PLoS One: célzás Cadherint-17 inaktiválja Ras /Raf /MEK /ERK-jelzés és gátolja a sejtek proliferációs gyomorrákban

absztrakt katalógusa

Cadherint-17 (CDH17) egyik tagja 7D-cadherin szupercsaládba volt túltermelõdik gyomorrák (GC) és társult rossz túlélési, daganat kiújulásának, áttétek, és a fejlett tumorstádium. Eddig a sejtműködés és jelző mechanizmus CDH17 GC továbbra is tisztázatlan. Ebben a tanulmányban azt mutatták, hogy több mint 66% -a GC sejtvonalak (20/30) volt CDH17 pozitív. Tissue microarray (TMA) vizsgálat azt mutatta, hogy 73,6% a kínai GC szövetek (159/216) volt CDH17 pozitív, míg 37% a megfelelő szomszédos normál szövetben volt CDH17 pozitív. Kiütése CDH17 gátolta a sejtproliferációt, a migrációt, tapadás és kolónia képződését, és szintén indukált sejtciklus és apoptózis AGS humán GC sejteket. A másik oldalon, overexpressziója CDH17 megkönnyítette MGC-803 GC tumor növekedését csupasz egerekben. Ellenanyag tömb és Western blot assay igazolta, hogy kiütése CDH17 AGS sejtekben alulszabályozott integrin β sorozat fehérjéket, tovább inaktiválódik a Ras /Raf /MEK /ERK útvonal és vezetett p53 és p21 felhalmozódása, ami a proliferáció gátlása, a sejt-ciklus és apoptózis indukció. Együttesen adataink először bizonyítják a kapacitás a CDH17, hogy szabályozza a tevékenység a Ras /Raf /MEK /ERK útvonal az sejtproliferáció GC, és azt sugallják, hogy a CDH17 szolgálhat egy vonzó terápiás célpont a jövőbeni kutatások.

Hivatkozás: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) célzás Cadherint-17 inaktiválja Ras /Raf /MEK /ERK-jelzés és gátolja a sejtek proliferációs gyomorrákban. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296 katalógusa

Szerkesztő: Claude Prigent Institut de Génétique et Développement de Rennes, Franciaország katalógusa

Beérkezett: június 10, 2013; Elfogadva: november 26, 2013; Megjelent: január 20, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Lin et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A szerzők nincs támogatás vagy támogatási jelenteni. katalógusa

Érdekütközés: Minden szerzők alkalmazottak vagy korábbi alkalmazottai Roche R &D Center (Kína), kivéve YanFen Fang, aki alkalmazottja Kelet-Kína Normal University, Shanghai, Kína. Ez nem változtat a szerzők betartása minden PLoS One politikák adatok megosztása és anyagok. Katalógusa

Bevezető katalógusa

A gyomorrák (GC) van rangsorolva, mint a második vezető oka a globális daganatos halálozás és a negyedik leggyakoribb rák világszerte [1], [2]. Az átlagos túlélési idő a GC betegek 7~10 hónap. A legtöbb beteg a GC jelen késői stádiumú betegségben, ami összességében 5 éves túlélés kb 20% és az objektív válaszarány a hagyományos kemoterápiás tartományban lehet javítani 20% -ról 40% [1], [3]. Jelenleg, ciszplatin-alapú terápia még mindig széles körben használják a klinikai beállítások haladó és metasztatikus GC. Ezen túlmenően, a HER2-neu expressziót mutató gyomor adenocarcinoma, trastuzumab (Herceptin), kemoterápiával kombinálva elnyújtja a medián teljes túlélés 11,1 hónap (csak kemoterápiával) 13,8 hónap [4]. Figyelembe véve a magas halálozási arány a GC, még mindig hatalmas kielégítetlen igény, hogy megtalálják az érzékeny és megbízható biomarker korai diagnosztizálására GC és hatásos terápiás célpont kezelésére GC. Katalógusa

CDH17 egyik tagja 7D-cadherin szupercsaládba bemutatja a magzati máj és a gyomor-bél traktus embriogenezis során, így is nevezik a máj-bél cadherin (LI cadherin). CDH17 túlexpresszálódik hepatocelluláris karcinóma [5], [6], gyomorrák [7], duktális hasnyálmirigyrák [8] és kolorektális rák [9] - [11]. Amint arról, CDH17 elsősorban jelen a sejtmembránon, és hiányzik a normál gyomor szövetek és a pozitív arány közel 78,4%. [12] Az expressziós szintjének CDH17 volt jellemző az előrehaladott gyomorrák karcinóma, hogy társult rossz prognózissal [13]; és azt is szignifikáns összefüggést a nyirokcsomó-metasztázis gyomorrák [14]. Knockdown CDH17 a lentivírus-mediált miRNS gátolta a proliferációt, a tapadás, a tumor növekedését, és metasztázisát BGC823 humán gyomorrák sejtek in vitro és in vivo körülmények között [15] - [17]. CDH17 javasolták egy onkogént és hasznos marker diagnosztizálására gyomor rák [18]. Azt bizonyítja, hogy a CDH17 közvetített onkogén szignalizáció HCC összefügg Wnt jelátadó útvonal [5]. Újabban arról számoltak be, hogy CDH17 tumorképzéshez és nyirokrendszeri metasztázis GC keresztül az NFkB jelátviteli út [19]. CDH17 szabályozott α2β1 integrin jeladó indukálnak specifikus fokális adhéziós kináz és a Ras aktiválás, ami a növekedés a sejtadhézió és proliferációt vastagbél rákos sejtek [11]. Azonban a fő szerepet és jelátviteli mechanizmusa CDH17 GC továbbra is tisztázatlan. Ebben a vizsgálatban, hogy érvényesítse CDH17 mint potenciális terápiás célpont a GC és vizsgálja meg a jelátviteli mechanizmusának CDH17 GC, jellemeztük expresszióját CDH17 humán GC sejtvonalak és a kínai GC szövetekben, ellenőrizte a befolyása a CDH17 knockdown vagy túl- véleménynyilvánítás daganatkelto és metasztatikus hatása GC sejtvonalak, és feltárni az esetleges szignálrendszerek kapcsolatos CDH17. Megfigyeltük magas CDH17 expresszió humán GC sejtvonalak és a kínai GC szövetekben, és a világos gátlás a sejt proliferáció, migráció, adhézió, kolónia képződését, az apoptózis indukció és sejtciklus után csendesítése CDH17 humán GC sejtvonalakban. Továbbá, eredményeink először bizonyítják a kapacitás a CDH17, hogy szabályozza a tevékenységét integrin-Ras /Raf /MEK /ERK útvonal az sejtproliferáció GC, és azt sugallják, hogy a CDH17 szolgálhat egy vonzó terápiás célpont a jövőbeni kutatások.

anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat katalógusa

a használata és gondozása a kísérleti állatok jóváhagyta az Institutional Animál Care and Use Committee (IACUC), Roche R &D Center (Kína). Az emberi szövetek GC blokkok megfelelő szomszédos szövet blokkok nyerték Shanghai Biochip Company, CRO szolgáltató vállalat. Minden emberi szöveteket gyűjtöttük írásos beleegyezést a forrás betegeknél. Az összes sejtvonalat az ATCC-től, USA, Japán Collection of Research Bioresources, és a Shanghai Institutes Biokémiai és Sejtbiológiai, Kínai Tudományos Akadémia. Katalógusa

sejtvonalak és reagensek katalógusa

Minden sejtvonalak Tipikus amerikai Cell Collection (ATCC), japán Collection of Research Bioresources, és a Shanghai Institutes Biokémiai és Sejtbiológiai, kínai Tudományos Akadémia tartottuk megfelelő táptalajt amelyek által ajánlott eladó. PMD-18T-CDH17 plazmidot származó kínai Biológiai Inc. A tetraciklin (Tet) a Sigma, sejtszámláiás Kit-8 származott Dojindo Molecular Tech. Humán plazma fibronektin volt az R &D rendszerek. Transwell kamrát volt a Corning (6,5 mm átmérőjű, 8 jim pórusméretű). CDH17 oligo siRNS származott Genepharma Co., amelynek a szekvenciája 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Elsiet RNS-szabályozás (Allstar®) volt a Qiagéntől. Katalógusa

Tissue micro array immunhisztokémiai katalógusa

Két száztizenhat paraffinba ágyazott gyomorrák szövettani blokkok együtt megfelelő szomszédos szövet blokkok (szomszédos szövet mintát veszünk legalább 5 cm-re a primer tumor) gyűjtöttünk, és letétbe Shanghai Biochip Company. A szöveteket szekcionált és véletlenszerűen előállított rá 3 micro array diák. A kor betegek 32-84 éves (átlagéletkor 65) staging-re 1A-4 szerinti American Joint Committee on Cancer (AJCC) irányelveinek ver.7. Minden esetet diagnosztizáltak a két vezető patológusok tapasztalt speciális gyomorrákban patológia. A tárgylemezeket inkubáltuk blokkoló szérum 20 percig, majd által lefedett 100 pl anti-humán Cadherin-17 affinitás tisztított monoklonális Ab, egér IgG-t (R &D MAB1032 1:2000 TBS /T), 4 ° C-on egy éjszakán át. A diák fedezte 100 ul DAKO Képzeljétek + /HRP, nyúl /egér után alaposan mossuk TBS. Száz mikroliter szubsztrát-kromogén oldatot (DAB) vittük fel a lemezekről, és szobahőmérsékleten inkubáljuk 10 percig. Festett lemezeket mikroszkóppal megvizsgáltuk két immunhisztokémiai szakértők. A normál egér IgG-t alkalmaztunk negatív kontrollként. A festés úgy gondolták, hogy a negatív, ha nincs pozitív sejt membrán festődés lehetne azonosítani, és pozitív, ha több mint 10% a tumorsejtek mutatta, sejtmembrán-pozitív immunfestést.

TR stabil sejtvonalak

pLenti6 /TR vektorba (Invitrogen, Cat. No. V48020) és pLenti3.3 /TR vektorba (Invitrogen, Cat. No. A11114) alkalmaztunk stabil sejtvonalakat létrehozni, hogy konstitutívan magas szinten expresszálják a Tet represszort. Ezek az expressziós plazmid tartalmazhat, amelyek lehetővé teszik a csomagolás a konstrukció virionokba és a Blasticidin vagy geneticin rezisztencia marker kiválasztásának stabilan transzdukált sejtvonalak. Röviden, 293FT csomagolás sejtek (Invitrogen, Cat. No. R700-07) transzfektáltunk a pLenti6 /TR vagy pLenti3 /TR és a ViraPower ^{TM Packaging Mix (Invitrogen, Cat. No. K4975-00), hogy lentivirális részecskéket. A lentivírus használtuk transzdukálására AGS sejtek vagy MGC-803, és a Blasticidin (8 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. R210-01) vagy a geneticin (200 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. 10131-027) volt kiválasztására használható a stabil TR-expresszáló AGS sejtek elemzi TR-AGS stabil sejtvonal vagy a TR-t expresszáló MGC-803 sejtek elemzi TR-MGC-803 stabil sejtvonal. Ezek a TR expresszáló sejtvonalakat használtuk gazdaszervezetként a expressziós konstrukciók, amelyek megkönnyítik Tet-szabályozott expressziójának CDH17 shRNS (rövid hajtű RNS) vagy CDH17 gén, ill.}

Stabil AGS sejtek Tet-szabályozott expressziójának shRNS a CDH17 gén

Négy miRNS célzó oligonukleotidok CDH17 gén ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) terveztünk egy internet alkalmazás rendszer (Invitrogen). Ezek kettős szálú DNS-t ligáljuk a pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP-miR expressziós rendszer (Invitrogen, Cat. No. K4936-00), amelyet ezután tranziensen transzfektáltuk AGS sejtekbe a Lipofectamine 2000 standard eljárásokkal (Invitrogen, Kat . sz 11668-027). Szerint a valós idejű PCR-analízis, a szekvencia 90-2 (Forward primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; reverz primer: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') miRNS-ek azt mutatták, a legmagasabb hatékonyságot és választották per formában BP rekombináció megszerezni pENTR-miRNS. Ez a bejegyzés vektort ezután használt LR rekombinációval pLenti4 /to /V5 (Invitrogen, Cat. No. K4920-00), hogy megkapjuk pLenti4 /to /V5-miRNS lentivírus alkalmazásával Gateway® Technology (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). A lentivírus használtuk transzdukálására TR-AGS stabil sejtek és 200 ng /ml Zeocin (Invitrogen, Cat. No. R250-05) használtunk, hogy kiválassza a stabil Tet-szabályozott CDH17 shRNS expressziós sejtek elemzi TR-AGS-CDH17_KD stabil sejt vonalon.

Stabil MGC-803 sejtek Tet szabályozott túltermelése CDH17 gén katalógusa

Röviden CDH17 szekvenciát amplifikáltunk PMD-18T-CDH17 plazmid (Sino Biológiai Inc.) szubklónozzuk IRES -EGFP vektor megszerzése CDH17-IRES-EGFP primerek felhasználásával: menetirányú primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Reverz primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Ezt a konstrukciót végrehajtásához használt BP rekombináció megszerezni pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Ezután a bejegyzés vektor és pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. V370-06) vektort használtuk LR rekombinációs szerezni pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Ezután a lentivírus gyártottak transzdukálására TR-MGC-803 stabil sejtek és 4 ng /ml Blasticidin arra használták, hogy válassza ki a stabil Tet-szabályozott CDH17 gén expressziós sejtek elemzi TR-MGC-803-CDH17_Over stabil sejtvonal.

Cell proliferációs vizsgálati

siRNS tranziens transzfekciós vizsgálatokban, sejtet oltottunk 10 cm-es edénybe, amelynek sűrűsége 5 × 10 ^{6 sejt /edény és transzfektáltuk 20 nM siCDH17 vagy scramble siRNS. Az elegyet 48 óra inkubálás után a sejteket elválasztani és átvisszük 96 lyukas lemez sűrűségben 3000 sejt /lyuk, majd inkubáljuk további 72 órán át. A sejtek életképességét megvizsgáltuk CCK-8 készlet (Donjindo, Japán). TR-indukálható AGS-CDH17_KD stabil sejtek sejteket leoltottuk 60 mm × 15 mm-es edénybe, és kezelt vagy anélkül Tet (0, 2,5 és 5,0 ng /ml) különböző ideig. A sejteket összegyűjtöttük, miután a 2., 3., 4., 5. és 6. napon, és a sejtek számát megszámoltuk ScepterTM Handheld automatizált sejtszámláló (Millipore). A proliferációs mentési assay, TR-indukálható AGS-CDH17_KD stabil sejteket szélesztettünk 60 mm × 15 mm-es edénybe, és tenyésztjük 10 napig, vagy anélkül 5,0 ng /ml Tet. Mentési csoport, a táptalajt tartalmazó TET friss közegre cseréltük a 4. napon, és a sejteket tovább tenyészthetjük, hogy a 10. napon a sejteket minden csoportban összegyűjtöttük napon 2, 4, 6, 8 és 10 sejtek száma számolás és Western-blot elemzéshez.}

Cell migrációs assay

TR-AGS-CDH17_KD stabil sejteket oltottunk 10 cm-es edénybe, és kezelt vagy anélkül Tet (5 ng /ml). Miután 120 órás tenyésztést sejteket összegyűjtöttük és megszámoltuk. 0,1 ml sejtszuszpenziót (1, 2, 3 × 10 ^{4 sejt /ml) adtunk a felső rekesz a kamrából. 0,6 ml 10% FBS-tápközeget adtunk Az alsó rekeszbe egy kemo attraktáns. 24 óra eltelte után az inkubálást 37 ° C-on, a sejteket fixáltuk, 90% -os EtOH-val 4 ° C-on 30 percig, majd megfestettük 0,1% -os kristályibolya 15 percig. A nem-bevándorló sejteket eltávolítottuk a felső arc a transwell membrán egy vattacsomót. A megfestett sejteket ezt követően fényképezett és megszámoltuk fénymikroszkóp alatt.}

Adhézió meghatározása

TR-AGS-CDH17_KD stabil sejteket oltottunk 10 cm-es edénybe, és kezelt vagy anélkül Tet (5 ng /ml). Pre-bevonat a 96 lyukú lemezeken végeztük inkubálva kutak 25 ug /ml fibronektinnel át 4 ° C-on egy éjszakán át. Ahhoz, hogy csökkenteni kell a nem-specifikus kötődés, 1% szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) adunk az egyes lyukakhoz, és inkubáltuk 60 percen át 37 ° C-on, a BSA kétszer mossuk steril PBS-sel. 120 óra után knockdown CDH17 TET, sejteket összegyűjtöttük, és oltottuk előre bevont 96-lyukú lemezeken 4 × 10 ^{4 sejt /lyuk. 2 óra múlva, a nem tapadó sejteket mosással eltávolítjuk, steril PBS-sel kétszer. A tapadó sejteket, majd vizsgáljuk a CCK-8 kit.}

telepképző assay

Először is, a 6-lyukú lemezekre állítottunk elő alsó agar rétegre (0,6% gél). Ezután, a TR-AGS-CDH17_KD sejtek vagy siCDH17 transzfektált sejtek (például proliferációs vizsgálati) szuszpendáltunk teljes tápközegben, amely 0,3% -0,4% Noble-agart (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) és oltottuk előkészített 6 mérőhelyes lemez és tenyésztettük 7 vagy 14 napon át. A sejteket megfestettük tiazolil kék-tetrazólium-bromid (MTT) 2 órán át. A számos sejt kolóniákat megszámoltuk.

cell cycle analysis

TR-AGS-CDH17_KD stabil sejteket oltottunk egy hat lyukú lemezre 1,0 × 10 ^{5 sejt /lyuk és a kezelt 5 ng /ml Tet. 120 óra elteltével a sejteket tripszin és rögzített EtOH-val 4 ° C-on 3 órán át. Ezután a sejteket centrifugáltuk 1500 g-vel 5 percig, és PBS-sel mostuk. Re-szuszpendált sejteket RNáz /PBS-oldatok (20 ng /ml), 37 ° C-on 15 percig keverjük, majd hozzáadunk PI /PBS-oldatok (20 ng /ml), és szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percig, ellenőrzött a megfestett sejteket BD FACS Calibur és elemeztük az adatokat BD CellQuest Pro szoftver.}

az apoptózis elemzése

TR-AGS-CDH17_KD stabil sejteket oltottunk egy hat lyukú lemezre 1,0 × 10 ^{5 sejt /lyuk, és az oldathoz 5 ng /ml Tet. 120 óra elteltével a sejteket tripszin és mossuk előhűtött PBS egyszer. A sejteket újra szuszpendáljuk 500}

• PLoS One: mikroRNS 135a elnyomja nyirokcsomómetastasis keresztül, leszabályozza ROCK1 kora Gyomor Cancer
• PLoS One: A klinikai eredmények gyomorrák következő adjuváns Chemoradiation Kihasználva modulált intenzitású versus Háromdimenziós Conformal Radiotherapy