PLoS One: Sonic Hedgehog útvonal létfontosságú karbantartása Cancer Stem-szerű sejtek emberi gyomorban Cancer

absztrakt katalógusa

abnormális aktivációja a Sonic hedgehog (SHH) útvonal leírták sokféle emberi rákbetegségben és a rákos őssejtek (CSC), azonban a szerepe a SHH útvonal gyomor- CSC még nem számoltak be. Ebben a vizsgálatban vizsgáltuk a lehetőségét, hogy az abnormális aktivációja a SHH útvonal fenntartotta a jellemzői a gyomor CSC. Először is, azonosított rák őssejt-szerű sejtek (CSLCs) a humán gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27, MGC-803 és MKN-45) segítségével tumorsphere kultúra. Összehasonlítva tapadt sejteket, az úszó tumorsphere sejtek több volt önmegújító kapacitásának és kemorezisztenciájának. A sejteket expresszáló CSC markereket (CD44, CD24 és CD133) is szignifikánsan jobban tumorsphere sejtekben, mint a tapadó sejteket. Ennél is fontosabb, in vivo xenograft vizsgálatok azt mutatták, hogy a daganatok lehetne generált 2 × 10 ^{4 tumorsphere sejtekben volt, ami 100-szor kisebb, mint a szükséges tumorok vetés által adherens sejtek. Ezután RT-PCR és Western blot azt mutatja, hogy az expressziós szintek a PTCH és Gli1 (SHH reakcióút célgének) szignifikánsan magasabbak voltak a tumorsphere sejtekben, mint a tapadó sejteket. Az eredmények a kvantitatív valós idejű PCR-hasonlóak voltak az RT-PCR és Western-blottal. További elemzés kimutatta, hogy a SHH útvonal blokkolta ciklopaminra vagy 5E1 okozott nagyobb mértékben csökkent a önmegújító képességét HGC-27 tumorsphere sejtek, mint a letapadt sejteket. Azt is tapasztaltuk, hogy SHH útvonal blokkoló erősen fokozott hatékonyságát kemoterápiás gyógyszerek HGC-27 tumorsphere sejtek in vitro és in vivo, de nem volt jelentős hatása a tapadó sejteket. Végül is izoláltuk tumorspheres származó gyomorrák mintában, ezek a sejtek is volt kemorezisztenciájának és daganatkeltő kapacitás és SHH út fenn a gyomor CSLCs jellemzőit tumorsphere sejtek primer tumor mintákban. Összefoglalva, az adatok alapján a SHH út nélkülözhetetlen volt karbantartása CSLCs humán gyomorrák. Katalógusa}

Citation: Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L. et al. (2011) Sonic Hedgehog útvonal létfontosságú karbantartása Cancer Stem-szerű sejtek az emberi gyomorrákban. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687 katalógusa

Szerkesztő: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: november 27, 2010; Elfogadva: február 10, 2011; Megjelent: március 4, 2011 katalógusa

Copyright: © 2011 Song et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a National High Technology Kutatási és Fejlesztési Program of China (È6AA402A04,È6AA02A107), a nagy állami Basic Research Program of China (È9CB521704), valamint a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (Ĵ72468Ĵ73031). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

CSC fontos szerepet játszanak a rák kialakulásában, ez szubpopuláció belül tumor rendelkezik a jellemzői a önmegújító kapacitásának kemorezisztenciájának és daganatkeltő kapacitás így is döntő szerepet játszanak az eljárás megindításáról, progresszió és a kiújulás a rák. Vizsgálata és manipulálni a biokémiai utak részt ezeket a jellemzőket az egyik legjobb módja, hogy hozzájáruljon a CSC, ami a fejlődését az új gyógyszerek és kezelési eljárások. SHH útvonal kritikus szerepet játszik számos CSC, például glioblasztóma őssejtek [1], [2], a CD34 + leukémiás sejteket [3], [4] és a mell CSC [5], továbbá, nagyon fontos, hogy a fejlődés és a homeosztázisa gyomor mirigy [6], rendellenes aktiválása a SHH útvonal vezethet gyomorrák [7], [8], azonban a szerepe a SHH útvonal gyomor CSC nem világos.

SHH útvonal emlős sejtek által közvetített ligandumok Shh [9]. Hiányában Shh, a transzmembrán receptor folt (PTCH) gátolja a másik transzmembrán fehérje, simítani (SMO), ami a inaktiválása SHH útvonal [9], [10]. Kötődése Shh hogy PTCH megszünteti a gátló hatását PTCH, és SMO derepresszált, ezáltal aktiváló transzkripciós faktor Gli (Gli1, Gli2 és Gli3) [9], [10]. Gli1 erős pozitív aktivátor a downstream célgének és önmagában is egy transzkripciós célt SHH útvonal [11]. Ezért Gli1 tartják markere SHH útvonal rendellenes aktiválása [10], [12].

Nemrégiben több típusú CSC vagy CSLCs azonosították és izolálták malignus tumorok [13] - [25]. A gyomorrák, módszertanilag, nehéz izolálni és amplifikálására CSC sejtvonalakból vagy a tumor szövetmintákban. Jelenleg, a CD44 úgy tűnik, hogy a legtöbb hasznos markere leendő tisztítására gyomor CSC, azonban ez nem erősen specifikus a gyomor CSC [26].

Ebben a tanulmányban izoláltunk CSLCs emberi gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27, MGC-803 és MKN-45) segítségével tumorsphere tenyésztés szérummentes tápközegben, és meghatározta a önmegújító kapacitásának kemorezisztencia és daganatkeltő kapacitása tumorsphere sejtek; Ezután megvizsgáltuk expresszióját SHH útvonal-rokon molekulák, beleértve a Shh, PTCH, SMO, Gli1 és Gli2 a tumorsphere sejtek és tapadó sejtek, különösen a kifejezés a PTCH és Gli1.Then, mi blokkolt SHH reakcióút által ciklopamin vagy ellenőrzés tomatidine, 5E1 vagy kontroll PBS annak vizsgálatára, hogy a jellemzői CSLCs a tumorsphere sejteket a rendellenes aktiválása SHH út. Végül hasznosított elsődleges gyomorrák minták elemzésére funkcionális szempontból a SHH útvonal gyomor CSLCs. Katalógusa

ciklopamin sejt áteresztő szteroid alkaloid. Ez megzavarja a koleszterin bio-szintézis és specifikusan antagonizálja SHH jelátviteli közvetlen kölcsönhatás SMO (smoothened), egy távoli rokon G-protein-kapcsolt receptorok. Ez egy értékes eszköz a tanulás bevonása SHH jelátvitel a fejlesztés különböző daganatok. Tomatidine egy szteroid alkaloid, amely szerkezetileg hasonlít a ciklopamin, de hiányzik a képessége, hogy gátolják a SHH jelátvitelt. Ezt fel lehet használni, mint egy negatív kontrollként. 5E1 egy anti-Hh monoklonális antitest, amely semlegesíti az SHH és IHH aktivitást.

Eredmények

1. Tumorsphere sejtek rendelkeztek a jellemzői CSLCs

Mi nőtt HGC-27, MGC-803 és MKN-45 tapadó sejteket szérummentes tápközegben leírt módszerek részben. 7 nap után tumorspheres amely körülbelül 50-100 sejtet figyeltünk meg (1A.).

A önmegújító kapacitásának ezek tumorspheres értékelték disszociáló azokat egyetlen sejt, és növekszik a klonális sűrűsége 1,000 sejt per milliliter. 2 hét után, egyetlen sejtből származó HGC-27 tumorsphere sejtek generált al-tumorspheres at 41,83% ± 3,13%, szemben a 8,17% ± 2,40% adherens sejtek, ezen túlmenően, a MGC-803 és MKN-45, az al-tumorspheres képződés aránya tumorsphere sejtek is magasabb, mint a kitapadó sejteket. (Ábra. 1B). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az önmegújító kapacitásának tumorsphere sejtek szignifikánsan nagyobb volt, mint az adherens sejtek. Tumorsphere sejtek is kimutatta, megnövekedett képessége kolóniákat formálni alatt rögzítéstől független körülmények egy standard lágy agar vizsgálati 14 nap után HGC-27 és MKN-45 (ábra. 1C).

Mi is végeztünk határhígításos assay szferoidok képződés felhasználásával HGC-27 tumorsphere sejteket és az adherens sejtek, ill. Táblázatban látható S1, körülbelül 27-35% -a tumorsphere sejtek termelnek szferoidok, míg kevesebb mint 5% az adherens sejtek generálni szferoidok 3 hét után a kultúra. Ezért a HGC-27 tumorsphere sejtek, tudtuk megbecsülni, hogy a szferoidok-képző sejtek populáció tartalmazott egy legfeljebb 35%.

kemorezisztencia egy másik jellemzője CSC, így azt vizsgáltuk, hogy az eltérő kemorezisztencia között létezett tumorsphere sejteket és az adherens sejteket. Az eredmények azt mutatták, hogy 48 óra elteltével tumorsphere sejtek szignifikánsan nagyobb gyógyszerekkel szembeni képest kitapadó sejteket azonos körülmények között (ábra. 1D). Azt is értékelni kemorezisztencia a HGC-27 tumorsphere sejteket és az adherens sejteket különböző koncentrációjú gyógyszerek, azonban mindkét tumorsphere sejteket és az adherens sejtek nem mutattak szignifikáns kemorezisztencia hogy gyógyszerek dózis-függő módon (ábra. S1).

Ezután megvizsgáltuk a kifejezés a CD44 disszociált tumorsphere sejtek és adherens sejteket használva immunfluoreszcens assay és Western-blottal. Az eredmények azt mutatták, hogy a kifejező sejtek CD44 szignifikánsan többet tumorsphere sejtekben, mint a kitapadó sejtek (2A.). Ezen túlmenően, a kifejezés más CSC markerek (CD24 és CD133) A tumorsphere sejteket és az adherens sejteken vizsgáltuk Western-blot, míg tumorsphere sejtek, a kifejezés a CD24 szignifikánsan alacsonyabb volt a tapadó sejteket, míg a kifejezés a CD133 hasonló volt (ábra . 2b). Továbbá, mi frakcionáltuk HGC-27 sejt FACS-válogatással a CD44, azt találtuk, hogy a CD44 (+) sejtfrakciót generálhat több szferoid telepeket összehasonlítva a CD44 (-) sejtfrakciót, sőt, a méret a szferoid telepeket CD44 (+) sejtek nagyobb volt, mint az ettől CD44 (-) sejtek (ábra. 2C). katalógusa

2. Tumorsphere sejtek termelnek a daganatok után xenotranszplantációval katalógusa

xenograft tanulmányok, azonos számú (2 × 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) frissen disszociált tumorsphere sejtek vagy kontroll letapadt sejtek sc minden egyes egér (6 egér csoportonként). Az eredmények azt mutatták, hogy a daganatok generáltunk 2 × 10 4 tumorsphere sejtekben volt, ami 100-szor kisebb, mint a szükséges tumor vetés által tapadó sejteket (1. táblázat). Sőt, tumorsphere sejtek generált szubkután tumorok nagyobb térfogatú és rövidebb idő, mint azoknál generált adherens sejtek (ábra. 3a, b). Így szubkután injekció alacsony száma tumorsphere sejtek megerősítette, hogy a szferoid sejtek visszatartott erősebb tumorkeltő kapacitás nude egerekben, mint a tapadó sejteket.}

H &E vizsgálatát xenograftok származó HGC-27 tumorsphere sejtek azt mutatta, hogy ezek a daganatok szorosan hasonlított az eredeti humán tumor, amely főként differenciálódott sejtek (3C.). Fontos, tumorspheres újra lehet származó xenotransplanted tumorok (ábra. 3D), és ezek képezhetnék tumor újra (ábra. 3E). Ezek az adatok tehát azt mutatja, hogy a tumorsphere sejtek képviselik CSLCs hogy már tumorigenikus kapacitás. Katalógusa

3. SHH út magasabb volt kifejezett tumorsphere sejtekben, mint a letapadt sejteket katalógusa

Annak vizsgálatára közötti kapcsolat SHH útvonal és CSLCs jellemzőit tumorsphere sejtek, először megvizsgálta a mRNS expresszióját SHH útvonal-rokon molekulák, köztük Csitt, PTCH, SMO Gli1 és Gli2 RT-PCR-rel. Az eredmények azt mutatták, hogy mind a mRNS-ek kerültek magas kifejezve HGC-27 tumorsphere sejteket. Összehasonlítva tumorsphere sejtekben az expressziós szintek Shh, PTCH, SMO és Gli1 szignifikánsan alacsonyabbak voltak tapadó sejteket, míg az expressziós szintjei Gli2 hasonlóak voltak tumorsphere sejteket. Az MGC-803 és MKN-45, az expressziós szintek Shh, PTCH és Gli1 is szignifikánsan alacsonyabb adherens sejteket, mint a tumorsphere sejtekben, míg az expressziós szintek SMO és Gli2 nem volt jelentős különbség a kitapadó sejtek és tumorsphere sejtek (ábra . 4A). katalógusa

a SHH útvonal, PTCH és Gli1 célpontjául gének, ők tartják fontosnak markerei SHH útvonal rendellenes aktiválódása. Tehát tovább vizsgálták az expressziós szintjét PTCH és Gli1 Western blot és kvantitatív, valós idejű PCR-rel.

Amikor a Western blot, azt találtuk, hogy az expresszió szintjeit PTCH és Gli1 is magasabbak voltak a tumorsphere sejtekben, mint a tapadó sejteket (ábra. 4B). Mi a következő értékelte expressziós szintjét PTCH és Gli1 a xenograftokkal származó HGC-27 kvantitatív valós idejű PCR-rel. Kvantitatív valós idejű PCR-elemzéseket SHH célgének (PTCH és GLI1) azt mutatta, ugyanazt az eredményt a fent félkvantitatív RT-PCR-rel (ábra. 4C).

4. SHH útvonal blokkoló csökkentette az önmegújító képességét és kemorezisztenciájának a HGC-27 tumorsphere sejtek katalógusa

A teszt egy lehetséges szerepét SHH útvonal önmegújító képességét tumorsphere sejtek szoktuk ciklopaminra vagy ellenőrzési tomatidine, 5E1 vagy kontroll PBS, hogy blokkolja az utat.

az eredmények azt mutatták, hogy a ciklopamin kezelés vezetett jelentősen csökkenését kapacitás kialakulását szub-tumorspheres in HGC-27 tumorsphere sejtek dózisfüggő módon, de nincs ilyen hatása volt megfigyelhető adherens sejtek (ábra. 5A). Vizsgáltuk továbbá, hogy a kezelés ciklopaminnal hatással lenne a telepek kialakulása kapacitása HGC-27 tumorsphere sejtek rögzítési -függetien növekedési vizsgálat. Hasonlóképpen, a kapacitás kolóniákat formálni csökkent inkább a tumorsphere sejtek dózisfüggő módon képest a letapadt sejteket (ábra. 5B).

Ezután megvizsgáltuk a hatását SHH útvonal a kemorezisztencia a HGC -27 tumorsphere sejteket kezeltünk a disszociált sejteket, a ciklopaminnal vagy ellenőrzési tomatidine 48 órán át, majd a gyógyszer-rezisztencia az tumorsphere sejtek értékeltük. Amikor ciklopamin követte gyógyszerek, a kezelés eredményezett jelentősen továbbfejlesztett általános sejthalál arány. A legjobb eredményeket akkor kaptuk, amikor a ciklopamin kombináltuk oxaliplatin és mitomycin (ábra. 5C). Nincs ilyen szinergetikus hatást figyeltünk meg tapadó sejtek expozíció után drogok, a ciklopaminnal 48 órán át (ábra. 5D).

Azt is megvizsgáltuk a hatását különböző koncentrációjú ciklopamin (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) a sejthalál. Az eredmények azt mutatták, hogy a ciklopamin egyedül tumorsphere sejteket lehet, hogy egy kis, de konzisztens csökkenés az életképes sejtek számát. Összehasonlítva HGC-27 tumorsphere sejtek hatására ciklopaminra a sejthalál, hogy letapadt sejteket volt jelentősége (ábra. 5C, D). Katalógusa

Amikor SHH út által blokkolt 5E1 vagy ellenőrzik PBS, az eredmények önálló -renewing kapacitás és kemorezisztencia a tumorsphere sejtek és tapadó sejteket hasonló blokkolta ciklopamin vagy ellenőrzés tomatidine (ábra. S2).

5. SHH útvonal blokkolása fokozott tumor válasz gyógyszerek in vivo katalógusa

Ezen hipotézis in vivo elemeztük e SHH útvonal blokkolása fokozott kemoterápia hatékonyságát, ciklopaminra vagy ellenőrző tomatidine használták, hogy gátolja SHH útvonal válaszokat. HGC-27 tumorsphere sejteket hagytuk nőni mindkét hátsó oldalában a csupasz egerek, amíg a nagyobb átmérőjű tumor elérte a körülbelül 2 mm. Az egereket ezután kétszer egy héten 3 héten a ciklopaminnal vagy vezérlő tomatidine előtt 24 órával oxaliplatin szállítás. Minden kezelt egerekben a tumorok kezelt oxaliplatin lényegesen kisebbek voltak, mint azok, nem kezelt az oxaliplatin. Sőt, tumorok esetében szignifikánsan nagyobb a tumor növekedés gátlás, amikor kezeltük oxaliplatin kombinált ciklopaminnal, a tumor válasz kemoterápiás gyógyszer fokoztuk ciklopamin (ábra. 6A, B). Azt is vizsgáltuk, hogy SHH reakcióút blokkolta 5E1 vagy ellenőrzik PBS fokozott kemoterápia hatásosságának in vivo, az eredmények azt mutatták, hogy 10 ug /ml 5E1 kezelés vezetett szignifikánsan nagyobb tumor növekedés gátlás, mint azok, csak kezelt oxaliplatin (ábra. 6A, B).

Ezek az adatok arra utalnak, hogy bár a szokásos kemoterápiás hatóanyag késleltetett daganat kinövése a kezelés során, amikor egyesítjük a ciklopaminnal vagy 5E1, a kemoterápia hatékonyságát jelentősen továbbfejlesztett és tartósabb kezelés megszakítását követően.

Ezután annak vizsgálata, hogy blokkolja SHH útvonal in vivo fajlagos hatása HGC-27 tumorsphere sejteket. Az egereket csak kezelt ciklopamin a jobb hátsó szárnyon vagy ellenőrző tomatidine a bal hátsó szárny (hetente kétszer 3 héten át), amikor a tumorok származó HGC-27 tumorsphere sejtek elérték a körülbelül 2 mm-es, 3 hét után, végeztünk egy határhígításos assay szferoidok képződés felhasználásával kezelt tumorsejtek cikiopamint és kezelt tomatidine, ill. Táblázatban látható S2, körülbelül 9-15% -a sejtek xenotransplanted tumor kezelt tomatidine lehetne előállítani szferoidok, míg kevesebb mint 2,5% a sejtek xenotransplanted tumor kezelt ciklopaminnal generálhat szferoidok. Ezért blokkoló SHH útvonal in vivo csökkentheti a számát gyomor CSLCs. Katalógusa

6. SHH útvonal fenn a gyomor CSLCs jellemzőit tumorsphere sejtek primer tumor mintákban

Annak megállapításához, hogy SHH útvonal is be lehetne vonni a gyomor CSC jellemzőit tumorsphere sejtek gyomorrák szövet alkalmaztunk, primer gyomorrák minták elemzésére funkcionális szempontból a SHH reakcióút gyomor CSLCs.

Először is, mi nőtt a frissen disszociált ömlesztett sejteket a gyomorrák példányok szérummentes tápközegben leírt, a módszerek részben, 10 nap után, tumorspheres észleltek (ábra. 7A, B). Ezután megvizsgáltuk kemorezisztenciájának és daganatkeltő kapacitása tumorsphere sejtek gyomorrák szövetet. Az eredmények azt mutatták, hogy tumorsphere származó sejtek gyomorrák szöveti szignifikánsan jobban ellenáll a drogok, mint ömlesztett sejteket azonos körülmények között (ábra. 7c). Sőt, frissen disszociált ömlesztett sejtek gyomorrák példányok befecskendezett 2 × 10 ^{7 sejtet egér volt, amely alapján megállapítható a bőr alatti daganatok, míg mindössze 2 × 10 4. tumorsphere sejtek gyomorrák példányokat képezhetnék daganatok (1. táblázat), a xenograftokkal daganatok, amelynek eredményeként a injekciója tumorsphere sejtek bemutatott azonos szövettani jellemzőkkel saját emberi daganat (ábra. 7F). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy tumorsphere sejtek gyomorrák szövet rendelkezett jellemzőit CSLCs. Ezután megfigyeltük a hatását SHH reakcióút blokkolást kemorezisztencia a tumorsphere sejtek in vitro és a tumor válasz gyógyszerek in vivo. Az eredmények azt mutatták, hogy a ciklopamin vagy 5E1 tudott eredményezett jelentősen továbbfejlesztett általános sejthalál mértéke (ábra. 7D), és a tumor válasz gyógyszer (ábra. 7e).}

Discussion

CSC sok közös jellemzők szöveti őssejtek, például önmegújító, proliferáció, kemorezisztencia, és elsődlegesen felelősek fenntartása a daganatok növekedését [27], [28]. Sok kutató használt fluoreszcencia-aktivált sejt válogatás azonosítására és izolálására CSC és megállapítottuk, hogy ezek a sejtek képezhetnek gömbök speciális szérummentes tápközegben. Ebben a vizsgálatban vettünk az ellenkező megközelítés kifejlesztésével tumorsphere sejtek, majd meghatározzuk, hogy ezek a sejtek szerzett CSC jellemzőit.

Mi egy meghatározott szérummentes tápközegben, amely az EGF, FGF-2, B-27-kiegészítő és N-2-kiegészítő fenntartani gyomorrák sejtvonalakon. Ezek a feltételek már korábban használt, hogy fenntartsák az endogén neurális őssejtek /progenitor és a tumor őssejtek humán tumorok és tumor sejtvonalak. Például, Kondo et al. [24] jellemezték a C6 patkány tumor sejtvonalból, in vitro és in vivo, és megfigyelhető egy kis populáció őssejt-szerű sejtek származó jól jellemzett oldalán populációban. Setoguchi et al. [29] kimutatták rákos őssejt-szerű sejtek potenciális más rákos sejtvonalak, ideértve a MCF7 emlőrák vonal, B104 neuroblasztóma, és a HeLa-adenocarcinoma.

kísérletünkben, használtuk három gyomor rákos sejtvonalat (HGC- 27, MKN-45 és MGC-803) a kultúra tumorspheres. HGC-27 sejtvonalat hoztunk létre által kultúra a metasztatikus nyirokcsomó egy gyomorrák páciens diagnosztizált szövettani mint differenciálatlan karcinóma. MKN-45-ben alakult a rosszul differenciált adenocarcinoma a gyomor egy 62 éves nő. MGC-803 egy epiteliális rosszul differenciált emberi gyomor muko-adenokarcinóma sejtvonal egy 74 éves férfi. Katalógusa

Két különböző megközelítést tipikusan azonosítására CSC közzétett tanulmány [30], [31] . Az egyik egy in vitro eljárást nevezik "szferoid kolónia képződését,", és a másik az in vivo módszer magában beültetése jelölt CSC bőre alá immunhiányos egerekben.

Az előbbi módszer magában tenyésztjük jelölt CSC tenyészetben ételek speciális bevonatú számára nem sejt kötődés szérum-mentes média tartalmú epidermális növekedési faktor és a bázikus fibroblaszt növekedési faktor. A növekedés a gömb alakú telepek néhány hét után utaló jelnek tekintik önmegújító képessége, és összhangban lenne a CSC fenotípus. Az utóbbi módszer-sejtek növekedését immunhiányos egerekben-szükséges bizonyítani igaz tumorgenézisre és általában tekinthető a gold standard bizonyítva létezését CSC. Számos tanulmány arra utal, hogy e két megközelítés általában ugyanazt az eredményt értékelésekor jelölt CSC sok szolid tumorok. Katalógusa

Jelenleg gyomor CSC nincs fajlagos felülete döntéshozók, így kifejlesztettünk tumorsphere sejteket, majd meghatározni, hogy ezek a sejtek szerzett CSC jellemzők, beleértve önmegújító kapacitásának kemorezisztenciájának és daganatkeltő kapacitását. katalógusa

Eredményeink azt mutatták, hogy a gyomor rákos sejtvonalak (HGC-27, MGC-803, MKN-45) nőtt egy meghatározott szérum- mentes közegben képezhetnék tumorspheres tartalmazó sejtek viselkedik, mint CSLCs. In vitro, tumorsphere sejtek mutattak megnövekedett képessége kolóniákat formálni lágy agarban alatt rögzítéstől független feltételek és fokozott képes formában al-tumorspheres. Azt is kimutatták, hogy az önmegújító képességük, hogy al-tumorspheres a HGC-27 tumorsphere sejteknek növekedése passzázsoknál 2-8 (44,5% és 70,5%), és akkor tartották fenn a viszonylag stabil arányban után 8 vagy több még ha termesztett klonális sűrűség (ábra. S3). Ezek az adatok azt javasolta, hogy a szaporodási potenciálját tumorsphere sejtek után is megmaradt hosszabb részeket. Ezen túlmenően, tumorsphere sejtek in vitro voltak rezisztensek oxaliplatin és a mitomicin képest adherens sejtek, ezek az adatok azt javasolta, hogy tumorsphere sejtek állnak dúsított számú CSLCs, amely potenciálisan tette őket kevésbé érzékenyek az intézkedések a mindkét oxaliplatin és a mitomicin. In vivo, tumorsphere sejtek termelnek a daganatok után xenotranszplantációval nagyobb sebességgel, mint a letapadt sejteket. Sőt, tumorsphere sejtek generált szubkután tumorok nagyobb térfogatú és rövidebb idő, mint azoknál generált adherens sejtek fontos, tumorspheres újra lehet származó xenotransplanted tumorok, és ők is alkotnak tumor újra, ezek az adatok azt javasolta, hogy tumorspheres arra dúsított CSLCs .

a tanulmányban, letapadt sejtek feltehetően tartalmazta a viszonylag alacsony százalékban CSC, mivel nincs mód izolálására vagy eltávolítására ezen sejtek használták. Lehet azzal érvelni, hogy ez a kis populáció CSC, amely felelős a tumor kialakulását. Függetlenül attól, több CSC nyilvánvalóak voltak a tumorsphere sejtekben, ami magyarázatot adhat arra, hogy agresszív viselkedést. Katalógusa

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a jellemzői CSLCs a tumorspheres tartotta fenn kóros aktivációja a SHH út. Először is kimutattuk, hogy az mRNS expressziós szintje SHH útvonal-rokon molekulák (Shh, PTCH és Gli1) szignifikánsan magasabbak voltak tumorsphere sejtekben, mint a tapadó sejteket, míg Gli2 magas volt egyaránt kifejezett sejtekben. Mi tovább vizsgáltuk az expressziós szintek SHH reakcióút célgének (PTCH és Gli1) Western blot és kvantitatív valós idejű PCR-rel, az eredmények hasonlóak voltak az RT-PCR-rel. Másodszor, a gátlása SHH reakcióút aktivitás ciklopamin vagy 5E1 vezetett csökkent önmegújító kapacitásának és a fokozott érzékenység a gyógyszerek a HGC-27 tumorsphere sejtekben, de ezek a hatások nem voltak hangsúlyos adherens sejtek. In vivo, az összes kezelt egerekben a tumorok kezelt oxaliplatin lényegesen kisebbek voltak, mint azok, nem kezelt oxaliplatint, a kezelés után a ciklopaminnal vagy 5E1, a tumor válasz kemoterápiás szerek fokozta. Ezek az adatok arra utalnak, hogy bár a szokásos kemoterápiás hatóanyag késleltetett daganat kinövése a kezelés során, amikor egyesítjük a ciklopaminnal, a kemoterápia hatékonyságát jelentősen továbbfejlesztett és tartósabb kezelés megszakítását követően.

Végül hasznosított elsődleges gyomorrák megvizsgálandó a funkcionális szempontból a SHH útvonal gyomor CSLCs. Az eredmények azt mutatták, hogy a tumorsphere sejtek gyomorrák mintából is volt kemorezisztenciájának és daganatkeltő kapacitás, sőt SHH útvonal blokkoló csökkentette kemorezisztenciájának a tumorsphere sejtek fokozott tumor válasz gyógyszerek in vivo. Katalógusa

Ami kemorezisztenciájának, számos jellemzője CSC is tegyék nehéz megszüntetni. CSC viszonylag nyugalmas, és ez lehetővé teszi számukra, hogy elkerülje a kemoterápiás jellemzően célba aktívan kerékpározás sejteket. Továbbá, ahogy az a normális megfelelője, CSC javasoltak mutatnak magas szintű expresszióját multidrog transzporter családi gének, valószínűleg eredményez hatékonyabb efflux kemoterápiás gyógyszerek és a veleszületett multidrog rezisztencia, továbbá jelátviteli utak, például a Wnt, Hedgehog vagy Notch vannak megbomlik CSC vezető daganat fejlődését. A fejlesztés a hatékony terápiás megközelítés tehát azt követelné azonosítása jellegzetes molekuláris útvonalakat aktív CSC és azonosítása az anyagokat, amelyek képesek akár blokk CSC proliferációs vagy indukálják CSC differenciálás, így javítja az érzékenységet a kemoterápiás gyógyszereket. Tehát fontos tényezők a kemorezisztenciájának a CSC vannak belső tényezők. A mikrokörnyezet, vagy hiánypótló, befolyásolhatja a képességét CSC szaporodni, vándorolnak, vagy támadják. A fülke egy rögzítő helyszínen CSC és adhéziós molekulák vagy a mikrokörnyezet oldódó molekulák, beleértve a növekedési faktorok és citokinek, jelentősen hozzájárulhat a refrakter terápiát. Bár gátlása SHH útvonal által ciklopaminra vagy 5E1 lenne hasznos stratégia, a vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a receptor komponens PTCH és transzkripciós faktor Gli1 is magas kifejezett tumorsphere sejtekben. Tehát PTCH vagy Gli1 alternatívája lehet cél kezelésére gyomorrák. Az egyik lehetséges stratégia az, hogy kis interferáló RNS (siRNS) vagy shRNS specifikus PTCH vagy Gli1, de a gyomor CSLCs a tumorsphere sejtek nem voltak teljesen tisztított, meg kell, hogy tovább tisztítja a gyomor CSLCs, így ez a munka elvégezhető a további tanulmány.

Összefoglalva, azt mutatta, hogy SHH útvonal lehetne vonni az önmegújító, proliferáció, a gyógyszer-rezisztencia és daganatkeltő a tumorsphere sejtek, és azt sugallják, hogy a stratégiák, amelyek célja a gátló SHH utakat jelentenek logikai terápiás megközelítését célozza gyomor CSC. katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

Állat Etikai nyilatkozat katalógusa

Férfi athymikus egereket (nu /nu), 6-8 hetes, kaptuk a pekingi Vital-folyó Lab Animal Technology Co. Ltd (SCXK JING 2007-0001), és tartottuk alatt patogénmentes körülmények a gát állat létesítmény. Az összes egér alatt végeztük jóváhagyott iránymutatások Laboratory Animal Center Akadémia Katonai Orvosi Akadémia (SYXK június 2002-001). Katalógusa

Kultúra összetapadt sejtek, tumorspheres és al-tumorspheres katalógusa

Az emberi gyomorrák sejtvonalak (HGC-27, MGC-803 és MKN-45) nyert Peking Unió Medical College volt tenyésztettük 1640 közegben, amely 10% magzati borjúszérumot (FBS) és szélesztettünk a sűrűsége 1 × 10 ^{6 élő sejtek per 75 cm 2-es. Amikor a sejtek kapcsolódnak, mi passaged fel azokat összefolyásánál. Tumorspheres származnak azáltal, hogy a kitapadó sejteket szérummentes 1640 táptalajban, amely 1% N-2-kiegészítő (Invitrogen), 2% B-27 Supplement (Invitrogen), 1% antibiotikum keverék (Gibco), 20 ng /ml humán FGF -2 (Chemicon) és 100 ng /ml EGF-et (Chemicon) és a megtapadt sejteket 24-lyukú ultra-alacsony rögzítőlemezéhez (Corning) 500 sejt per lyuk. 2 hét múlva a lemezeket elemeztük tumorspheres kialakulása és mennyiségi meghatározását egy invertált mikroszkóp (Olympus), 40 × és 100 × nagyítással.}

Miután elsődleges tumorspheres elérte a mérete körülbelül 200-500 sejt per gömb, a tumorspheres arra disszociált sűrűségben 1000 sejt per milliliter és 100 ul egyetlen sejtszuszpenziót szélesztettünk minden egyes lyukába 24 lyukas ultra-alacsony rögzítőlemezéhez (Corning) szérummentes tápközegben fent leírtak szerint. Minden jól Megvizsgáltuk egyetlen sejtből, és csak a lyukakat tartalmazó egyetlen cellában voltak jelölve. 2 hét múlva, kutak analizáltuk al-tumorspheres képződést. Normál letapadt sejteket használjuk kontrollként a kapacitás alkotnak al-tumorspheres. A teszt a közötti kapcsolat SHH útvonal és a kialakulása al-tumorspheres, kezeltük a disszociált sejteket, a ciklopaminnal (2,5 uM, 5 nm, 10 uM) vagy kontroll tomatidine, 5E1 (10 ug /ml), vagy kontroll PBS és a megfigyelt kialakulását az al-tumorspheres. katalógusa

a gyomorrák szövetmintát katalógusa

az emberi friss, steril gyomorrák szövetmintából kaptuk összhangban etikai intézményi bizottság az emberi kísérletezés 15 beteg (életkor tartomány 70-85 év) alatt a gyomorrák reszekció után tájékozott beleegyezést a beteg (táblázat S3). katalógusa

Ezt a példányok merítettük 95% etanol 2-3 másodpercig a szennyezés elkerülése érdekében, és a mosott foszfát-pufferolt sóoldattal (PBS) és antibiotikumokkal többször, hogy eltávolítsuk a vért. Ezek után, a felszínen a rák szövetmintákban eltávolítottuk, és a belső részek vágtuk 1-3 mm ^{3 nagyságú darabokra. Aztán t emésztünk kollagenáz és diszpáz oldatot 37 ° C hőmérsékleten, 4 óra elteltével inkubálás tartalmazó oldatot emésztett szöveteket centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a kollagenáz oldatban. A sejt pelletet egyszer mossuk 1640 közegben, mielőtt szuszpendáljuk szérummentes 1640 közegben, amely 1% N-2-kiegészítő, 2% B-27-kiegészítés, 1% antibiotikum keverék, 20 ng /ml humán FGF-2, 100 ng /ml EGF és szélesztünk 24 mérőhelyes ultra-alacsony rögzítőlemezéhez. Minden tenyészetet 37 ° C-on inkubátorban mellékelt nedvesített levegő és 5% CO _2.}

rögzítéstől független növekedési vizsgálat

megfigyelésére önmegújító kapacitásának további, lágy agar vizsgálatot használták, hogy meghatározzák a kolóniák képződését tumorsphere sejtek és tapadó sejteket alatt rögzítéstől független körülmények között. Minden üregébe egy hat lyukas lemezt 1 ml 10% FBS-1640 tápközegben, amely 1% agarózt. 20 perc eltelte után az inkubálást 37 ° C-on, egyenlő számban (500) a tumorsphere sejtek vagy adherens sejteket adtunk 1 ml 10% FBS-1640 tápközegben 0,5% -os agaróz. A teszt a közötti kapcsolat SHH-útvonal és a kolóniák képződését alatt rögzítéstől független körülmények, kezeltük a disszociált sejteket, a ciklopaminnal (2,5 uM, 5 um, 10 nM), vagy kontroll tomatidine, 5E1 (10 ug /ml), vagy kontroll PBS-ben.

• PLoS One: Wnt /β-Catenin Jelzés Javítja a ciklooxigenáz-2 (COX2) transzkripciós aktivitást gyomorrákban Cells
• PLoS One: A Computational módszer Előrejelzése Kiválasztásos fehérjék és alkalmazás azonosítása gyomorrák Markers a vizeletben