Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального программы исследований и разработок высоких технологий Китая (È6AA402A04,È6AA02A107), Высшей Государственной программы фундаментальных исследований Китая (È9CB521704), и национальный природный научный фонд Китая (Ĵ72468,Ĵ73031). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> ОКК играют важную роль в развитии рака, эта субпопуляции в пределах опухоли обладает свойствами самовосстановления мощности, химиорезистентности и онкогенного потенциала, таким образом, может играть решающую роль в инициации, прогрессии и рецидива рака. Изучение и манипулирования биохимических путей, участвующих в этих характеристик является одним из лучших способов внести свой вклад в ЦОК, что привело к разработке новых лекарственных средств и лечебных процедур. SHH путь играет важную роль во многих ЦОК, таких как глиобластома стволовые клетки [1], [2], CD34 + лейкозных клеток [3], [4] и грудные ЦОК [5], кроме того, это имеет решающее значение для развития и гомеостаз желудка железы [6], ненормальная активация SHH пути может привести к раку желудка [7], [8], однако, роль SHH пути в желудочном ЦОК не ясно.
SHH путь в клетки млекопитающих опосредуется лигандов Shh [9]. При отсутствии Shh, трансмембранный рецептор заплата (Ptch) ингибирует активность другого трансмембранного белка, сглаженного (SMO), что приводит к инактивации SHH пути [9], [10]. Связывание Shh к Ptch аннулирует угнетающее действие Ptch и СМО активируются, тем самым активируя фактор транскрипции Gli (Gli1, Gli2 и Gli3) [9], [10]. Gli1 сильный положительный активатор вниз по течению генов-мишеней и само по себе является транскрипционный мишенью SHH пути [11]. Поэтому Gli1 считается маркером SHH затрагивающего пути аномальной активации [10], [12]
<р> В последнее время несколько типов ЦОК или CSLCs были выявлены и изолированы от злокачественных опухолей [13] - [25].. При раке желудка, методологически, трудно выделить и усилить CSCs из клеточных линий или образцов тканей опухолей. В настоящее время, CD44, как представляется, наиболее полезным маркером для предполагаемой очистки желудка ОКК, однако, это не является высоко специфическим для желудка ЦОК [26].
<Р> В этом исследовании мы выделили CSLCs из желудка человека линий раковых клеток (ТЖК-27, MGC-803 и MKN-45) с использованием tumorsphere культивирование в среде без сыворотки и определили способность самообновления, химическую устойчивость и онкогенного потенциала tumorsphere клеток; Далее, мы исследовали экспрессию SHH Тропинка связанных молекул, включая Shh, Ptch, СМО, Gli1 и Gli2 в tumorsphere клетках и прилипшие клетки, особенно экспрессия Ptch и Gli1.Then, мы блокировали SHH путь от cyclopamine или управления tomatidine, 5E1 или контролировать PBS, чтобы исследовать, были ли поддерживаться характеристики CSLCs в tumorsphere клетках аномальной активации SHH пути. Наконец, мы использовали первичные образцы рака желудка проанализировать функциональные аспекты SHH пути в желудочном CSLCs.
<Р> Cyclopamine является клетка-проницаемой стероидный алкалоид. Это разрушает холестерина био-синтеза и специфически противодействует SHH сигнальный путь посредством прямого взаимодействия с Smo (сглажены), дальний родственник G-белком рецепторов. Это является ценным инструментом для изучения участия сигнализации SHH в развитии различных опухолей. Tomatidine представляет собой стероидный алкалоид, который структурно напоминает cyclopamine, но ему не хватает способности ингибировать передачу сигналов SHH. Он может быть использован в качестве отрицательного контроля. 5E1 представляет собой моноклональное антитело против Hh, который нейтрализует активность SHH и IHH.
1. Tumorsphere клетки обладают характеристиками CSLCs
<р> Мы выросли ТЖК-27, MGC-803 и MKN-45 адгезивных клеток в бессывороточной среде, описанной в разделе Методы. Через 7 дней, tumorspheres, состоящие из приблизительно от 50 до 100 клеток наблюдалось (рис. 1А).
<Р> Самообновляющийся способность этих tumorspheres оценивали отделяя их в одну ячейку и растет клонального плотности 1000 клеток на миллилитр. Через 2 недели, одна клетка получена из ТЖК-27 tumorsphere клеток, полученных суб-tumorspheres на 41,83% ± 3,13% по сравнению с 8,17% ± 2,40% от прикрепленных клеток, кроме того, в MGC-803 и MKN-45, формирование суб-tumorspheres скорость tumorsphere клеток были также выше, чем у адгезивных клеток. (Рис. 1В). Эти данные свидетельствуют о том, что самообновлению способность tumorsphere клеток была значительно выше, чем у прикрепленных клеток. Tumorsphere клетки также показали повышенную способность образовывать колонии под анкерными независимые условия в стандартном мягком агаре анализе после 14 дней в ТЖК-27 и MKN-45 (рис. 1в).
<Р> Мы также провели предельное разведение анализ формирования сфероидов с использованием ТЖК-27 tumorsphere клетки и прилипшие клетки, соответственно. Как показано в таблице S1, приблизительно 27-35% от tumorsphere клеток может производить сфероидов, в то время как менее 5% от адгезивных клеток может генерировать сфероиды через 3 недели культуры. Таким образом, в клетках tumorsphere ТЖК-27, мы могли бы оценить, что сфероиды клеток, образующих население составляли максимум 35%.
<Р> химиорезистентность еще одна характеристика ЦОК, поэтому мы исследовали, существует ли разница в химиорезистентности между tumorsphere клетки и прилипшие клетки. Результаты показали, что, после того, как 48 часов, tumorsphere клетки продемонстрировали значительно большую устойчивость к лекарствам по сравнению с адгезивными клетками в тех же условиях (рис. 1D). Мы также оценивали химическую устойчивость в ТЖК-27 tumorsphere клеток и адгезивных клеток на различные концентрации лекарственных средств, тем не менее, оба tumorsphere клетки и адгезивные клетки не показали значительно химиорезистентность к лекарственным средствам в зависимости от дозы (рис. S1).
<р> Далее, мы исследовали экспрессию CD44 в диссоциированных tumorsphere клеток и адгезивных клеток с использованием иммунофлуоресцентного анализа и вестерн-блот. Результаты показали, что клетки, экспрессирующие CD44, были значительно больше в tumorsphere клетках, чем в адгезивных клеток (фиг. 2А). Кроме того, экспрессия других CSCs маркеров (CD24 и CD133) в tumorsphere клеток и адгезивных клеток исследовали с помощью Вестерн-блоттинга, по сравнению с tumorsphere клетками, экспрессия CD24 была значительно ниже в адгезивных клеток, в то время как экспрессия CD133 была одинаковой (рис . 2B). Кроме того, мы фракционированию ТЖК-27 клетки с помощью FACS сортировки для CD44, мы обнаружили, что CD44 (+) клеток фракция может генерировать больше сфероидами колоний по сравнению с CD44 (-) фракции клеток, кроме того, размер шаровидных колоний из CD44 (+) клеток был больше, чем те, из CD44 (-) (рис. 2С). клетки
2. Tumorsphere клетки могут генерировать опухоли при ксенотрансплантации 3. была выше выражена SHH путь в tumorsphere клетках, чем в прилипшие клетки 5. SHH пути блокирования усиленной реакции опухоли на наркотики в естественных условиях Что касается химиорезистентности, несколько особенностей ЦОК может сделать их трудно устранить. ОКК относительно в состоянии покоя, и это позволяет им уйти от химиотерапевтических препаратов, которые, как правило, нацелены активно велоспорта клетки. К тому же, как показано для их нормального аналога, ЦОК было предложено проявлять высокую уровень экспрессии множественная Транспортер генов семейства, вероятно, что приводит к более эффективному оттоком химиотерапевтических препаратов и врожденной множественной лекарственной устойчивости, кроме того, сигнальные пути, такие как Wnt, еж или Notch, являются дизрегуляции в ЦОК, приводящих к развитию опухоли. Поэтому разработка эффективной терапевтического подхода требует выявления отличительных молекулярных путей активных в ЦОК и идентификации агентов, которые могут либо блокировать CSC пролиферацию или индуцируют дифференцировку CSC, тем самым повышая чувствительность к химиотерапевтическим препаратам. Таким образом, важные факторы, влияющие на химическую устойчивость ЦОНов являются внутренние факторы. Микросреда, или ниша, могут влиять на способность ОКК размножаться, мигрировать или вторгаться. Ниша анкерный участок для ЦОНов и молекул адгезии или микроокружения растворимых молекул, в том числе факторов и цитокинов роста, может в значительной степени способствовать рефрактерности к терапии. Хотя ингибирование SHH пути по cyclopamine или 5E1 будет полезной стратегией, в нашем исследовании мы показали, что компонент рецептора Ptch и фактор транскрипции Gli1 были также высоки выражены в tumorsphere клетках. Таким образом, Ptch или Gli1 может быть альтернативой мишенью для лечения рака желудка. Одна из возможных стратегий заключается в использовании малых интерферирующих РНК (миРНК) или shRNA специфичные для Ptch или Gli1, но желудка CSLCs в tumorsphere клетках не были полностью очищены, нам необходимо дополнительно очистить желудка CSLCs, так что эта работа будет сделана в дальнейшем наше исследование Материалы и методы Заявление по этике животных мужчина бестимусных голых мышей (ню /ню), от 6 до 8 недель, были получены из Пекина Vital-реки Lab Animal Technology Co. Ltd (SCXK JING 2007-0001) и содержали в свободных от патогенов условиях в барьерном вивария. Все мыши были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами лабораторных животных Центра Академии военных медицинских наук (SYXK JUN 2002-001). человека рака желудка клеточные линии (ТЖК-27, MGC-803 и MKN-45), полученные из Пекинского объединенного медицинского колледжа культивировали в среде 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и высевали при плотности 1 × 10 6 живых клеток на 75-см 2 колбы. При присоединении клетки, мы пассировать их на месте слияния. Tumorspheres были получены путем размещения адгезивных клеток в бессывороточной 1640 культуральной среде, содержащей 1% N-2 Дополнение (Invitrogen), 2% B-27 добавка (Invitrogen), 1% смеси антибиотика (Гибко), 20 нг /мл человеческого FGF -2 (Хемикон), и 100 нг /мл ЭФР (Хемикон), а прилипшие клетки высевали в 24-луночный сверхнизкой крепежной пластиной (Corning) по 500 клеток на лунку. Через 2 недели планшеты анализировали на образование tumorspheres и количественно определяли с использованием инвертированного микроскопа (Olympus) при 40-кратном и 100-кратном увеличении желудочный опухолевой ткани образца
<р> Для исследования ксенотрансплантатов, равное число (2 × 10 4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) свеже диссоциированы tumorsphere клеток или управления прилипшие клетки вводили подкожно в каждой мыши (6 мышей на группу). Результаты показали, что опухоли были получены с 2 × 10 4 tumorsphere клеток, что было в 100 раз меньше, чем те, которые требуются для высева опухолевого адгезивных клеток (таблица 1). Кроме того, tumorsphere клетки генерироваться подкожных опухолей с большим объемом и более короткого времени по сравнению с теми, генерируются из адгезивных клеток (фиг. 3А, В). Таким образом, подкожное введение низкого числа tumorsphere клеток подтвердили, что шаровидные клетки сохранили более сильным онкогенного потенциала в голых мышей, чем прилипшие клетки
<р> H &Amp;. E рассмотрение ксенографтов, полученных из ТЖК-27 tumorsphere клетки показали, что эти опухоли тесно напоминал первоначальную человеческую опухоль, в основном содержащие дифференцированные клетки (рис. 3в). Важно отметить, что tumorspheres может быть повторно получены из ксенотрансплантированы опухолей (рис. 3D), и они могут образовывать опухоль снова (рис. 3Е). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что tumorsphere клетки представлены CSLCs, которые имели онкогенного потенциала.
<р> Для того, чтобы исследовать связь между SHH пути и CSLCs характеристик tumorsphere клеток, мы сначала исследовали экспрессию мРНК SHH Тропинка связанных молекул, включая Shh, Ptch, СМО, Gli1 и Gli2 с помощью RT-PCR. Результаты показали, что все мРНК высоко выражены в ТЖК-27 tumorsphere клеток. По сравнению с tumorsphere клетками, уровни экспрессии Shh, Ptch, Smo и Gli1 были значительно ниже в адгезивных клеток, в то время как уровни экспрессии Gli2 были похожи на tumorsphere клетки. В MGC-803 и MKN-45, уровни экспрессии Shh, Ptch и Gli1 также были значительно ниже в прикрепленных клетках, чем в tumorsphere клетках, в то время как уровни экспрессии Smo и Gli2 не было существенной разницы между адгезивными клетками и tumorsphere клетками (рис . 4А).
<р> В SHH пути, Ptch и Gli1 являются гены-мишени, они рассматриваются в качестве важных маркеров SHH затрагивающего пути аномальной активации. Таким образом, мы исследовали далее уровни экспрессии Ptch и Gli1 Вестерн-блот и количественной ПЦР в реальном времени.
<Р> При использовании вестерн-блот, мы обнаружили, что уровни экспрессии Ptch и Gli1 также были выше в клетках, чем tumorsphere в адгезивных клеток (рис. 4В). Далее мы оценивали уровни экспрессии Ptch и Gli1 в ксенотрансплантатов из ТЖК-27 с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Количественная ПЦР в реальном времени анализ генов-мишеней SHH (Ptch и Gli1) показали те же результаты выше полуколичественной RT-PCR (рис. 4С).
4. блокирование SHH путь уменьшил самообновляющихся емкость и химическую устойчивость в ТЖК-27 tumorsphere клетки
<р> Чтобы проверить на возможную роль SHH пути самообновлению способности tumorsphere клеток, мы использовали cyclopamine или контроль tomatidine, 5E1 или PBS контроль, чтобы блокировать путь.
<р> результаты показали, что лечение cyclopamine привело к значительному снижению способности к образованию подгрупп tumorspheres в ТЖК-27 tumorsphere клеток в зависимости от дозы, но такого эффекта наблюдалось в адгезивных клеток (фиг. 5А). Кроме того, мы оценивали ли лечение с cyclopamine будет влиять на способность формирования колоний ТЖК-27 tumorsphere клеток с помощью анкерного -независимый анализа роста. Аналогичным образом, способность образовывать колонии сократилось более в tumorsphere клеток в зависимости от дозы моды по отношению к прилипшие клетки (рис. 5б).
<Р> Далее, мы исследовали влияние SHH пути на химиорезистентности из ТЖК -27 tumorsphere клетки, мы обрабатывали диссоцииро- клетки с cyclopamine или управления tomatidine в течение 48 часов, а затем лекарственная устойчивость tumorsphere клеток оценивали. Когда cyclopamine последовали наркотиков, лечение привело к значительно улучшенной общей смертности клеток. Наилучшие результаты были получены, когда cyclopamine сочеталась с оксалиплатин с Митомицин (рис. 5в). Нет такого синергического эффекта не наблюдалось в адгезивных клеток после воздействия лекарственных препаратов с cyclopamine в течение 48 часов (рис. 5D).
<Р> Мы также исследовали влияние различных концентраций cyclopamine (2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ) на клеточной гибели. Результаты показали, что только cyclopamine к tumorsphere клетки могли бы сделать небольшое, но последовательное уменьшение числа жизнеспособных клеток. По сравнению с 27-ми ТЖК tumorsphere клеток, эффект cyclopamine на клеточной гибели в прилипшие клетки было большее значение (рис. 5C, D).
<Р> Когда SHH путь был заблокирован 5E1 или контролировать PBS, результаты самостоятельно -renewing емкость и химиорезистентность из tumorsphere клеток и адгезивные клетки были аналогичны тем, которые блокированы cyclopamine или управления tomatidine (рис. S2).
<р> Чтобы проверить эту гипотезу в естественных условиях, мы проанализировали, был ли использован SHH путь блокирования усиленной химиотерапии эффективность, cyclopamine или управления tomatidine для ингибирования реакции SHH Подготовка в. ТЖК-27 tumorsphere клетки оставляли расти в обоих задних флангах голых мышей до большего диаметра опухоли не достигал примерно 2 мм. Затем мышей обрабатывали дважды в неделю в течение 3-х недель с cyclopamine или контролем tomatidine за 24 часа до оксалиплатином доставки. Во всех обработанных мышей, опухоли, обработанные оксалиплатина были значительно меньше, чем те, не обрабатывали оксалиплатина. Кроме того, опухоли показали значительно большее ингибирование роста опухоли, когда они были обработаны с оксалиплатина в комбинации с cyclopamine, ответ опухоли к химиотерапевтическим препаратом усиливалось cyclopamine (рис. 6А, В). Мы также исследовали, может ли заблокирован SHH путь с помощью 5E1 или контролировать PBS усиливается химиотерапии эффективность в естественных условиях, результаты показали, что 10 мкг /мл 5E1 лечение привело к значительно большему торможению роста опухоли, чем те, только обрабатывали Оксалиплатин (рис. 6А, В).
<р> Эти данные свидетельствуют о том, что, хотя стандартные химиотерапевтические препараты с задержкой опухоли нарост во время лечения, когда они были в сочетании с cyclopamine или 5E1, эффективность химиотерапии была значительно улучшена, а также более устойчивой после прерывания лечения.
<р> Далее, чтобы исследовать вопрос о том блокирование пути SHH в естественных условиях имел специфическое влияние на ТЖК 27-tumorsphere клеток. Мышам только обрабатывали cyclopamine на правой задней боковой стороны или управления tomatidine на левой задней боковой стороны (два раза в неделю в течение 3-х недель), когда опухоли от ТЖК 27-tumorsphere клеток достигает приблизительно 2 мм, через 3 недели мы провели предельный анализ разбавления сФЕРОИДОВ образование с использованием опухолевых клеток, обработанных cyclopamine и обрабатывали tomatidine, соответственно. Как показано в таблице S2, примерно 9-15% клеток от ксенотрансплантированы опухоли, обработанной с tomatidine может производить сфероиды, в то время как менее 2,5% клеток от ксенотрансплантированы опухоли, обработанной с cyclopamine может генерировать сфероидов. Таким образом, блокирование SHH пути в естественных условиях может привести к снижению числа желудочных CSLCs.
6. SHH путь поддерживается желудочные CSLCs характеристики tumorsphere клеток из образцов первичной опухоли
<р> Для того, чтобы определить, может ли быть вовлечены SHH пути в желудочном ОКК характеристик tumorsphere клеток из ткани рака желудка, мы использовали первичные образцы рака желудка для анализа функциональные аспекты SHH пути в желудочном CSLCs.
<р> во-первых, мы росли свеже диссоциированные сыпучие клетки желудка образцов рака в не содержащей сыворотки среде, описанной в разделе методы, через 10 дней наблюдались tumorspheres (рис. 7А, Б). Затем мы исследовали и химическую устойчивость онкогенного потенциала tumorsphere клеток из желудка раковой ткани. Результаты показали, что tumorsphere клетки из желудка раковой ткани продемонстрировали значительно большую устойчивость к лекарственным средствам, чем насыпных клеток в тех же условиях (рис. 7в). Кроме того, недавно Диссоцииро- сыпучие клетки из желудка образцов рака вводят в 2 × 10 7 клеток на мышь были способны создать подкожных опухолей, в то время как мало, как могли бы составить 2 × 10 4 из tumorsphere клеток из желудка образцов рака опухоли (таблица 1), ксенотрансплантаты опухоли, которые в результате инъекции tumorsphere клеток представлены те же особенности гистопатологии в качестве их соответствующих опухолей человека (рис. 7F). Эти результаты показали, что tumorsphere клетки из желудка раковой ткани обладают характеристиками CSLCs. Далее мы наблюдали эффект SHH затрагивающего пути блокировки на химиорезистентности из tumorsphere клеток в пробирке и опухолевой реакции на лекарства в естественных условиях. Результаты показали, что cyclopamine или может 5E1 привело к значительно улучшенной общей смертности клеток (рис. 7D) и опухолевый ответ на препарат (рис. 7E).
Обсуждение
<р> ОКК разделяют многие характеристики с тканевых стволовых клеток, таких как самообновлению, пролиферации, химиорезистентности, и в первую очередь ответственны за поддержание роста опухолей [27], [28]. Многие исследователи использовали флуоресценции Активированный сортировки клеток для идентификации и выделения CSCs и определили, что эти клетки могут образовывать сферы в специализированных среде без сыворотки. В данном исследовании мы взяли противоположный подход, развивая tumorsphere клетки и затем определяют эти клетки приобрели ли ОКК характеристики.
<Р> Мы использовали определенную бессывороточной среды, состоящей из EGF, FGF-2, B-27 и дополнения N-2 добавка для поддержания желудочные клеточные линии рака предстательной. Эти условия были использованы ранее для поддержания эндогенных нервных стволовых клеток-предшественников /и опухолевых стволовых клеток из человеческих опухолей и опухолевых клеточных линий. Например, Kondo и др. [24] охарактеризовал линию опухолевых клеток С6 крысы в пробирке и в естественных условиях и наблюдали небольшую популяцию стволовых подобных клеток, полученных из хорошо охарактеризованных стороне населения. Setoguchi и др. [29] показали, рак стволовых клеток, как потенциал в других клеточных линий рака, в том числе линии MCF7 рака молочной железы, нейробластомы, B104 и HeLa аденокарциномы.
<Р> В нашем эксперименте мы использовали три желудка клеточных линий рака (HGC- 27, MKN-45 и MGC-803) к культуре tumorspheres. ТЖК-27 клеточная линия была создана путем культивирования метастатических лимфатических узлов из желудка пациента рака диагностированной гистологических как недифференцированный рак. MKN-45 был создан из слабо дифференцированной аденокарциномы желудка 62-летней женщины. MGC-803 представляет собой эпителиальные слабо дифференцированный желудка человека линии слизисто-клеток аденокарциномы от 74-летнего мужчины.
<Р> Два разных подхода, как правило, используются для идентификации CSCs в опубликованных работах [30], [31] , Одним из них является метод в пробирке называется "формирование сфероид колонии", а другой в естественных условиях методом имплантации с участием кандидатов ЦОК под кожу иммунодефицитных мышей.
<Р> Первый способ включает в себя культивирование кандидатов CSCs в культуре блюда со специальным покрытием для noncell крепление с помощью бессывороточной среды, содержащей эпидермальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов. Рост сферических колоний после нескольких недель считается показателем способности к самообновлению, и будет соответствовать фенотипа CSC. Последний метод-рост клеток в иммунодефицитных мышей-необходимо, чтобы продемонстрировать истинную онкогенность и, как правило, рассматривается как золотой стандарт для доказательства существования ЦОНов. Ряд исследований предположили, что эти два подхода в целом обеспечивают аналогичные результаты при оценке кандидатов CSCs для многих солидных опухолей.
<Р> В настоящее время, желудка ОКК не имеют конкретных лиц, принимающих поверхности, поэтому мы разработали tumorsphere клетки, а затем определить, являются ли эти клетки приобрели ОКК характеристики, в том числе самообновлению мощности, химиорезистентности и онкогенного потенциала.
<р> Наши данные показали, что клеточные линии рака желудка (ТЖК-27, MGC-803, MKN-45), выращенных в определенной serum- свободная среда может образовывать tumorspheres, которые содержали клетки ведут себя как CSLCs. В пробирке, tumorsphere клетки показали повышенную способность образовывать колонии в мягком агаре под анкерными-независимых условиях и повышенную способность образовывать суб-tumorspheres. Мы также показали, что способность к самообновлению, чтобы сформировать суб-tumorspheres из ТЖК 27-tumorsphere клеток было увеличение на пассажей от 2 до 8 (от 44,5% до 70,5%), а затем она сохраняется относительно стабильной пропорции после 8 или более пассажей при выращивании на клональной плотности (рис. S3). Эти данные свидетельствуют о том, что пролиферативный потенциал клеток tumorsphere сохранялся после длительных пассажей. Кроме того, tumorsphere клетки в пробирке были более устойчивы к оксалиплатина и Митомицин по сравнению с адгезивными клетками, эти данные свидетельствуют о том, что tumorsphere клетки состоят из обогащенных числа CSLCs, которые потенциально делало их менее восприимчивыми к действиям как оксалиплатина и Митомицин. В естественных условиях, tumorsphere клетки могут генерировать опухоли при ксенотрансплантации с более высокой скоростью, чем прилипшие клетки. Кроме того, tumorsphere клетки генерируются подкожные опухоли с большим объемом и более короткие сроки по сравнению с теми, полученные от прилипших клеток, Важно отметить, что tumorspheres может быть повторно получены из ксенотрансплантированы опухолей, и они могут сформировать опухоль снова, эти данные свидетельствуют о том, что tumorspheres обогащались CSLCs .
<р> В нашем исследовании, прилипшие клетки предположительно содержали относительно низкий процент ЦОК, поскольку не использовали метод для выделения или удаления этих клеток. Можно утверждать, что именно эта небольшая популяция ЦОК, который отвечает за формирование опухоли. Несмотря на это, больше ОКК были очевидны в tumorsphere клетках, что может объяснить его более агрессивное поведение.
<Р> Далее, мы исследовали, были ли поддерживаться характеристики CSLCs в tumorspheres аномальной активации SHH пути. Во-первых, мы показали, что уровень экспрессии мРНК SHH Тропинка связанных молекул (Тсс, Ptch и Gli1) находились в tumorsphere клетках значительно выше, чем в прикрепленных клетках, в то время как Gli2 была высока выражена в обеих клетках. Кроме того, мы исследовали уровни экспрессии SHH-мишеней пути генов (Ptch и Gli1) с помощью Вестерн-блоттинга и количественной ПЦР в реальном времени, результаты были аналогичны RT-PCR. Во-вторых, ингибирование активности SHH затрагивающего пути от cyclopamine или 5E1 приводило к снижению способности самообновления и повышенной чувствительности к лекарственным средствам в ТЖК-27 tumorsphere клетки, но эти эффекты не были выражены в прикрепленных клетках. В естественных условиях, во всех обработанных мышей, опухоли, обработанные оксалиплатина были значительно меньше, чем те, не обрабатывали оксалиплатина, после обработки cyclopamine или 5E1, ответ опухоли к химиотерапевтическим лекарственным средствам усиливалась. Эти данные свидетельствуют о том, что, хотя стандартные химиотерапевтические препараты с задержкой опухоли нарост во время лечения, когда они были в сочетании с cyclopamine, эффективность химиотерапии была значительно улучшена, а также более устойчивой после прерывания лечения.
<Р> Наконец, мы использовали первичный рак желудка образцы для анализа функциональных аспектов SHH пути в желудочном CSLCs. Результаты показали, что tumorsphere клетки желудка образца рака также имели химическую устойчивость и онкогенного потенциала, причем SHH путь блокирование снижается химическую устойчивость в tumorsphere клеток и повышенной опухоли к лекарствам в естественных условиях.
<р> в заключение., мы показали, что SHH путь может быть вовлечен в самообновлению, пролиферации, лекарственной устойчивости и онкогенными из tumorsphere клеток и предполагают, что стратегии, направленные на подавление SHH пути представляют собой логическое обоснование терапевтический подход к целевой желудочные ОКК.
Культура прикрепленных клеток, tumorspheres и суб-tumorspheres
. <Р> После того, как первичные tumorspheres достигли размера приблизительно 200-500 клеток на сферы, tumorspheres диссоциируют при плотности 1000 клеток на миллилитр и 100 мкл суспензии отдельных клеток высевали в каждую лунку 24-луночного сверхнизкой крепежной пластиной (Corning) в свободной от сыворотки среде, описанной выше. Каждую лунку исследовали на одной клетки, и только лунки, которые содержали одну ячейку были отмечены. 2 недели спустя, колодцы были проанализированы для формирования суб-tumorspheres. Нормальные прилипшие клетки использовали в качестве контроля для способности формировать подгруппы tumorspheres. Чтобы проверить связь между SHH пути и образованием суб-tumorspheres, мы обрабатывали Диссоцииро- клетки с cyclopamine (2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ) или контрольной tomatidine, 5E1 (10 мкг /мл) или контрольной среде ФБР и наблюдали образование суб-tumorspheres.
<р> свежие, стерильные образцы ткани рака желудка человека были получены в соответствии с этическими нормами организационного комитета по человеческим экспериментирования из 15 пациентов (возраст диапазон 70-85 лет) проходит резекция желудка рака, после получения информированного согласия пациентов (таблица S3).
<р> Затем образцы погружали в 95% этаноле в течение 2-3 сек, чтобы избежать загрязнения, и промывают фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и антибиотиков в несколько раз, чтобы удалить кровь. После того, как эти, поверхность образцов раковых тканей удаляли, и внутренние части были разрезаны на 1-3 мм 3 штук размера. Затем они были расщеплены в коллагеназы и диспаза растворе при температуре 37 ° С, через 4 часа инкубации раствор, содержащий переваренных ткани центрифугировали для удаления раствора коллагеназы. Клеточный осадок промывали один раз средой 1640 прежде, чем быть приостановлено в 1640 без сыворотки среде, содержащей 1% N-2 дополнение, 2% В-27 добавки, 1% смеси антибиотика, 20 нг /мл человеческого FGF-2, 100 нг /мл EGF, и высевали в 24-луночные планшеты со сверхнизким крепления. Все культуры инкубировали при 37 ° С в инкубаторах, поставляемых с увлажненным воздухом и 5% CO <югу> 2.
Анкоридж независимый анализ роста
<р> Для наблюдения Самообновляющийся потенциала дальше, мягкие агар анализ использовали для определения образования колоний tumorsphere клеток и адгезивных клеток под анкерными-независимых условиях. Каждую лунку шесть-луночный планшет покрывали 1 мл 10% FBS 1640 с 1% агарозы. Через 20 мин инкубации при 37 ° С, добавляли равное количество (500) из tumorsphere клеток или адгезивных клеток в 1 мл 10% FBS 1640 с 0,5% агарозном геле. Чтобы проверить связь между SHH пути и образованию колоний при анкерными-независимых условиях, мы обработали разложенных клетки с cyclopamine (2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ) или контроль tomatidine, 5E1 (10 мкг /мл) или контролировать PBS.
Микробиом человека сокращает гликаны слизистых оболочек,
Новый инструмент регистрирует и отслеживает рост микробиома
Стратегия готовности педиатрической медицинской помощи ко второй волне пандемии COVID-19
Слизь в лейке для душа может содержать опасные легочные бактерии - исследование
Метформин может помочь при повышенной кишечной проницаемости
Инфликсимаб может снизить эффективность некоторых вакцин против COVID-19
Микробы кишечника ос помогают бороться с пестицидами
Интригующее исследование, опубликованное в феврале 2020 года в журнале Клеточный хозяин и микроб сообщает, что когда осы подвергаются воздействию атразина, широко используемый пестицид, микробиом ки
Замена красного мяса заменителями мяса на растительной основе снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний
Сердечно-сосудистые заболевания - это общий термин, используемый для определения состояний, поражающих сердце и кровеносные сосуды, и обычно связан с накоплением жировых отложений и повышенным риском
Пересадка кала от одних доноров лучше, чем от других
Трансплантация фекальной микробиоты или трансплантация стула от донора полезна для пациентов, инфицированных смертельно опасным рецидивирующим заболеванием. Clostridium difficile что приводит к силь