PLoS ONE: Ciljanje kadherina-17 deaktivira Ras /Raf /MEK /ERK signalizaciju i inhibira proliferacija stanica u želučanoj Cancer

Sažetak pregled

kadherina-17 (CDH17), jedan član 7D-kadherina superfamilije, prekomjerno u želučanom raka (GC) i povezuje se s lošom preživljavanje, recidiva tumora, metastazama i uznapredovaloj fazi tumora. Do sada je stanični funkcija i signalizaciju mehanizam CDH17 u GC ostaje nejasno. U ovom istraživanju, pokazali smo da preko 66% GC staničnih linija (20/30) su CDH17 pozitivni. Tkivo mikropostrojima (TMA) testa pokazali su da 73,6% kineskih GC tkiva (159/216) su bili CDH17 pozitivno, dok je 37% odgovarajućih susjednih normalna tkiva su CDH17 pozitivni. Obaranje CDH17 inhibiran proliferacije stanica, migracije, ljepive i kolonija formaciju, a također potiče zaustavljanje staničnog ciklusa i apoptozu u AGS ljudsko GC stanicama. S druge strane, prekomjerna ekspresija CDH17 olakšano MGC-803 GC rast tumora kod golih miševa. Antitijelo polje i Western blot analiza pokazala da je obaranje CDH17 u AGS stanicama dolje regulira integrin ß serije proteina, dodatno inaktivirani Ras /Raf /MEK /ERK put i dovela do p53 i akumulacije p21, što je rezultiralo u inhibiciji proliferacije, staničnog ciklusa uhititi i indukcije apoptoze. Zajedno, naši podaci prvo pokazuju sposobnost CDH17 regulirati aktivnost Ras /Raf /MEK /ERK staze za proliferaciju stanica u GC, te sugeriraju da CDH17 može poslužiti kao atraktivno terapijski cilj za buduća istraživanja. Pregled

navod: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Z Zhou, et al. (2014) Ciljanje kadherina-17 deaktivira Ras /Raf /MEK /ERK signalizaciju i inhibira proliferacija u rak želuca. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296 pregled

Urednik: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francuska pregled

Primljeno: 10. lipnja 2013. godine; Prihvaćeno: 26. studenog 2013; Objavljeno: 20 siječanj 2014 pregled

Copyright: © 2014 Lin i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa: Svi autori su zaposlenici ili ranijih zaposlenika Roche R &D centar (Kina), osim YanFen Fang, koji je zaposlenik East China Normal University, Šangaju, Kina.. To ništa ne mijenja pridržavanje autorovih svim PLoS ONE politika na razmjenu podataka i materijala. Pregled

Uvod pregled

Rak želuca (GC) je rangiran kao drugi vodeći uzrok globalne smrtnosti od raka i četvrti najčešći rak u svijetu [1], [2]. Srednja vrijednost vremena preživljenja GC bolesnika 7~10 mjeseca. Većina bolesnika s GC sadašnjosti s kasnim stadijem bolesti s ukupnim 5-godišnje preživljavanje oko 20% i objektivnim stopama odgovora na konvencionalno kemoterapijski režime raspona može se poboljšati s 20% na 40% [1], [3]. Trenutno, cisplatin-based terapija je još uvijek široko koristi u kliničkim uvjetima za napredne i metastatske GC. Osim toga, za HER2-neu ekspresijom želučanog adenokarcinoma, trastuzumab (Herceptin) u kombinaciji s kemoterapijom produžuje Prosječno preživljavanje s 11,1 mjeseci (samo kemoterapijom) na 13,8 mjeseci [4]. S obzirom na veliku stopu smrtnosti od GC, još uvijek postoji velika neostvarena potreba u medicini pronaći osjetljiv i pouzdan biomarkera za rano otkrivanje GC i moćan terapijski cilj za liječenje GC. Pregled

CDH17, jedan član 7D-kadherina superobitelji, predstavlja u fetalne jetre i probavnog trakta tijekom embriogeneze, čime se također zove kao kadherina jetre-intestinalni (LI kadherina). CDH17 je izraženo u hepatocelularnog karcinoma [5], [6], rak želuca [7], duktalni karcinom gušterače [8] i rak debelog crijeva [9] - [11]. Kao što je prikazano, CDH17 je uglavnom prisutan u staničnoj membrani i ne nastupa u normalnim tkivima želuca i pozitivna brzina je gotovo 78,4% [12]. Razina izraz CDH17 bila karakteristična za napredno želučanog karcinoma koji je povezan s lošom prognozom [13]; a također je značajno povezan s limfnih čvorova metastaza u rakom želuca [14]. Obaranje CDH17 s lentivirus posredovanog Mirna inhibiraju proliferaciju, prianjanje, rast tumora, i metastaza BGC823 ljudskih stanica raka želuca i in vitro i in vivo [15] - [17]. CDH17 je predložen kao onkogen i koristan marker za dijagnozu raka želuca [18]. Ona je pokazala da CDH17 posredovana onkogeni signalizacija u HCC je u svezi s Wnt signalnog puta [5]. Nedavno je objavljeno da CDH17 izazvana tumorigenezi i limfni metastaza u GC kroz aktivaciju NFκB signalizacije [19]. CDH17 regulirani α2β1 integrin signalizirajući da izazove određenu žarišne adhezije kinaze i Ras aktivaciju, što je dovelo do povećanja stanične adhezije i proliferacije stanica raka debelog crijeva [11]. Međutim, glavna uloga i signalizacija mehanizam CDH17 u GC ostaje nejasno. U ovom istraživanju, kako bismo provjerili CDH17 kao potencijalni terapijski cilj za GC i istražiti signalni mehanizam CDH17 u GC, naznačen time da izraz CDH17 u ljudske GC staničnim linijama i kineskim GC tkiva, provjerio utjecaj CDH17 obaranje ili nad- izraz tumorskih i metastatske učinka GC stanicama i istražili moguće kaskade signala koji se odnose na CDH17. Uočili smo visoku ekspresiju CDH17 u ljudskim GC staničnim linijama i kineskim GC tkiva i jasan inhibicije u staničnu proliferaciju, migraciju, adheziju, stvaranje kolonija, indukcija apoptoze i staničnog ciklusa nakon utišavanje od CDH17 u ljudskim GC staničnim linijama. Nadalje, naši rezultati pokazuju prvo kapaciteta CDH17 regulirati aktivnost integrinskog-Ras /Raf /MEK /ERK staze za proliferaciju stanica u GC, te sugeriraju da CDH17 može poslužiti kao atraktivno terapijski cilj za buduća istraživanja. Pregled

Materijali i metode pregled

Etika izjava pregled

korištenje i briga o pokusnim životinjama je odobren od strane njega i uporaba odbora institucionalna životinja (IACUC), Roche R &D Center (Kina). Blokovi za ljudska GC tkiva s odgovarajućim susjednih blokova tkiva dobiveni su iz Šangaja biočip Company, CRO tvrtka za pružanje usluga. Sva ljudska tkiva su prikupljeni uz pisanu suglasnost izvora pacijenata. Sve stanične linije su kupljene od ATCC, SAD, japanski zbirci istraživanja Bioresources, Šangaj instituta za biokemiju i staničnu biologiju, Kineske akademije znanosti. Pregled

staničnim linijama i reagensi pregled

Sve stanične linije American Tipična Cell Collection (ATCC), japanski zbirci istraživanja Bioresources, Šangaj instituta za biokemiju i staničnu biologiju, kineske akademije znanosti bili su održavani u odgovarajućem mediju za rast koje su preporučene od strane proizvođača. PMD-18T-CDH17 plazmid je iz Sino Biological Inc tetraciklina (Tet) od Sigma, brojanja Kit-8 je iz Dojindo molekularnu Tech. Humanog plazma fibronektina je od R &D systems. Transwell® komora je od Corning (6,5-mm promjera, 8 um veličine pora). CDH17 oligo siRNA je iz Genepharma Co. sa slijedom 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Bježi kontrola RNA (Allstar®) bio je od QIAGEN. Pregled

Tissue mikro niz imunohistokemijski pregled

Dvije stotine i šesnaest uklopljenog u parafin, želučani karcinom tkiva blokova, zajedno s odgovarajućim susjednih blokova tkiva (susjedno tkivo je uzorkovano najmanje 5 cm udaljen od primarnih tumora) su prikupljeni i pohranjeni od strane Šangaju biočip tvrtke. Tkiva su razdvojeni i nasumično pripremljena na 3 mikro array slajdova. U dobi od pacijenata bili su 32-84 godina (srednja dob 65) sa skele od 1A-4 prema američkom Zajedničko povjerenstvo za rak (AJCC) smjernice ver.7. Svi predmeti su dijagnosticirana dva viši patologa sa iskusnim disciplini u želučanom patologiju raka. Rezovi su inkubirani u blokiranju seruma tijekom 20 min, zatim pokrivena 100 uL anti-humani kadherin-17 afinitet pročišćen monoklonalnog antitijela, IgG (R &D MAB1032 1:2000 u TBS /T), na 4 ° C preko noći. Rezovi su obuhvaćene 100 ul DAKO isplanirati + /HRP, Zec /Miš nakon što je temeljito oprati s TBS. Stotinu mikrolitara supstrat-otopina kromogena (DAB) se primjenjuju na stakalca i inkubira na sobnoj temperaturi 10 min. Slajdova su mikroskopski dva imunohistokemijske stručnjaka. Normalni mišji IgG je korišten kao negativna kontrola. Obojenje smatra se negativnim kada nema pozitivnog stanične membrane bojenje mogu se identificirati i pozitivna kada je više od 10% tumorskih stanica pokazala staničnu membranu pozitivne imunobojenja. Pregled

TR stabilne stanične linije

pLenti6 /TR vektor (Invitrogen, Mačka br. V48020) i pLenti3.3 /TR vektor (Invitrogen, Mačka. No. A11114) uporabljeni su za generiranje stabilne stanične linije koje su konstitutivno eksprimiraju visoke razine Tet repressor. Ovi ekspresijski plazmidi sadrže elemente koji omogućuju pakiranje konstrukta u viriona i blasticidin ili geneticin markera otpornosti za selekciju stabilno transduciranih staničnih linija. Ukratko, stanice 293FT pakiranje (Invitrogen, Mačka Br. R700-07) transfektirane s pLenti6 /TR ili pLenti3 /TR i ViraPower ^{TM pakiranje Mix (Invitrogen, kat. Br K4975-00) i dobiveno je lentivirusni čestice. Lentivirus su korišteni da transducira AGS stanice ili MGC-803 i blasticidin (8 ug /ml, Invitrogen, Mačka Br. R210-01) ili geneticin (200 ug /ml, Invitrogen, Mačka Br. 10131-027) se koristi se za odabir za stabilan TR-izražavanje AGS stanica pod nazivom TR-AGS stanična linija ili TR-izražavaju MGC-803 stanica po imenu TR-MGC-803 stabilna stanična linija. Ove TR izražavanje stanične linije korištene su kao domaćini za ekspresiju konstrukata koji olakšavaju Tet reguliraju ekspresiju CDH17 shRNA (kratko ukosnica RNA) ili CDH17 gena, respektivno. Pregled}

Stabilni AGS stanice s Tet regulaciji ekspresije shRNA od CDH17 gena pregled

Četiri Mirna oligonukleotidi koji ciljaju CDH17 gen ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) bile su kreirane pomoću sustava internet aplikacija (Invitrogen). To dvolančana DNA se ligira u pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP-miR ekspresijski sustav (Invitrogen, Mačka. Br K4936-00), koji se zatim transficiraju privremeno u AGS stanice LipofectAMINE 2000 standardnim postupcima (Invitrogen, Mačka br. 11668 - 027). Prema stvarnom vremenu PCR analize sekvenca 90-2 (Forward primer 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 'reverzni primer 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3'), miRNAs pokazao najveću efikasnost te je izabran na oblik BP rekombinacije za dobivanje pENTR-Mirna. Zatim je korišten Ovaj unos vektor u LR rekombinacije s pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, Mačka. br K4920-00) za dobivanje pLenti4 /do /V5-Mirna lentivirus pomoću Gateway® tehnologije (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus su korišteni da transducira TR-AGS stabilne stanice i 200 ug /ml Zeocin (Invitrogen, Mačka Br. R250-05) se koristi za odabir za stabilno Tet-reguliranih CDH17 shRNA ekspresije stanica nazvanih TR-AGS-CDH17_KD stabilna stanična linija. pregled

Stabilni MGC-803 stanica s Tet održavanoj prekomjernom ekspresijom CDH17 gena Netlogu

Ukratko, CDH17 slijed se pojačava iz PMD-18T-CDH17 plazmida (Sino Biological Inc.) i subkloniran u IRES -EGFP vektor da bi se dobio CDH17 Ires-EGFP uporabom primera: Forward primer 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Obrnuti primer 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Taj konstrukt je upotrijebljen za obavljanje BP rekombinacije za dobivanje pENTR-CDH17 Ires-EGFP. Tada je ulazak vektor i pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Mačka. Br V370-06) vektor se koristi u LR rekombinacije dobiti pLenti6.3 /do /V5-CDH17-TRES-EGFP. Zatim lentivirus proizvedeni da transducira Tr-MGC-803 stabilne stanice i 4 ug /ml blasticidin selekcionira za stabilnim Tet-regulirane ekspresije gena CDH17 stanica nazvanih TR-MGC-803-CDH17_Over stabilna stanična linija. Pregled

test stanične proliferacije pregled

siRNA prolazne pokusu transfekcije, stanice su nasađene u 10 cm posudi s gustoćom od 5 x 10 ^{6 stanica /posudi i transfektirane s 20 nM siCDH17 ili jagma siRNA. Nakon 48 sati inkubacije, stanice su odvojene i prenese u 96 jažica u gustoći od 3000 stanica /jažici, a zatim inkubirana još 72 sata. Stanična vijabilnost je testirana sa CCK-8 kit (Donjindo, Japan). Za TR-inducibilne AGS-CDH17_KD stabilnih stanica, stanice su nasađene u 60 mm × 15 mm posude i tretira se sa ili bez Tet (0, 2.5 i 5.0 ug /ml) za različita vremena. Stanice su sakupljene nakon 2, 3, 4, 5 i 6 dana i broj stanica su izbrojane ScepterTM Ručni Automated brojenje stanica (Millipore). Za pokusu proliferacije spašavanja TR indukcijske AGS-CDH17_KD stabilne stanice su posađene u 60 mm × 15 mm posude i kultivirane tijekom 10 dana, sa ili bez 5.0 ug /ml Tet. Za sanaciju skupinu, medij kulture sadržava Tet je zamijenjen svježim medijem na dan 4 i stanice su dalje se kultiviraju na dan 10. stanice u svakoj grupi se ubirala na dan 2, 4, 6, 8 i 10 broj stanica brojanja i Western blot analize. pregled}

migracija stanica test pregled

TR-AGS-CDH17_KD stabilne stanice su posađene u zdjelici od 10 cm i tretira sa ili bez Tet (5 ug /ml). Nakon 120 sati kulture, stanice su sakupljene i izmjerena. 0,1 ml stanične suspenzije (1, 2, 3 × 10 ^{4 stanica /ml) se doda u gornji odjeljak komore. 0,6 ml 10% FBS medij je dodan u donji pretinac kao kemo privlačenje. Nakon 24 sata inkubacije na 37 ° C, stanice su fiksirane s 90% EtOH pri 4 ° C 30 min, a zatim obojeni sa 0.1% kristalno ljubičastog 15 min. Stanice koje nisu migranti su uklonjene iz gornjeg lica transjažice membrane sa štapićem obloženim vatom. Obojene stanice su potom fotografiran i izbrojene pod svjetlosnim mikroskopom. Pregled}

Adhezija stanica test pregled

TR-AGS-CDH17_KD stabilne stanice su posađene u zdjelici od 10 cm i tretira sa ili bez Tet (5 ug /ml). Pre-oblaganje 96 jažica je provedena inkubiranjem jažice s 25 ug /ml fibronektina na 4 ° C preko noći. Da se smanji nespecifično vezanje, 1% goveđi serum albumin (BSA) je dodan u svaku jažicu i inkubirano 60 minuta na 37 ° C, BSA je bila isprana dva puta sa sterilnim PBS. 120 sati nakon obaranje CDH17 s Tet, stanice su sakupljene i nasađene na prethodno prevučene ploče s 96 jažica sa 4 × 10 ^{4 stanica /jažici. 2 sata kasnije, nevezane stanice uklonjene ispiranjem sa sterilnim PBS dva puta. Prihvaćene stanice su ispitane na CCK-8 seta. Pregled}

Colony Test formiranje pregled

Prvo, 6 jamica su pripravljeni s donjim slojem agar (0,6% gel). Zatim, TR-AGS-CDH17_KD stanice ili siCDH17 transfektirane stanice (kao što je proliferacija određivanje) suspendirane su u kompletnom mediju koji sadrži 0.3% -0.4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), te nasađene u pripravljenog 6 jamica i kultivirane 7 ili 14 dana. Stanice su obojene tiazolil plavo tetrazolijeva bromida (MTT) tijekom 2 sata. Broj staničnih kolonija broje. Pregled

staničnog ciklusa analiza pregled

TR-AGS-CDH17_KD stabilne stanice su posađene na ploče sa šest na 1,0 x 10 ^{5 stanica /jažica, te obradi s 5 ug /ml Tet. 120 sati kasnije, stanice su sakupljene s tripsinom i učvršćen s EtOH pri 4 ° C tijekom 3 sata. Zatim su stanice centrifugirana na 1.500 g tijekom 5 min i ispere s PBS. Resuspendirane stanice RNase /PBS otopine (20 ug /ml), inkubirati na 37 ° C 15 min, zatim je dodana PI /PBS otopine (20 ug /ml) i inkubira na sobnoj temperaturi 30 minuta, inspekciju obojenih stanica s BD FACS Calibur i analizirati podatke s BD CellQuest Pro. pregled}

Apoptoza analiza pregled

TR-AGS-CDH17_KD stabilne stanice su posađene u ploču od šest na 1,0 × 10 ^{5 stanica /posudica i pomiješa se s 5 ug /ml Tet. 120 sati kasnije, stanice su sakupljene s tripsinom i ispere s prethodno ohlađenim PBS jednom. Stanice su resuspendirane u 500 ul 1 x pufer i 5 ul PI i doda se 5 ul AnnexinV (BD) vezanja. Nakon inkubacije u mraku (sobne temperature) 10 min, obojenih stanica su pregledane uz BD FACS Calibur. Prikupljeni podaci su analizirani s BD CellQuest Pro. Pregled}

Western blot analiza pregled

Stanice su lizirane Ripa buffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoksikolata i 10 mM Hepes (pH 7.4)] koji sadrži koktel inhibitora proteaze (Roche Molecular Biochemicals). Koncentracije proteina se kvantificira se koristeći postupak bicinkroniničnoj kiselini (BCA) (Pierce). Trideset mikrograma proteina po uzorku se prokuha u puferu za punjenje te se elektroforezi u 8-12% gradijent SDS poliakrilamidnim gelovima (Invitrogen) i prenosi na nitroceluloznim membranama. Membrane su sondirani s antitijelima (CDH17, Integrin β1, integrin β4 integrin β5, p-p53, p53, p21, od R & D, Raf, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK su iz stanične signalizacije i K-Ras je od Santa Cruz), i nakon čega slijedi peroksidazom konjugirani imunoglobulina. Western hibridizacija su vizualizirani s poboljšanom chemiluminescence (ECL) kit (GE, Healthcare) pregled

antitijela polja Test pregled

Tri vrste nizova antitijela dobivena od R &. D Systems, Inc za antitijela nizovi test. Ljudski fosfo-kinazu Array Kit (Mačka. Br ARY003) sadrži 43 različitih kinaze. Ljudski topljivog receptora Array Kit nehematopoetskih Panel (Mačka. Br ARY012) sadrži 119 različitih topive receptore. Ljudski Apoptoza Array Kit (Mačka. Br ARY009) sadrži 35 različitih apoptoze antitijela. Više iscrpne informacije o tim polja može se naći u vezu R &D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabilne stanice su sakupljene nakon 120 sata tretirane sa i bez Tet (5 ug /ml), a proteini su lizirane pufera za lizu s inhibitorima proteaze, stanične ekstrakte razrijedi i inkubira sa tri vrste polja antitijela preko noći , Nizovi isperu da se ukloni nevezani proteini, nakon čega slijedi inkubacija sa koktelom biotiniliranim antitijelima detekcije. Svi postupci su u skladu s uputama u kompletu. Blotovi su analizirani densitometrijom, a ekspresija proteina je bila normalizirana na pozitivna kontrola koja je predstavljen u svakom membrani. Pregled

Mjerenje in vivo pregled

TR-MGC803-CDH17_Over stanice (1 × 10 ^{7 stanica u 0,2 ml PBS) se injektira u lijevom pazuhu od 5~6 tjedna BALB /c nu /nu bez timusa ženka miša (Sino-britanski SIPPR /BK Lab. životinja doo, Kina). volumen tumora (mm 3) mjerena je s čeljustima i računa se kao (W 2 × L) /2, gdje je W je širina i L je duljina. Kad se volumen tumora dosegao -100 mm 3, miševi su nasumično podijeljeni u dvije skupine (9 miševa u svakoj skupini). Tetracylcine indukcije (Invitrogen, 0,2 mg /ml, koji se dobiva u steriliziranom vodom za piće koji sadrži 2.5% saharoze) se inicijalizira na grupiranje dan. Sterilizirana voda za piće koji sadrži 2.5% saharoze bila dovedena u miševa u ne-induced grupe. Volumeni tumora su zabilježeni svaka 3 dana sve životinje su žrtvovane. Nakon 35 dana indukcijom, tumorskih tkiva se skupe i podvrgnuti Western blot analizu za relativne ekspresije proteina. Pregled}

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao prosjek ± s.d. i statistički podvrgnuti Studentov t-test. Razina P < 0,05 smatra značajnom pregled

Rezultati

Izražavanje profil CDH17 u rak želuca Netlogu

kategoriziran Razina izraz CDH17 proteina u 30 staničnim linijama. u 4 skupine na temelju podataka iz analize optičke gustoće od beta-aktin. AGS stanična linija je korišten kao interni standard za izbjegavanje raskorak između gelova. Više od 66% GC staničnih linija (20/30) su CDH17 pozitivni (Slika 1A). Pregled

Ekspresija i lokalizacija CDH17 u osnovnoj dijelu parafinskom tkivo je otkriven imunohistokemijski na tkiva niza. U usporedbi s kontrolnim stakalaca obojenih od normalne IgG CDH17 mAb obojenje pokazao bistrog stanične membrane lokalizacije (Slika 1B). Među 216 predmeta s potvrđenom izvještaju patologije dijagnoze, 73,6% kancerogenih tkiva (159/216) gajio pozitivne CDH17 mrlja s bodovanje od + do +++, dok je 37% pozitivnih CDH17 mrlja u pojedinim susjednim normalnim tkivima (Tablica 1). U CDH17 pozitivnih slučajeva, razina ekspresije CDH17 ima pozitivnu korelaciju s limfnih čvorova metastaze. Međutim, razina ekspresije obrnuto povezana s želučane stijenke invazije, tumorskog udaljenim metastazama, i tumor TNM stadija. Naše opažanje je u skladu s prethodnim kliničkim izvješćima [20] - [22]. Među CDH17 pozitivnim slučajevima kancerogen tkiva izlagao jači bojenje CDH17 (32,1% kao bodovni + 25,2% što je bodovanje ++ i 42,8% što je bodovanje +++) nego da susjedna normalna tkiva (62,5% kao bodovanje +, 21,3% kao postigavši ​​++ i 16,3% što je bodovanje +++). Iako postoji značajna povezanost između skupina mrlja bodovanja i kliničke faze. Uzevši sve to dokazuje zajedno, CDH17 može biti dijagnostički marker za ranom stadiju karcinoma želuca u kineskim stanovništvom. Pregled

RNAi posredovane srušiti CDH17 na GC staničnim linijama pokazuje supresiju stanične proliferacije i formiranja kolonija in vitro pregled

na temelju rezultata CDH17 ekspresije profil na panelu GC stanične linije (Slika 1A), AGS (veća CDH17), BGC-823 (donji CDH17) i HGC-27 (nema CDH17) stanične linije su odabrane za daljnje in vitro staničnoj funkcionalnoj procjeni s RNAi posredovanog CDH17 ušutkavanja. Western blot je pokazala da AGS stanice imaju visoku razinu CDH17 proteina i izraz CDH17 srušen gotovo potpuno od siCDH17. BGC823 stanice imaju nisku razinu CDH17 proteina i HGC-27 nije imao CDH17 proteina (slika 2a). U usporedbi s kontrolnim otimati stanica, CDH17 rušeći imala mali učinak na proliferativna sposobnosti BGC823 i HGC27 stanica, dok je imao značajan učinak na AGS (za 60% na 72 sata, slika 2b). Soft agar analiza je pokazala da je sposobnost da se formira kolonije je spriječeno u AGS stanicama ako CDH17 bio srušiti (za 66% na 14 d), ali u BGC823 stanicama i HGC27 stanica, CDH17 rušeći imao malo utjecaja na sposobnost formiranja kolonija (Slika 2C). Nije bilo razlika između očita BGC823 stanica (niske razine CDH17) i HGC-27cells (bez CDH17) u inhibiciji proliferacije i formiranja kolonija inducirane siRNA CDH17 obaranje. Pregled

Stabilne stanične linije koje nose TR inducibilne obaranje CDH17 u AGS stanice i prekomjernom ekspresijom CDH17 u MGC-803 stanica pregled

ciljni slijed u exon13 (90-2) dobivena iznad smanjenje od 90% u razini mRNA (slika 3A). Onda smo se pLenti4 /do /V5-Mirna-90-2 CDH17 lentivirus za prijenose TR-AGS stabilne stanice i dobio stabilan Tet reguliraju ekspresiju shRNA stanica CDH17 gena (TR-AGS-CDH17_KD) koji je smanjio razinu CDH17 proteina oko 90% nakon inducirana sa 5 ug /ml Tet (Slika 3B). PLenti6.3 /TO /V5-CDH17-TRES-EGFP lentivirus korištena je za prijenose TR-MGC-803 stabilne stanice i odabrati s blasticidin dobiti stabilnu Tet reguliraju ekspresiju gena stanice CDH17 (TR-MGC-803-CDH17_Over) , Hiperekspresija CDH17 u ta stabilna stanična potvrđena na razini proteina pomoću Western blot (Slika 4A). Pregled

obaranje inducirane inhibicije CDH17 stanične proliferacije, migracije, adhezije formiranja kolonija i indukciju staničnog ciklusa zastoja i apoptoza pregled

TR-AGS stanice (kontrolne stanice) i TR-AGS-CDH17_KD stanica korišteni su za utvrđivanje potencijalne stanične funkcionalne učinke shRNA posredovanog CDH17 obaranje na AGS stanicama. TR-AGS-CDH17_KD stanica pomiješa s 5 ug /ml Tet reducirane proliferacije stanica (od 75,8% pri 5 dana), migracija stanica sposobnost (do 68,1%, na 16 sati), stanične adhezije sposobnosti (od 46,8% u 30 minuta ) i koloniziranja sposobnosti (prema 92,7% u 7 dana) u odnosu na Tet besplatno (Slika 3C). U proliferacije spašavanja studiji CDH17 obaranje u TR-AGS-CDH17_KD stanica izazvanih Tet mogu se spasiti uklanjanjem Tet. Nakon uklanjanja Tet na dan 4, ponovno izraz CDH17 zabilježena je na dan 8. i 10. kulture u CDH17 shRNA obaranje AGS stanica. Ponovno iskazivanje CDH17 mogao spasiti proliferacije sposobnost TR-AGS-CDH17_KD stanica (Slika 3D). U odnosu na slobodne Tet TR-AGS-CDH17_KD stanicama Tet na stanicama pokazali su značajno povećanje postotka stanica u G0 /G1 i G2 /M fazi i dramatično pokojnika postotak stanica u S fazi (slika 3e). U međuvremenu, mi također primijetio da je broj apoptotičnih stanica (za 52,2% na 5 dana) povećan je za down-regulacije CDH17 u TR-AGS-CDH17_KD stanica (Slika 3f). Ne postoji značajna razlika pronađena u TR-AGS stabilne stanične linije sa ili bez Tet inkubacije. Pregled

Prekomjerna ekspresija CDH17 promovira rast tumorskih ksenografta na miševe

TR-MGC-803-CDH17_Over stanica injicirane su supkutano u bokovima BALB /c bezdlakih miševa kako bi se dobilo čvrsti tumor. Ekspresija CDH17 bila pod kontrolom Tet u vodi za piće. Rezultati su pokazali da je nakon 35 dana indukcijom Tet inducirane skupinu (volumen tumora = 1849,08 ± 423.46m3) pokazalo je 2,27 puta veću stopu rasta napredak u odnosu Tet bez grupe (volumen tumora = 814.04 ± 234.69m3) (p < 0.05) ( slika 4B), i inducirane CDH17 ekspresija u tumorskim tkivima može biti analizirani western blot analizom (slika 4C). To pokazuje da CDH17 igra važnu ulogu u procesu karcinogeneze raka želuca. Također smo koristili TR-AGS-CDH17_KD stanice promatrati je li odsutnost CDK17 može utjecati na torn smjeru u miševa. Nažalost, tumor uzeti stopu ove stanične linije bila je vrlo niska i pouzdana in vivo rezultata uočena su TR-AGS-CDH17_KD stanične linije. Pregled

Određivanje povezanih razina proteina nakon obaranje CDH17 antitijelo polja testu

Prema tumorskih stanica (inhibicija proliferacije stanica, stvaranje kolonija, i rast tumora in vivo) i metastatskih efekata (inhibicija stanične migracije i adhezije) u CDH17 obaranje, biramo tri polja antitijela (od R &D Systems ) za testiranje relativne promjene proteina i nadam se pronaći moćan CDH17 regulirana vezane proteine. U apoptoznu polje, fosfo-p53 (S15, S46 i S392) i p21 /CIP1 ekspresija /CDNK1A povećava oko dva puta, nakon 5 ug /ml Tet tretman u trajanju od 5 dana, u usporedbi s netretiranim stanicama (Slika 5A (a) i 5B). U fosfo-kinaze polja, fosfo-p53 (S15, S46 i S392) ekspresija također raste nakon Tet liječenja i, u isto vrijeme, ekspresiju fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) smanjena (slika 5A (b) i 5B). U nizu topljivog receptora, obaranje CDH17 u AGS stanica značajno može smanjiti ekspresiju integrin β1, β4, β5, a neće imati učinka na ekspresiju EGFR (slika 5A (c) i 5B). Izmjenu omjera između zainteresiranih proteina između Tet-na i Tet-free AGS stanice sažeti su na slici 5b. Pregled

obaranje CDH17 u AGS regulirani p-integrina i Ras /Raf /MEK /ERK signalnog puta

proteinske mijenja iz polja antitijela testa su potvrđene Western blot analize. Rezultati su pokazali značajno smanjenje integrin β1, β4, β5 i fosfo-ERK u CDH17 obaranje AGS stanica, ali ne i značajnu promjenu u ukupnom ERK (Slika 5c). Onda smo ocijenili uključenost drugih Ras /Raf /MEK /ERK signalnog puta komponenti. Obaranje CDH17 rezultiralo down-regulacije Raf, fosfo-MEK, i fosfo-ERK proteina (Slika 5c). Od TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo studije, gledali smo prekomjerna ekspresija CDH17 pojačan integrina β1, β4, β5 izraz i ERK aktivacije (Slika 4c) i to je u skladu s navedenim nalazima. Da bi istražili da li je učinak CDH17 na integrina ili Ras proteina je direktna interakcija ili ne, ko-Imunoprecipitacija CDH17 s integrin β1, integrin β4 integrin β5 integrin a2, i Ras je provedeno u rak želuca AGS stanica, respektivno. Od očekivanja, za razliku od Bartolome rezultatu [11], ne postoji izravna povezanost između CDH17 i bilo kojeg od tih integrina ili Ras proteina (podaci nisu prikazani). Pregled

Rasprava pregled

To je veliki izazov za kliničara i osnovnih znanstvenika kako bi se utvrdilo molekularne markere povezane s napredovanjem i prognozi raka povezanih. U jetri i želučani karcinoma, vjeruje se da visoka ekspresija CDH17 je povezana s lošim preživljavanje, recidiva tumora, invaziju tumora, metastazama i napredne tumora faze [23] - [25]. U trenutnoj studiji, među 30 panela GC staničnim linijama, više od 66% naših ispitanih staničnih linija (20/30) su CDH17 pozitivno, a gotovo polovica od tih staničnih linija ima veću CDH17 izraz. U našem izvještaju patologije dijagnoze, 73,6% kineskog GC kancerogen tkiva (159/216) gajio pozitivne CDH17 mrlju. U CDH17 pozitivnih slučajeva, razina ekspresije CDH17 ima pozitivnu korelaciju s limfnih čvorova metastaze. Međutim, razina ekspresije obrnuto povezana želučanu stijenku invaziju tumorskih udaljenim metastazama, i tumor TNM stadija. Naše opažanje je u skladu s prethodnim kliničkim izvješćima [20] - [22]. Uzevši sve to dokazuje zajedno, CDH17 može biti dijagnostički marker za ranom stadiju rakom želuca u kineskim stanovništvom.

Kako prepoznati učinak CDH17 u želučanom tumorigensis raka i metastatskim potencijalom, i oligo siRNA i TR indukcijske pLentiviral vektori s specifični Mirna (exton13) protiv CDH17 korišteni su za knock-down CDH17 izražavanja u želučanom staničnim linijama karcinoma. CDH17 prigušenje pomoću oligo siRNA mogu inhibirati proliferaciju stanica i nastanak kolonija u GC stanicama s visokom ekspresijom CDH17. Inhibitorni učinak je bio dramatičan na AGS koji ima višu CDH17 izraz, ali ne i na BGC823 i HGC27 stanica koje imaju vrlo nizak ili nikakav izraz CDH17 proteina (slika 2). To pokazuje da je CDH17 ekspresija može pridonijeti širenju stanica raka i formiranja kolonija sposobnosti u AGS stanicama. Nadalje, slični rezultati su također promatrane u Tet inducirane shRNA posredovanog CDH17 obaranje na AGS stanicama, što je rezultiralo inhibiciju stanične proliferacije, migracije, adhezije formiranja kolonija i indukciju apoptoze i staničnog ciklusa in vitro. Ponovno iskazivanje CDH17 mogao spasiti proliferacije sposobnost TR-AGS-CDH17_KD stanica (Slika 3). Osim toga, Tet inducirane ekspresijom CDH17 u TR-MGC803-CDH17_Over stanica može potaknuti rast tumorskih ksenograftova in vivo (Slika 4). Uzevši sve to dokazuje zajedno, možemo zaključiti da postoji značajna korelacija između CDH17 izražavanja i tumorskih i metastatskih sposobnosti želučanog karcinoma, a CDH17 može poslužiti kao potencijalni terapijski cilj za buduća istraživanja. Pregled

Iako je prethodnih nekoliko studije su izvijestili činjenicu da odsutnost CDH17 može inhibiraju staničnu proliferaciju u GC stanicama, signalna mehanizam CDH17 ostaje nejasan. Ona je pokazala da CDH17 posredovana onkogeni signalizacija u HCC je u svezi s Wnt signalnog puta [5]. Međutim, nije bilo neke razlike između naših rezultata, a rezultati su prijavili Liu u HCC. Naši rezultati su pokazali nikakve promjene u fosforilirani oblik glikogen sintaze kinaze 3β (GSK-3β i zadržavanje beta-katenina u jezgri nakon utišavanje CDH17 (podaci nisu prikazani). Ova razlika se može objasniti korištenje različitog tipa i stanica raka

• PLoS ONE: mikrornk 135A potiskuje limfnog čvora Metastaza putem dolje reguliranje ROCK1 u ranom raka želuca
• PLoS ONE: Klinički ishodi za rak želuca slijedeće pomoćno sredstvo Chemoradiation Koristeći Intenzitet modulirani u odnosu na trodimenzionalne konformni radioterapiju