PLoS ONE: Nukreipimas cad-17 inaktyvuoja Ras /Raf /MEK /ERK signalizacijos ir slopina ląstelių proliferaciją in skrandžio vėžio

Anotacija

cad-17 (CDH17), vienas narys 7D-cad superfamily buvo ekspresija skrandžio vėžiu (GC) ir buvo susijęs su prasta išlikimo, naviko atsinaujinimo, metastazėmis ir pažangios auglio stadijoje. Iki šiol ląstelių funkciją ir signalizacijos mechanizmas CDH17 GC lieka neaiškus. Šiame tyrime mes parodė, kad daugiau nei 66% GC ląstelių linijas (20/30) buvo CDH17 teigiamas. Audinių Mikrogardelė (PMA) Analizės parodė, kad 73,6% Kinijos GC audiniai (159/216) buvo CDH17 teigiamas, o 37% atitinkamos gretimuose normaliuose audiniuose buvo CDH17 teigiamas. Nokdaunas iš CDH17 slopina ląstelių proliferaciją, migraciją, sukibimo ir kolonijų susidarymą, o taip pat sukėlė ląstelių ciklo suėmimą ir apoptozę AGS žmogaus GC ląsteles. Iš kitos pusės, padidėjusią CDH17 palengvino MSV-803 GC naviko augimą nuogas pelių. Antikūnų masyvo ir imunoblotingu tyrimas parodė, kad CDH17 triuškinantis į AGS ląstelių žemyn reguliuojama integrinu ß serijos baltymų, dar inaktyvavo Ras /Raf /MEK /ERK kelią ir paskatino p53 ir p21 kaupimui, o tai lėmė platinimo slopinimas, ląstelių ciklo suimti ir apoptozė indukcija. Apibendrinant, mūsų duomenys pirmiausia įrodyti CDH17 gebėjimą reguliuoti Ras /Raf /MEK /ERK keliu veiklą ląstelių proliferacija GC, ir rodo, kad CDH17 gali tarnauti kaip patrauklią terapinio tikslo būsimiems tyrimams.

citavimo: Lin Z Zhang, C, Zhang, M, Xu D Fang Y Zhou Z et al., (2014) Nukreipimas cad-17 inaktyvuoja Ras /Raf /MEK /ERK signalizacijos ir slopina ląstelių proliferaciją in skrandžio vėžio. PLoS ONE 9 (1): e85296. Doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

redaktorius Claude Prigent Institut de Génétique et Développement de Rennes, Prancūzija

Įstojo: birželio 10, 2013; Priėmė: Lapkričio 26, 2013 m Paskelbta 20 sausio 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Lin et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų: Visi autoriai yra darbuotojai ar ankstesni darbuotojai Roche R & d centras (Kinija), išskyrus YanFen Fang, kuris yra darbuotojas Rytų Kinijos pedagoginiame universitete, Šanchajuje, Kinijoje.. Tai nekeičia autorių laikytis visų PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra klasifikuojama kaip antroji pagrindinė priežastis, pasaulio mirtingumo nuo vėžio ir ketvirtoji dažniausia vėžio visame pasaulyje [1], [2]. Išgyvenamumo mediana laikas GC pacientams 7~10 mėnesių. Dauguma pacientų su GC metu su vėlyvos stadijos ligos, kurių bendras 5 metų išgyvenamumas maždaug 20% ​​ir objektyvi reakcija į įprastinių chemoterapinių režimai diapazonas gali būti padidintas nuo 20% iki 40% [1], [3]. Šiuo metu gydant cisplatinos turinčiais terapija yra vis dar plačiai naudojamas klinikiniuose parametrus pažangių ir metastazavusiu GC. Be to, HER2-neu ekspresija skrandžio adenokarcinoma, trastuzumabu (Herceptin) kartu su chemoterapija pailgina Bendro išgyvenimo mediana 11,1 mėnesio (vien chemoterapija), kad 13,8 mėnesių [4]. Atsižvelgiant į aukštą mirtingumo GC, vis dar yra didžiulė gydymo poreikis rasti jautrią ir patikimą biologinis anksti diagnozuoti GC ir stiprus terapinio tikslo gydymo GC.

CDH17, vienas narys 7D-cad superšeimai pristato vaisiaus kepenų ir virškinimo trakto embriogenezės metu, taigi taip pat vadinamas kepenų ir žarnyno cad (Li cad). CDH17 yra aktyvuojami kepenų ląstelių karcinoma [5], [6], skrandžio vėžys [7], nuo latako kasos vėžys [8] ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys [9] - [11]. Kaip pranešama, CDH17 daugiausia buvo pateikti dėl ląstelių membranos ir nebūti normaliomis skrandžio audinių ir teigiamas rodiklis buvo beveik 78,4% [12]. Sąvoka lygis CDH17 buvo būdinga išplitusiu skrandžio vėžiu, kuris buvo susijęs su blogos prognozės [13]; ir taip pat buvo reikšmingai susijęs su limfmazgių metastazių skrandžio vėžio [14]. Nokdaunas CDH17 su lentivirus sąlygojamą Mirna slopina proliferaciją, kibimas, naviko augimą ir metastazes BGC823 žmogaus skrandžio vėžio ląsteles in vitro ir in vivo [15] - [17]. CDH17 buvo pasiūlyta kaip onkogeno ir naudingo persekiotoją diagnozuoti skrandžio vėžį [18]. Jis buvo matyti, kad CDH17 tarpininkaujant onkogeninė signalizacijos HCC yra susijęs su WNT signalinio kelio [5]. Neseniai buvo pranešta, kad CDH17 sukeltas tumorigenezei ir limfos metastazių GC per aktyvavimo NFκB signalizacijos kelią [19]. CDH17 reguliuojama α2β1 integrino signalizacijos sukelti konkrečią židinio sukibimą kinazės ir Ras aktyvavimo, kuri atvedė prie ląstelių sukibimą ir platinimu padidinti storosios žarnos vėžinių ląstelių [11]. Tačiau pagrindinis vaidmuo ir signalizacijos mechanizmas CDH17 GC lieka neaiškus. Šiame tyrime patvirtinti CDH17 kaip galimą terapinį tikslą GC ir ištirti signalizacijos mechanizmą CDH17 GC, mes charakterizavo CDH17 išraišką žmogaus GC ląstelių linijų ir Kinijos GC audinių, patikrino CDH17 triuškinantis ar per daug įtakos išraiška tumorogeniškas ir metastazavusiu poveikio GC ląstelių linijų ir ištirti galimus signalų kaskadomis, susijusius su CDH17. Mes nustatėme aukštą CDH17 išraišką žmogaus GC ląstelių linijų ir Kinijos GC audinių ir aiškų inhibicija ląstelių proliferaciją, migraciją, sukibimo, kolonijos formavimas, apoptozė indukcijos ir ląstelės ciklo areštą po slopinimo ir CDH17 žmogaus GC ląstelių linijų. Be to, mūsų rezultatai pirmiausia įrodyti CDH17 gebėjimą reguliuoti integrino Ras /Raf /MEK /ERK keliu veiklą ląstelių proliferacija GC, ir rodo, kad CDH17 gali tarnauti kaip patrauklią terapinio tikslo būsimiems tyrimams.

medžiagos ir metodai

etika pareiškimas

naudojimu ir priežiūra eksperimentinių gyvūnų buvo patvirtintas Institucijų gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC), Roche R & d Center "(Kinija). Žmogaus GC audinio blokai su atitinkamų gretimų audinių blokų buvo gauti iš Šanchajaus biochip Company, CRO paslaugų įmonė. Visų žmogaus audinių buvo surinkti su raštišku sutikimu nuo šaltinio pacientams. Visi mobilieji linijos buvo įsigytas iš ATCC, JAV, Japonijos rinkimas tyrimų Bioresources, ir Šanchajuje institutų biochemijos ir ląstelės biologijos, Kinijos mokslų akademijos.

Mobilaus ryšio linijas ir reagentai

Visi ląstelių linijos iš Amerikos Tipinis ląstelių paėmimo (ATCC), japonų kolekcijos tyrimų Bioresources, ir Šanchajuje institutų biochemijos ir ląstelės biologijos, Kinijos mokslų akademijos mokslo išliko atitinkamoje augimo terpė, kuri buvo rekomenduojama pardavėjų. PMD-18T-CDH17 plazmidės buvo iš Kinijos Biologinės Inc. tetraciklino (Tet) buvo iš sigma, Mobilusis skaičiavimas komplektas-8 buvo iš Dojindo molekulinės Tech. Žmogaus plazmos fibronektiną buvo iš R & D sistemas. Transwell kamera buvo iš Corning (6,5 mm skersmens, 8-mkm porų dydžio). CDH17 oligo siRNR buvo iš Genepharma Co. su seka 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 ". Mirti RNR kontrolė (Allstar®) buvo iš QIAGEN.

Audinių mikro masyvo imunohistocheminis

Du šimtai šešiolika parafine skrandžio vėžio audinio blokai kartu su atitinkamais gretimų audinių blokus (greta audinių buvo imami bent 5 cm atstumu nuo pirminių navikų) buvo surinkti ir deponuojami Šanchajus biochip Company. Audiniai buvo suskirstyta ir atsitiktinai parengta ant 3 mikro masyvo skaidres. Pacientų amžius buvo 32-84 metų (amžiaus mediana 65) sustojimo iš 1A-4 pagal Amerikos jungtinio komiteto vėžys (AJCC) gaires ver.7. Visi atvejai buvo diagnozuoti du vyresnieji patologai su patyrusiais specialybės skrandžio vėžio patologija. Skaidres buvo inkubuojamos blokuoja serumas 20 min, po to taikomas 100 pL anti-žmogaus cad-17 giminingumas išgrynintas monokloninis Ab, pelės IgG (R & D MAB1032 1:2000 į TBS /T), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Skaidrės apėmė 100 iL DAKO Įsivaizduoti + /HRP, Triušis /pelė po to kruopščiai nuplauti TBS. Šimtas mikrolitrų substratas-chromogeno tirpalo (DAB), yra susiję su skaidres ir inkubuojami kambario temperatūroje 10 min. Dėmėti skaidres buvo tiriami mikroskopiškai du imunohistocheminis ekspertai. Normalioji pelės IgG kiekis buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Dažymo buvo laikomas neigiamas, kai ne viena teigiama ląstelė membranos nusidažo gali būti identifikuoti ir teigiamas, kai daugiau nei 10% vėžinių ląstelių parodė ląstelių membranos teigiamas imunodažymu.

TR stabili ląstelių linijos

pLenti6 /TR vektorius (Invitrogen, Kat. Nr V48020) ir pLenti3.3 /TR vektorius (Invitrogen, Kat. Nr A11114) buvo naudojamas generuoti stabilias ląstelių linijas, kad constitutively išreikšti aukštus lygius Tet slopinančioje. Šie plazmidės sudėtyje yra elementų, kurie leidžia pakuoti konstrukto į virusų dalelėms ir blasticidin ar geneticinas atsparumo žymeklis atrankos stabiliai transdukuotų ląstelių linijų. Trumpai tariant, 293FT pakavimo ląstelių (Invitrogen, Kat. Nr R700-07) buvo pernešta su pLenti6 /TR ar pLenti3 /TR ir ViraPower ^{TM Pakuotė Mix (Invitrogen, Kat. Nr K4975-00) gaminti lentiviruso dalelės. Lentivirus buvo naudojami transduce AGS ląstelių arba MSV-803 ir blasticidin (8 mikrogramai /ml, Invitrogen, Kat. Nr R210-01) arba geneticinas (200 mikrogramų /ml, Invitrogen, Kat. Nr 10.131-027) buvo naudojama pasirinkti stabilios TR-išreikšti AGS ląstelių, pavadintų TR-AGS stabilią ląstelių liniją arba TR ekspresija MSV-803 ląstelių pavadintas TR-MSV-803 stabili ląstelių linija. Šie TR išreikšti ląstelių linijos buvo naudojami kaip šeimininkai pareikšti konstruktai, kurie palengvina Tet-reguliuojama išraišką CDH17 shRNR (trumpas segtukas RNR) ar CDH17 geno, atitinkamai.}

Stabilūs AGS ląstelių Tet-reguliuojamas išraiška shRNR iš CDH17 geno

Keturi Mirna oligonukleotidai skirtos CDH17 geną ([homo sapiens] Genų ID: 1015) buvo sukurta, naudojant interneto taikymo sistemą (Invitrogen). Tai dukart per dideles DNR liguojami į pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP-miR išraiška sistemos (Invitrogen, Kat. Nr K4936-00), kuris vėliau buvo laikinai transfekuota į AGS ląstelių pagal Lipofectamine 2000 standartines procedūras (Invitrogen, Kačių Ne. 11.668-027). Pagal realaus laiko PGR analizės seka 90-2 (pirmyn gruntas: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 "; Atvirkštinė Gruntas: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3") ir miRNAs parodė aukščiausią efektyvumą ir buvo pasirinktas už forma BP rekombinacijos gauti pENTR-Mirna. tada šis įrašas vektorius buvo panaudotas LR rekombinacijos su pLenti4 /iki /V5 (Invitrogen, Kat. Nr K4920-00) gauti pLenti4 /iki /V5-Mirna lentivirus naudojant Gateway® technologijos (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus buvo naudojami transduce TR AGS stabilius ląsteles ir 200 mikrogramai /ml Zeocin (Invitrogen, Kat. Nr R250-05) buvo naudojamas pasirinkti stabilios Tet-reguliuojamų CDH17 shRNR ekspresijos ląstelių, pavadintų TR AGS-CDH17_KD stabili ląstelių linija.

Stabilūs MSV-803 ląstelių Tet-reguliuojama Padidėjusi CDH17 genų

Trumpai CDH17 seka buvo papildytas iš PMD-18T-CDH17 plazmidės (Kinijos Biologinis Inc.) ir subklonuotas į IRES -EGFP vektorius gauti CDH17-IRES-EGFP naudojant gruntai: į priekį gruntas: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 "; Atvirkštinio gruntas: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Tai konstruktas buvo atlikti BP rekombinacija gauti pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Tada įrašas vektorius ir pLenti6.3 /iki /V5 (Invitrogen, Kat. Nr V370-06) vektorius buvo naudojami LR rekombinacijos gauti pLenti6.3 /iki /V5-CDH17-IRES-EGFP. Tada lentivirus buvo gaminami transduce TR-MSV-803 stabilius ląsteles ir 4 mikrogramai /ml blasticidin buvo naudojamas pasirinkti stabilios Tet-reguliuojamų CDH17 genų ekspresijos ląstelių, pavadintų TR-MSV-803-CDH17_Over stabili ląstelių linija.

ląstelių proliferacija tyrimas

siRNA trumpalaikis transfekcijos tyrimus, ląstelės buvo pasėjamos 10 cm patiekalas su 5 × 10 ^{6 ląstelių /patiekalas tankio ir perkeltų su 20 nm siCDH17 ar peštynės siRNA. Po to, kai 48 h inkubacijos ląstelės buvo atskirta ir perkelti į 96-šulinėlių plokštelės tuo 3000 tankio ląstelių /gerai, tada inkubuojami kitoje 72 h. Ląstelių gyvybingumas buvo tirta su CCK-8 komplektas (Donjindo, Japonija). Už TR-indukuojamas AGS-CDH17_KD stabilių ląstelių, ląstelės buvo pasėjamos į 60 mm x 15 mm lėkštelę ir apdorojimo su arba be Tet (0, 2,5 ir 5,0 g /ml) skirtingu laiku. Ląstelės buvo surinktos po 2, 3, 4, 5 ir 6 dienas ir ląstelių skaičius buvo skaičiuojamas ScepterTM Rankinis automatizuota ląstelių skaitiklis (Millipore). Dėl platinimo gelbėjimo tyrimą, TR indukuojami AGS-CDH17_KD stabilios ląstelės buvo pasėjamos į 60 mm x 15 mm indą ir kultūringas 10 dienų su arba be 5,0 mikrogramai /ml Tet. Gelbėjimo grupės, kultūrinė terpė, kurių sudėtyje yra Tet buvo pakeistas šviežią terpę 4-tą dieną, ir ląstelės buvo toliau būti kultivuojamos į dieną 10. ląstelės, kuriose vyksta kiekvienoje grupėje buvo surinktos 8 ir 10 dieną 2, 4, 6, dėl ląstelių skaičių skaičiavimo ir imunoblotingu analizė.}

ląstelių migraciją tyrimas

TR-AGS-CDH17_KD stabilios ląstelės buvo pasėjamos 10 cm indą ir apdorojimo su arba be Tet (5 mikrogramų /ml). Po to, kai 120 h kultūros, ląstelės buvo surinkti ir suskaičiuoti. 0,1 ml ląstelių suspensijos (1, 2, 3 × 10 ^{4 ląstelių /ml) buvo pridėta prie viršutinės kameroje kameroje. 0,6 ml 10% FBS vidutinės buvo įtraukta į apatinę dėtuve kaip chemotaksio viliojamąją. Po to, kai 24 h inkubacijos esant 37 ° C, ląstelės buvo nustatyti su 90% EtOH, esant 4 ° C temperatūroje 30 min, o vėliau yra nudažomi su 0,1% violetinei 15 min. Kad ne-migrantai ląstelės buvo pašalintas iš viršutinio paviršiaus transwell membranos su medvilnės tamponu. Tamsintas ląstelės vėliau buvo fotografuotas ir skaičiuojami pagal šviesos mikroskopu.}

Mobilusis sukibimas tyrimas

TR AGS-CDH17_KD stabilios ląstelės buvo pasėjamos 10 cm indą ir gydomi arba be Tet (5 g /ml). Iš anksto-danga 96-duobučių lėkštelėse buvo atliktas inkubuojant šulinių iki 25 mikrogramų /ml fibronektino, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Sumažinti nespecifinį, 1% galvijų serumo albuminas (BSA) buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojami 60 min 37 ° C temperatūroje, BSA plautas du kartus su steriliu PBS. 120 val, po triuškinantis CDH17 su Tet, ląstelės buvo renkami ir pasėjamos į iš anksto dengtos 96-duobučių lėkštelėse su 4 × 10 ^{4 ląstelių /gerai. 2 h vėliau, neadhezinę ląstelės buvo pašalintas plaunant steriliu PBS, dėl du kartus. Į prisitvirtinę ląstelės buvo tiriami pagal CCK-8 komplektu.}

kolonija formavimas tyrimas

Pirmiausia, 6-duobučių lėkšteles buvo paruoštas su dugno agaro sluoksnyje (0,6% gelio). Tada, TR-AGS-CDH17_KD ląstelių arba siCDH17 perkeltų ląstelių (kaip proliferacija metodu), buvo sustabdytas visiškai terpėje, turinčioje 0,3% -0,4% Noble agaro (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ir pasėjamos į paruoštą 6 šulinėlių plokštelės ir kultivuojamos 7 arba 14 dienų. Ląstelės buvo tamsintas su tiazolilo mėlyna tetrazolio bromido (MTT) 2 val. buvo skaičiuojami ląstelių kolonijų skaičius.

Mobilaus ryšio ciklo analizė

TR AGS-CDH17_KD stabilios ląstelės buvo pasėjamos į šešių šulinėlių plokštelės bent 1,0 × 10 ^{5 ląstelių /gerai ir apdorojimo su 5 g /ml Tet. 120 h vėliau, Ląstelės buvo surinktos su tripsino ir fiksuoto su EtOH, esant 4 ° C temperatūroje 3 val. Tada ląstelės buvo centrifugated 1500 g 5 min ir plaunamas PBS. Resuspenduotos kietosios ląstelių RNazės /PBS tirpalo (20 mikrogramai /ml), inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 15 min, po to pridedama PI /PBS sprendimus (20 mikrogramų /ml) ir inkubuojama kambario temperatūroje 30 min, tikrinami nudažytą ląsteles su "BD FACS Calibur ir išanalizavo duomenis su BD CellQuest Pro programinę įrangą.}

Apoptozę analizė

TR AGS-CDH17_KD stabilios ląstelės buvo pasėjamos į šešių šulinėlių plokštelės bent 1,0 × 10 ^{5 ląstelių /duobutėje ir apdorojimo su 5 g /ml Tet. 120 h vėliau, Ląstelės buvo surinktos su tripsino ir plaunamas su iš anksto atšaldytą PBS vieną kartą. Ląstelės buvo vėl sustabdytas 500 mikrol 1 × privalomu buferio ir 5 iL PI ir 5 iL AnnexinV (BD) buvo pridėta. Po inkubacijos tamsiai (kambario) temperatūroje 10 min, tamsintas ląstelės buvo tikrinami BD FACS Calibur. Surinkti duomenys buvo analizuojami su BD CellQuest Pro programinę įrangą.}

imunoblotingu analizė

Ląstelės buvo lizuoti Ripa buferio [150 mm NaCl, 1% NP40, 0,25% deoksicholatas ir 10 mm Hepes (pH 7,4)], kurių sudėtyje yra proteazės inhibitorius kokteilis (Roche Molecular Biochemicals). Baltymų koncentracija kiekybiškai naudojant bicinchoninic rūgštis (BCA) metodą (Pierce). Trisdešimt mikrogramų baltymo vienam mėginio buvo virti pakrovimo buferio ir elektroforezė į 8-12% statumo SDS poliakrilamido geliai (Invitrogen) ir perkeliamas ant nitroceliuliozės membranas. Membranos buvo tyrinėjo su antikūnų (CDH17, integrino β1, integrino β4, integrino β5, p-p53, p53, p21 buvo iš R & D Raf p-MEK, MEK p-ERK, ERK buvo iš ląstelių signalizacijos ir "K-RAS buvo iš Santa Cruz) ir po to peroksidazės konjuguoto imunoglobulinu. Vakarų dėmės buvo ryškinamos su patobulinta chemiluminescencja (ECL) komplektas (GE, Sveikatos)

Antikūnų masyvų analizė

Trijų tipų antikūnų matricas buvo gautas iš R &. D Systems, Inc. antikūnų masyvų analizė. Žmogaus Phospho-kinazės masyvas komplektas (Kat. Nr ARY003) yra 43 skirtingų kinazes. Žmogaus Tirpus receptorių masyvas rinkinys Ne Hemopoetinių grupė (Kat. Nr ARY012) yra 119 skirtingų tirpių receptorių. Žmogaus Apoptozę masyvas komplektas (Kat. Nr ARY009) yra 35 skirtingų apoptozę antikūnus. Daugiau išsamios informacijos apie šias matricas galima rasti R &nuorodą; D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabilios Ląstelės buvo surinktos po 120 h gydytų su arba be Tet (5 mikrogramai /ml) ir baltymai buvo lizuojamos lizės buferiniame tirpale su proteazės inhibitorių, ląstelių ekstraktų buvo praskiesti ir inkubuojami su trijų tipų antikūnų matricos vienos nakties , Masyvų buvo išplauti pašalinti nesusietų baltymus, po to inkubacijos su Biotinilinta aptikimo antikūnų kokteilio. Visos procedūros yra pagal rinkinio instrukcija. Dėmės buvo analizuojami densitometrija, ir baltymų ekspresija buvo standartizuoti teigiamą kontrolę, kuri buvo atstovaujama kiekvienai membrana.

Matavimas in vivo

TR MGC803-CDH17_Over ląstelės (1 × 10 ^{7 ląstelės 0,2 ml PBS) buvo švirkščiamas į kairę pažastį ir 5~6 savaičių BALB /c nu /nu athymic Moteris pelė (Kinijos ir Didžiosios Britanijos SIPPR /BK Lab ". gyvūnų Ltd, Kinija). Naviko tūris (mm 3) buvo matuojamas žnyplių ir apskaičiuojamas taip (w 2 × L) /2, kur W yra plotis ir L yra ilgis. Kai navikas apimtis sudarė ~100 mm 3, pelėms buvo randomizuoti į dvi grupes (9 pelėmis kiekvienoje grupėje). Tetracylcine indukcija (Invitrogen, 0,2 mg /ml, tiekiamas sterilizuoti geriamojo vandens, kuriame yra 2,5% masės sacharozės) buvo inicijuota dėl grupavimo dieną. Sterilizuoti geriamojo vandens, kuriame yra 2,5% masės sacharozės buvo tiekiama į pelių neindukuotų grupės. Naviko apimtys buvo įrašyti kas 3 dienas, kol gyvūnai buvo paaukota. Po 35 dienų indukcijos, ksenografiniuose navikų audiniuose, buvo surinkti ir pateikti Vakarų blot analizės santykinio baltymų išraiška.}

Statistinė analizė

Duomenų buvo išreikštas reiškia ± Š.D. ir statistiškai taikoma Stjudento neporiniai t-testą. A P <lygis; 0,05 buvo laikoma reikšminga

Rezultatai

išraiška profilis CDH17 skrandžio vėžio

išraiška lygis CDH17 baltymų 30 ląstelių linijų buvo suskirstyti. į 4 grupes remiantis duomenimis iš optinio tankio analizę prieš beta-aktino. AGS ląstelių linija buvo naudojama kaip vidinio standarto išvengti tarp geliai neatitikimą. Per 66% GC ląstelių linijas (20/30) buvo CDH17 teigiamas (1A pav.)

išraiška ir lokalizacija CDH17 pirminėje audinių parafino skyriuje buvo aptiktas imunohistocheminiu apie audinių mikrogardelių. Lyginant su kontrolinės skaidres sutepa įprastą pelę IgG, CDH17 mAb dažymo parodė aiškią ląstelių membranos lokalizaciją (1b pav.) Tarp 216 atvejų, kuriems patvirtinta patologija diagnozei ataskaitą, 73,6% vėžiniai audiniai (159/216) priglaudė teigiamą CDH17 dėmę balais nuo + iki +++, o (1 lentelė) 37% teigiamas CDH17 dėmių atitinkamuose gretimuose normaliuose audiniuose. Be CDH17 teigiamų atvejų, išraiška lygis CDH17 turi teigiamą koreliaciją su limfmazgių metastazių. Tačiau pasakymas lygis atvirkščiai susijęs su skrandžio sienelės invazijos, naviko tolimoje metastazėmis ir naviko TNM etapais. Mūsų stebėjimas atitiko ankstesnių klinikinių ataskaitų [20] - [22]. Tarp CDH17 teigiamų atvejų vėžinės audiniai eksponuojami stipresnį dažymas CDH17 (32,1% kaip balais + 25,2%, kaip netikėtai ++ ir 42,8%, kaip netikėtai +++), nei gretimų sveikų audinių (62,5%, kaip netikėtai + 21,3% kaip taškų ++ ir 16,3%, kaip netikėtai +++). Nors nėra reikšmingas ryšys buvo pastebėtas tarp dėmių taškų ir klinikinės stadijos. Atsižvelgiant visa tai liudija kartu, CDH17 gali būti diagnostikos žymeklį ankstyvos stadijos skrandžio vėžio Kinijos gyventojų.

RNRi tarpininkaujant numušti CDH17 ant GC ląstelių linijas parodė slopinimo ląstelių proliferaciją ir "Colony formavimo in vitro

"remiantis CDH17 ekspresijos profilio rezultatus GC ląstelių linijų plokštės (pav 1A), AGS (didesnis CDH17), BGC-823 (mažesnis CDH17) ir HGC-27 (nė CDH17) ląstelių linijas buvo atrinkti toliau in vitro ląstelių funkcinio vertinimo su RNRi sąlygojamą CDH17 nuslopinami. Imunoblotingu parodė, kad AGS ląstelės turėjo aukštą CDH17 baltymų lygį ir išraiška CDH17 buvo nuversta beveik visiškai iki siCDH17. BGC823 ląstelės turėjo mažą CDH17 baltymų lygį ir HGC-27 neturėjo CDH17 baltymų (2a pav.) Palyginti su peštynės kontrolinių ląstelių, CDH17 numušti turėjo mažai įtakos proliferacijos gebėjimas BGC823 ir HGC27 ląstelių, o turėjo didelės įtakos AGS (60% po 72 h, 2b pav.) Minkštas agaras tyrimas parodė, kad gebėjimas sudaryti kolonijas buvoinhibuotas AGS ląstelių, jei CDH17 buvo numušti (66% ne 14 D), bet BGC823 ląstelių ir HGC27 ląsteles, CDH17 numušti turėjo mažai įtakos kolonija formavimo gebėjimą (paveikslas 2C). Nebuvo akivaizdus skirtumas tarp BGC823 ląstelių (žemos CDH17 lygio) ir HGC-27cells (ne CDH17) į platinimu ir "Colony formavimosi slopinimu sukeltos siRNR CDH17 triuškinantis.

Stabilūs ląstelių linijas, vežantys TR indukuojamą triuškinantis iš CDH17 į AGS ląstelių ir padidėjusi CDH17 į MSV-803 ląstelių

taikinio sekos exon13 (90-2) davusią virš 90% sumažinti iRNR lygio (3A pav.) Tada mes naudojome pLenti4 /iki /V5-Mirna-90-2 CDH17 lentivirus į transduce TR AGS stabilius ląsteles ir gavo stabilią Tet-reguliuojama išraišką shRNR iš CDH17 genų ląstelių (TR-AGS-CDH17_KD), kurį CDH17 baltymų lygis buvo sumažintas apie 90% po to, kai sukeltas su 5 g /ml Tet (3B pav). PLenti6.3 /iki /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus buvo naudojamas transduce TR-MSV-803 stabilius ląsteles ir atrinkti blasticidin gauti stabilų Tet-reguliuojama išraišką CDH17 genų ląstelės (TR-MSV-803-CDH17_Over) , Iš CDH17 raiška šiame stabilios ląstelės buvo patvirtinta baltymų lygio Imunoblotingo (4a pav.)

triuškinantis iš CDH17 sukeltas slopinimo ląstelių proliferaciją, migraciją, sukibimo, kolonijos formavimo ir indukcijos ląstelių ciklo arešto ir apoptozė

TR-AGS ląstelių (kontrolinių ląstelių) ir TR-AGS-CDH17_KD ląstelės buvo naudojamas įvertinti galimą ląstelių funkcinius padarinius shRNR sąlygojamą CDH17 triuškinantis į AGS ląsteles. TR-AGS-CDH17_KD ląstelės gydomi 5 mikrogramai /ml Tet pakilo į ląstelių proliferaciją sumažinti (bent 5 dienas iki 75,8%), ląstelių migracija gebėjimai (iki 68,1%, esant 16 h), ląstelių sukibimą gebėjimai (46,8% bent 30 minučių ) ir kolonijas sudarančių galimybę (92,7% iki 7 dienų), palyginti su teta nemokamai (Fig.3C). Daugėja gelbėjimo tyrime CDH17 nokdaunas TR-AGS-CDH17_KD ląstelių sukeltų Tet gali būti išgelbėti pašalinant Tet. Nuėmus Tet birželio 4 dieną, iš naujo išraiška CDH17 buvo pastebėta 8 ir 10 kultūros dieną CDH17 shRNR triuškinantis AGS ląsteles. Re išraiška CDH17 gali išgelbėti platinimo gebėjimas TR AGS-CDH17_KD ląstelių (3D pav.) Palyginti su tet nemokamai TR AGS-CDH17_KD ląstelių Tet ląsteles parodė žymiai didesnį procentą ląstelių G0 /G1 ir G2 /M fazės ir dramatiškai mirusiojo procentą ląstelėmis S fazėje (3e pav). Tuo tarpu, mes taip pat pastebėjo, kad apoptozinių ląstelių skaičius (52,2%, esant 5 dienų) buvo padidintas žemyn reguliavimo CDH17 TR-AGS-CDH17_KD ląstelių (3f pav). Nėra didelio skirtumo buvo rastas TR AGS stabilios ląstelių linijos su arba be Tet inkubacijos.

Padidėjusi CDH17 skatino navikų audiniuose augimą nuogas Pelės

TR-MSV-803-CDH17_Over ląstelių buvo suleistas po oda į BALB /c nuogas pelių kraštais, kad susidarytų kietą auglį. Iš CDH17 išraiška buvo pagal Tet kontrolės geriamuoju vandeniu. Rezultatai parodė, kad po 35 dienų indukcijos Tet sukeltos grupė (naviko tūrį = 1849,08 ± 423.46m3) eksponuojami 2.27 kartus didesnį augimo pažangos tempo, palyginti su Tet-nemokamai grupė (naviko tūrio = 814.04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( 4B diagrama), o sukeltas CDH17 išraiška navikų audiniuose gali būti analizuojami Imunoblotingo (4c paveikslą). Ji nurodė, kad CDH17 vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio kancerogenezėje. Mes taip pat naudojamas TR-AGS-CDH17_KD ląsteles stebėti, ar triukšmo slopinimo ir CDK17 gali turėti įtakos nuogas pelių tumorogeniš-. Deja, navikas imtis norma Šio ląstelių linijos buvo labai mažas ir nėra patikimos in vivo rezultatus buvo pastebėta su TR-AGS-CDH17_KD ląstelių linija.

nustatymas susijusių baltymų lygiai po triuškinantis CDH17 antikūnų masyvų tyrimo

Pasak kancerogeniniam poveikio (slopina ląstelės proliferacijos, kolonijos formavimo ir naviko augimą in vivo) ir metastazavusiu poveikio (slopina ląstelės migracijos ir sukibimo) ir CDH17 triuškinantis, mes pasirinkti tris antikūnų matricos (nuo r & d sistemas ) išbandyti santykinius baltymų pokyčius ir tikiuosi rasti stiprus CDH17 reguliuojamas susijusius baltymus. Į apoptozės masyvo, fosfo-p53 (S15, S46 ir S392) ir p21 /CIP1 /CDNK1A išraiška padidėjo apie du kartus po 5 g /ml Tet gydymo 5 dienas, palyginti su neapdorotų ląstelių (5A pav (a) ir 5B). Į fosfo-kinazės masyvas, PHOSPHO-P53 (S15, S46 ir S392) sąvoka taip pat padidėjo po Tet gydymo, ir tuo pačiu metu, išraiška fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) sumažėjo (5a pav (B) ir 5B). Be tirpios receptorių masyvas, triuškinantis ir CDH17 į AGS ląstelių gali žymiai sumažinti integrinu β1, β4, β5 išraiška, o ne paveikti EGFR išraišką (5a pav (C) ir 5b). Modifikavimo santykis suinteresuotų baltymų tarp Tet-on ir Tet-nemokamai AGS ląstelės buvo apibendrinti 5B pav.

triuškinantis iš CDH17 į AGS downregulated beta integrinams ir Rasa /Raf /MEK /ERK signalinio kelio

baltymų pokyčiai nuo antikūnų masyvo tyrimu buvo patvirtinta Vakarų blotingo analizė. Rezultatai parodė, kad gerokai sumažės integrinu β1, β4, β5 ir PHOSPHO-ERK į CDH17 triuškinantis AGS ląsteles, bet jokių didelių pokyčių viso ERK (5c pav.) Tada mes įvertino kitų Ras /Raf /MEK /ERK signalinio kelio komponentų dalyvavimą. Nokdaunas iš CDH17 lėmė žemyn reguliavimo Raf, fosfo-MEK ir PHOSPHO-ERK baltymų (5c pav). Iš TR-MSV-803-CDH17_Over in vivo tyrimo, mes nustatėme, kad CDH17 raiškos sustiprintas integrino β1, β4, β5 išraiška ir ERK aktyvinimą (4c pav) ir ji yra suderinama su pirmiau nustatytų faktų. Ištirti, ar CDH17 poveikis integrinų ar Ras baltymų yra tiesioginis bendradarbiavimas ar ne, bendrai imunoprecipitacijos iš CDH17 su integrinu β1, integrinu β4, integrinu β5, integrinu α2 ir Rasa buvo atlikta skrandžio vėžio AGS ląstelių, atitinkamai. Iš lūkesčius, priešingai Bartolome anketa rezultatas [11], nebuvo tiesioginis ryšys tarp CDH17 ir bet kurios šių integrinų ar Ras baltymų vieną (nerodomas duomenys).

Diskusijos

Tai didelis iššūkis gydytojams ir pagrindinių mokslininkų nustatyti molekulinius žymenis, susijusius su progresavimo ir prognozės, susijusios vėžio. Kepenyse ir skrandžio vėžio, manoma, kad aukštos išraiška CDH17 buvo susijęs su prastos išlikimo, auglio augimą, naviko invazijos, metastazių ir pažangiosios naviko etape [23] - [25]. Be dabartinio tyrimo, tarp 30 plokštės GC ląstelių linijų, per 66% mūsų tirtų ląstelių linijas (20/30) yra CDH17 teigiamas, ir beveik pusė šių ląstelių linijų turėti aukštąjį CDH17 išraiška. Mūsų patologijos diagnostikos ataskaita, 73,6% kinų GC vėžiniai audiniai (159/216) priglaudė teigiamą CDH17 dėmę. Be CDH17 teigiamų atvejų, išraiška lygis CDH17 turi teigiamą koreliaciją su limfmazgių metastazių. Tačiau pasakymas lygis atvirkščiai susijęs skrandžio sienos invazija, naviko toli metastazes, ir naviko TNM etapus. Mūsų stebėjimas atitiko ankstesnių klinikinių ataskaitų [20] - [22]. Atsižvelgiant visa tai liudija kartu, CDH17 gali būti diagnostinis žymeklis ankstyvos stadijos skrandžio vėžio Kinijos gyventojų.

Norėdami nustatyti CDH17 poveikį skrandžio vėžio tumorigensis ir metastazavusiu potencialo, tiek oligo siRNA ir TR indukuojami pLentiviral vektoriai su specifinis Mirna (exton13) prieš CDH17 buvo naudojami grandininį žemyn CDH17 raiškos skrandžio vėžio ląstelių linijas. CDH17 triukšmo slopinimo iki oligo siRNA gali slopinti ląstelių proliferaciją ir kolonijų susidarymą GC ląstelių linijų su dideliu CDH17 išraiška. Šis poveikis buvo dramatiška apie AGS, kuri turi didesnį CDH17 išraišką, bet ne BGC823 ir HGC27 ląstelių, kurios labai mažas arba jokio CDH17 baltymo ekspresija (2 paveikslas). Ji nurodė, kad CDH17 išraiška gali prisidėti prie vėžio ląstelių proliferaciją ir kolonija formavimo sugebėjimą AGS ląsteles. Be to, panašūs rezultatai taip pat buvo pastebėtas Tet sukeltos shRNR sąlygojamą CDH17 triuškinantis į AGS ląstelių, kurios lėmė slopina ląstelės dauginimosi, migracijos, sukibimo, kolonijos formavimo ir sukeliama apoptozė ir ląstelių ciklo arešto in vitro. Re išraiška CDH17 gali išgelbėti platinimo gebėjimas TR AGS-CDH17_KD ląstelių (3 paveikslas). Be to, Tet sukeltas per išraiška CDH17 TR-MGC803-CDH17_Over ląstelių gali skatinti navikų audiniuose augimą in vivo (4 pav.) Atsižvelgiant visa tai liudija kartu, mes galime daryti išvadą, kad yra reikšminga koreliacija tarp CDH17 išraiškos ir kancerogeniniam ir metastazavusiu gebėjimų skrandžio karcinoma, ir CDH17 gali tarnauti kaip galimą terapinį tikslą būsimiems tyrimams.

Nors keletas Ankstesnis tyrimai buvo pranešta, kad triukšmo slopinimo ir CDH17 gali slopinti ląstelių proliferaciją GC ląsteles, signalizacijos mechanizmas CDH17 lieka neaiškus. Jis buvo matyti, kad CDH17 tarpininkaujant onkogeninė signalizacijos HCC yra susijęs su WNT signalinio kelio [5]. Tačiau, ten buvo keletas skirtumų tarp mūsų rezultatus ir rezultatus, apie kuriuos pranešė Liu HCC. Mūsų rezultatai parodė, jokios fosforilinto forma glikogeno sintezės kinazės 3β (GSK-3β kaita ir beta-kateninai palikdama branduolio po slopinimo CDH17 (duomenys neparodyti). Šis neatitikimas gali būti paaiškinamas tuo, kad skirtingų vėžio ląstelių tipas ir panaudojimas

• PLoS ONE: MicroRNA 135a slopina limfmazgio Metastazė per Down-reglamento ROCK1 ankstyvą Skrandžio Cancer
• PLoS ONE: Klinikiniai rezultatai skrandžio vėžio šie Pagalbinis chemoterapija ir radioterapija naudojant intensyvumas moduliacija, palyginti su trimačiu konforminės Radiotherapy