i ikke-inducerede gruppe. Tumorvolumener blev optegnet hver 3 dage, indtil dyrene blev aflivet. Efter 35 dages induktion blev xenograft tumorvæv indsamlet og udsat for Western blot-analyse for relativ proteinekspression. Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse og statistisk underkastet Students uparrede t-test. Et niveau på P < 0,05 blev anset for at være betydelige Resultater Expression profil CDH17 i mavekræft Udtrykket niveau CDH17 proteiner i 30 cellelinjer blev kategoriseret. i 4 grupper baseret på data fra optisk tæthed analyse mod beta-actin. AGS cellelinje blev anvendt som intern standard for at undgå uoverensstemmelsen mellem geler. Over 66% af GC cellelinjer (20/30) var CDH17 positive (figur 1A). Udtrykket og lokalisering af CDH17 i primært væv paraffin afsnit blev opdaget ved immunhistokemi på væv microarrays. Sammenlignet med kontrolobjektglas farvet af normal mus IgG, CDH17 mAb farvning blev demonstreret klart cellemembran lokalisering (figur 1B). Blandt 216 tilfælde med bekræftet patologi diagnose rapport, 73,6% ondartede væv (159/216) nærede positiv CDH17 pletten med scoring fra + til +++, mens 37% positive CDH17 plet i respektive tilstødende normale væv (tabel 1). I CDH17 positive tilfælde, ekspressionsniveauet af CDH17 har positiv korrelation med lymfeknudemetastaser. Imidlertid er ekspressionsniveauet omvendt forbundet med mavevæggen invasion, tumor fjernmetastaser, og tumor TNM stadier. Vores observation var i overensstemmelse med tidligere kliniske rapporter [20] - [22]. Blandt CDH17 positive tilfælde, cancervæv udviste stærkere farvning af CDH17 (32,1% som scoring +, 25,2% som scoring ++ og 42,8% som scoring +++) end de tilstødende normale væv (62,5% som scoring +, 21,3% som udføre ++ og 16,3% som scoring +++). Mens ikke blev observeret nogen signifikant sammenhæng mellem pletten scoring og klinisk fase. Tager alt dette dokumenterer sammen, kan CDH17 være en diagnostisk markør for tidligt mavekræft i kinesiske befolkningsgrupper. Baseret på resultaterne af CDH17 ekspressionsprofil i et panel af GC cellelinjer (fig 1A), AGS (højere CDH17), BGC-823 (lavere CDH17) og HGC-27 (none CDH17) cellelinier blev udvalgt til yderligere in vitro cellulære funktionel vurdering med RNAi-medieret CDH17 lyddæmpning. Western blotting viste, at AGS celler havde højt CDH17 proteinniveau og udtryk for CDH17 blev slået ned næsten helt af siCDH17. BGC823 celler havde lavt CDH17 proteinniveauet og HGC-27 havde ingen CDH17 protein (figur 2A). Sammenlignet med scramble kontrolceller, CDH17 vælte havde lille indvirkning på den proliferative evne BGC823 og HGC27 celler, hvorimod haft dramatisk effekt på AGS (med 60% efter 72 timer, figur 2B). Blød agar-assay viste, at evnen til at danne koloni blev inhiberet i AGS celler hvis CDH17 var knock down (med 66% ved 14 d), men i BGC823 celler og HGC27 celler, CDH17 vælte havde ringe virkning på kolonidannelse evne (figur 2C). Der var ikke indlysende forskel mellem BGC823 celler (lav CDH17 niveau) og HGC-27cells (ikke-CDH17) i hæmning af spredning og kolonidannelse induceret af siRNA CDH17 knockdown. målsekvensen i exon13 (90-2) gav over 90% reduktion i mRNA-niveau (figur 3A). Derefter brugte vi pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus at transducere TR-AGS stabile celler og fik en stabil Tet-regulerede udtryk shRNA af CDH17 gen celler (TR-AGS-CDH17_KD), som CDH17 proteinniveauet blev reduceret omkring 90% efter induceret med 5 ug /ml Tet (figur 3B). Den pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus blev anvendt til at transducere TR-MGC-803 stabile celler og udvalgt med blasticidin at få en stabil Tet-regulerede udtryk CDH17 gen celler (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Den overekspression af CDH17 i denne stabile celle blev bekræftet på proteinniveau ved Western blotting (figur 4A). TR-AGS celler (kontrol celler) og TR-AGS-CDH17_KD celler blev brugt til at vurdere de potentielle cellulære funktionelle virkninger af shRNA-medieret CDH17 knockdown i AGS celler. TR-AGS-CDH17_KD celler behandlet med 5 ug /ml Tet viste en reduktion i celleproliferation (med 75,8% ved 5 dage), cellemigration evne (med 68,1% ved 16 timer), celleadhæsion evne (med 46,8% ved 30 minutter ), og kolonidannende evne (med 92,7% efter 7 dage) sammenlignet med Tet fri (figur 3C). I spredning redning studie, kan CDH17 knockdown i TR-AGS-CDH17_KD celler induceret af Tet reddes ved at fjerne Tet. Efter at have fjernet Tet på dag 4, blev re-ekspressionen af CDH17 observeret på dag 8 og 10 i kulturen i CDH17 shRNA Knockdown AGS celler. Re-ekspressionen af CDH17 kunne redde spredning evne TR-AGS-CDH17_KD celler (Figur 3D). Sammenlignet med Tet free TR-AGS-CDH17_KD celler, Tet på celler viste signifikant større procentdel af celler i G0 /G1 og G2 /M-fasen og en dramatisk afdød procentdelen af celler i S-fase (Figur 3E). I mellemtiden, vi bemærkede også, at antallet af apoptotiske celler (med 52,2% ved 5 dage) blev øget med nedregulering af CDH17 i TR-AGS-CDH17_KD celler (Figur 3F). Ingen signifikant forskel blev fundet i TR-AGS stabil cellelinje med eller uden Tet inkubation. TR-MGC-803-CDH17_Over celler blev injiceret subkutant i flankerne af nøgne Balb /c-mus til dannelse af faste tumor. Ekspressionen af CDH17 var under kontrol af Tet i drikkevandet. Resultaterne viste, at efter 35 dages induktion, Tet-induceret gruppe (tumorvolumen = 1849,08 ± 423.46m3) udviste en 2,27 gange højere vækst fremskridt rate versus Tet-fri gruppe (tumorvolumen = 814,04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( Figur 4B), og induceret CDH17 ekspression i tumorvæv kan analyseres ved Western blotting (figur 4C). Det viste, at CDH17 spiller en vigtig rolle i carcinogenese af mavekræft. Vi brugte også TR-AGS-CDH17_KD celler at observere, om tavshed af CDK17 kan påvirke tumorigenicitet i nøgne mus. Desværre tumoren tage på denne cellelinie var meget lav og ingen pålidelige in vivo resultater blev observeret med TR-AGS-CDH17_KD cellelinje. Ifølge de tumorgene virkninger (inhibering af celleproliferation, kolonidannelse, og tumorvækst in vivo) og metastatiske virkninger (inhibering af cellemigration og adhæsion) af CDH17 knockdown, vi vælger tre antistof-arrays (blandt R &D Systems ) for at teste de relative protein ændringer, og håber at finde potent CDH17 regulerede beslægtede proteiner. I apoptose array, phospho-p53 (S15, S46 og S 392) og p21 /CIP1 /CDNK1A ekspression forøget ca. to gange efter 5 ug /ml Tet behandling i 5 dage sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A (a) og 5B). I phospho-kinase array, phospho-p53 (S15, S46 og S 392) ekspression øgede også efter Tet behandling og, på samme tid, ekspression af phospho-ERK1 /2 (T202 /Y204) faldt (figur 5A (b) og 5B). I den opløselige receptor array, kunne knockdown af CDH17 i AGS celler signifikant formindske ekspressionen af integrin β1, β4, β5, mens ikke påvirke ekspressionen af EGFR (figur 5A (c) og 5B). Ændringen forhold mellem interesserede proteiner mellem Tet-on og Tet-fri AGS celler blev opsummeret i figur 5B. protein ændres fra antistof-array-assay blev bekræftet ved Western blotting-analyse. Resultaterne indikerede en betydelig reduktion af integrin β1, β4, β5 og phospho-ERK i CDH17 knockdown AGS-celler, men ingen signifikant ændring i den samlede ERK (figur 5C). Derefter evaluerede vi inddragelse af andre Ras /Raf /MEK /ERK signalvej komponenter. Knockdown af CDH17 resulterede i nedregulering af Raf, phospho-MEK, og phospho-ERK proteiner (figur 5C). Fra TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo-undersøgelse, observerede vi overekspression af CDH17 forbedret integrin β1, β4, β5 udtryk og ERK aktivering (figur 4C), og det er i overensstemmelse med ovennævnte resultater. For at undersøge om virkningen af CDH17 på integriner eller Ras protein er direkte interaktion eller ej, en co-immunpræcipitering af CDH17 med integrin β1, integrin β4, integrin β5, integrin α2, og Ras blev udført i gastrisk cancer AGS celler. Ud af forventning, i modsætning til Bartolome resultat [11], var der ingen direkte sammenhæng mellem CDH17 og en af disse integriner eller Ras protein (data ikke vist). Det er en stor udfordring at klinikere og grundlæggende forskere til at bestemme de molekylære markører forbundet med progression og prognose af relaterede kræftformer. I lever og gastriske cancere, antages det, at den høje ekspression af CDH17 var forbundet med ringe overlevelse, tumortilbagevenden, tumorinvasion, metastase og avanceret tumor stadium [23] - [25]. I aktuelle undersøgelse blandt 30 paneler GC cellelinjer, over 66% af vores testede cellelinier (20/30) er CDH17 positive, og næsten halvdelen af disse cellelinjer har højere CDH17 udtryk. I vores patologi diagnose rapport, 73,6% kinesisk GC ondartede væv (159/216) næret positiv CDH17 pletten. I CDH17 positive tilfælde, ekspressionsniveauet af CDH17 har positiv korrelation med lymfeknudemetastaser. Imidlertid er ekspressionsniveauet omvendt associeret mavevæggen invasion, tumor fjernmetastaser, og tumor TNM stadier. Vores observation var i overensstemmelse med tidligere kliniske rapporter [20] - [22]. Tager alt dette dokumenterer sammen, kan CDH17 være en diagnostisk markør for tidligt mavekræft i kinesiske befolkningsgrupper. For at identificere effekten af CDH17 i mavekræft tumorigensis og metastatisk potentiale, både oligo siRNA og TR inducerbare pLentiviral vektorer med specifik miRNA (exton13) mod CDH17 blev anvendt til knock-down CDH17 udtryk i gastrisk cancer cellelinjer. CDH17 silencing ved oligo siRNA kunne hæmme celledeling og kolonidannelse i GC cellelinier med høj CDH17 udtryk. Den inhiberende virkning var dramatisk på AGS som har en højere CDH17 ekspression, men ikke på BGC823 og HGC27 celler, som har meget lav eller ingen ekspression af CDH17 protein (figur 2). Det viste, at CDH17 udtryk kan bidrage til kræft celledeling og kolonidannelse evne i AGS celler. Endvidere blev lignende resultater også observeret i tet-induceret shRNA-medieret CDH17 knockdown i AGS celler, som resulterede i inhibering af celleproliferation, migration, adhæsion, kolonidannelse og induktion af apoptose og standsning af cellecyklus in vitro. Re-ekspression af CDH17 kunne redde spredning evne TR-AGS-CDH17_KD celler (figur 3). Desuden Tet induceret overekspression af CDH17 i TR-MGC803-CDH17_Over celler kunne fremme væksten af tumorxenoplantater in vivo (figur 4). Tager alt dette dokumenterer sammen, kan vi konkludere, at der er en signifikant sammenhæng mellem CDH17 udtryk og de tumorigene og metastatiske evner gastrisk karcinom, og CDH17 kan tjene som et potentielt terapeutisk mål for fremtidig forskning. Selv om flere tidligere undersøgelser havde rapporteret den kendsgerning, at silencing af CDH17 kunne inhibere celleproliferation i GC-celler, signalering mekanisme CDH17 stadig uklar. Det er blevet påvist, at CDH17 medieret oncogen signalering i HCC er relateret med Wnt signalering pathway [5]. Men der var nogle forskelle mellem vores resultater og de resultater rapporteret af Liu i HCC. Vores resultater viste ingen ændring i phosphoryleret form af glycogensynthasekinase 3β (GSK-3β og fastholdelse af β-catenin i kernen efter silencing CDH17 (data ikke vist). Denne forskel kan forklares ved udnyttelsen af forskellige cancer celletype og
Stabile AGS celler med Tet-reguleret ekspression shRNA af CDH17 genet
celleadhæsionsassay
Kolonidannelse assay
Cellecyklusanalyse
Western blotting-analyse
Måling af in vivo-aktivitet
Statistisk analyse
RNAi-medieret vælte CDH17 på GC-cellelinjer viste undertrykkelse af celledeling og kolonidannelse in vitro
Stabile cellelinjer der bærer TR inducerbare knockdown af CDH17 i AGS-celler og overekspression af CDH17 i MGC-803 celler
Knockdown af CDH17 induceret hæmning i celleproliferation, migration, adhæsion, kolonidannelse og induktion i celle-cyklus anholdelse og apoptose
Overekspression af CDH17 fremmet væksten af tumorxenoplantater i nøgne mus
Bestemmelse det beslægtede protein-niveauer efter knockdown CDH17 af antistof arrays assay
Knockdown af CDH17 i AGS nedreguleret Ø-integriner og Ras /Raf /MEK /ERK signalvej
Diskussion
Spredes coronavirus gennem afføring?
En multi-omics tilgang til udvikling af lægemidler mod COVID-19
Tarmmikrobiom forbundet med adfærdsproblemer hos børn
Forskere manipulerer bakteriearter i tarmen ved hjælp af kost
Kost og ernæring påvirker mikrobiomet i tyktarmsslimhinden
Undersøgelse beskriver den oprindelige baseline sunde tarmmikrobiomdatabase og overflodsprofil
Cryptosporidiose forværres af almindeligt anvendt probiotikum
Forskere har fundet ud af, at infektion med tarmparasitten Cryptosporidium parvum forværres hos mus, der har fået et probiotikum. Billedkredit:Alpha Tauri 3D Graphics / Shutterstock S
Probiotika kan hjælpe med at bremse underernæring i løbet af de næste to årtier,
siger Bill Gates Probiotika eller gode bakterier har vist løfte om potentialet for at opretholde en sund tarm. Mange undersøgelser har givet bevis på sundhedsmæssige fordele ved probiotika. Nu, den po
Mor-til-baby SARS-CoV-2-transmission under graviditet mulig, men sjælden,
siger undersøgelse Den igangværende pandemi af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) forårsaget af det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) skåner hverken mand eller kvinde.