PLoS ONE: Sonic the Hedgehog Kelias yra būtina priežiūra vėžio kamieninių ląstelių Kaip žmogaus skrandžio Cancer

Anotacija

Nenormalus aktyvavimo Sonic ežys (SHH) kelias buvo aprašyta įvairių žmogaus vėžio ir vėžio kamieninių ląstelių (CSCS), tačiau nebuvo pranešta apie SHH keliu vaidmuo skrandžio CSCS. Šiame tyrime mes ištirti galimybę, kad nenormalus aktyvavimo SHH keliu išlaikė skrandžio CSCS savybes. Pirma, mes nustatyti vėžio kamieninių kaip ląstelių (CSLCs) iš žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų (HGC-27, MSV-803 ir MKN-45), naudojant tumorsphere kultūrą. Palyginti su lipnių ląstelių, plaukiojantieji tumorsphere ląstelės turėjo daugiau savarankiškai atnaujinimo pajėgumus ir Atsparumas cheminėms. Ląstelės išreiškiantys CSCS žymeklių (CD44, CD24 ir CD133) taip pat buvo žymiai daugiau tumorsphere ląstelių nei lipnių ląstelių. Dar svarbiau, kad in vivo ksenografiniuose tyrimai parodė, kad navikai gali būti sukurtas su 2 × 10 ^{4 tumorsphere ląstelių, kurios buvo 100 kartų mažiau nei reikalauja auglių sėti iki lipnių ląstelių. Be to, AT-PGR ir Vakarų dėmė parodė, kad sąvoka lygiai Ptch ir Gli1 (SHH kelias tikslinių genų) buvo reikšmingai didesnis tumorsphere ląstelių nei lipnių ląstelių. Kiekybinių realaus laiko PGR rezultatai buvo panašūs į RT-PGR ir Vakarų dėmė. Tolesnė analizė parodė, kad SHH kelias užblokuotas cyclopamine ar 5E1 sukelia didesnį sumažėjimą savarankiškai atnaujinimo pajėgumai HGC-27 tumorsphere ląstelių negu nuo lipnių ląstelių. Mes taip pat nustatė, kad SHH kelias stipriai blokuoja sustiprino chemoterapinių vaistų veiksmingumą HGC-27 tumorsphere ląstelių in vitro ir in vivo, tačiau neturėjo didelio poveikio lipnių ląstelių. Galiausiai, mes izoliuotas tumorspheres nuo skrandžio vėžio pavyzdį, šios ląstelės taip pat turėjo Atsparumas cheminėms ir tumorogeniškas pajėgumus ir SHH kelias išlaikytas skrandžio CSLCs charakteristikas tumorsphere ląstelių pirminių navikų mėginiuose. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad SHH kelias buvo būtini techninės priežiūros CSLCs žmonijos skrandžio vėžio}

nurodomoji dalis:. Lyrinės Z Yue W Wei B Wang N. Li T Guan L et al. (2011) Sonic the Hedgehog Kelias yra būtina priežiūra vėžio kamieninių Kaip ląsteles žmogaus skrandžio vėžio. PLoS ONE 6 (3): e17687. Doi: 10,1371 /journal.pone.0017687

redaktorius: Michailas Blagosklonny, Roswell Park vėžio instituto, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lapkričio 27, 2010; Priėmė: Vasario 10, 2011 m Paskelbta: Kovo 4, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Lyrinės et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės aukštųjų technologijų mokslinių tyrimų ir technologinės plėtros programoje Kinijos (È6AA402A04,È6AA02A107), didžioji valstybės pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (È9CB521704) ir Nacionalinės Gamta mokslo fondo Kinijos (Ĵ72468,.873.031). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

CSCS vaidina svarbų vaidmenį vėžio vystymąsi, tai subpopuliacija per naviko turi savarankiškai atnaujinimo pajėgumai, Atsparumas cheminėms ir tumorogeniškas talpos charakteristikas todėl gali suvaidinti lemiamą vaidmenį inicijuojant, progresavimo ir pasikartojimo vėžio. Ištirti ir manipuliuoti biocheminius kelius dalyvauja šių savybių yra vienas iš geriausių būdų, kaip prisidėti prie CSCS, vedantis į naujų vaistų ir gydymo procedūras. SHH kelias vaidina svarbų vaidmenį daugelyje CSCS, pavyzdžiui, glioblastomos kamieninių ląstelių [1], [2], CD34 + Leukemija ląstelių kiekis [3], [4] ir krūties CSCS [5], be to, ji yra labai svarbi vystymosi ir homeostazės skrandžio liaukos [6], nenormalus aktyvavimo SHH keliu gali sukelti skrandžio vėžio [7], [8], tačiau SHH keliu vaidmuo skrandžio CSCS nėra aiški.

Ša kelią į žinduolio ląstelės yra sąlygotas ligandų Šaa [9]. Atsižvelgiant į Šaa nesant, transmembraninis receptoriaus lopas (Ptch) slopina kitos transmembraniniu baltymu, smoothened (BRO) veiklą, todėl į inaktyvuojant SHH būdo [9], [10]. Privalomas Ša į Ptch panaikina slopinantį poveikį Ptch ir SMO slopinančią, taip įjungiant transkripcijos faktorius Gli (Gli1, Gli2 ir Gli3) [9], [10]. Gli1 yra stiprus teigiamas aktyvatorius tolesniems tikslinių genų ir pati yra transkripcijos tikslas SHH keliu [11]. Todėl Gli1 yra laikomas SHH rūšyse nenormalus aktyvavimo [10] žymeklis, [12]

Neseniai buvo nustatyti ir izoliuoti nuo piktybinių navikų keletas tipų CSCS ar CSLCs [13] - [25].. Skrandžio vėžio, metodologiškai, tai sunku atskirti ir sustiprinti CSCS iš ląstelių linijas ar naviko audinių pavyzdžius. Šiuo metu, CD44, atrodo, labiausiai naudinga žymeklis būsimasis valymo skrandžio CSCS, tačiau tai nėra labai specifinis skrandžio CSCS [26].

Šiame tyrime mes izoliuoti CSLCs iš žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC-27, MSV-803 ir MKN-45), naudojant tumorsphere kultivavimo terpėje serumo nemokama ir nustatė, savarankiškai atnaujinti gebėjimus, Atsparumas cheminėms ir tumorogeniškas pajėgumą tumorsphere ląstelių; Be to, mes išnagrinėjo Ša kelią susijusių molekulių, įskaitant Ša, Ptch, smo, Gli1 ir Gli2 išraišką tumorsphere ląstelių ir lipnių ląstelių, o ypač iš Ptch ir Gli1.Then išraiška, mes užblokuotas Ša kelią iki cyclopamine arba valdymo tomatidine, 5E1 arba kontroliuoti PBS ištirti, ar CSLCs į tumorsphere ląstelių charakteristikos išliko nenormalus aktyvavimo SHH keliu. Galiausiai, mes naudojamas pirminis navikas mėginius analizuoti funkcinius aspektus SHH keliu skrandžio CSLCs.

Cyclopamine yra mobilusis pralaidi nesteroidinis alkaloidas. Tai sutrikdo cholesterolio bio-sintezę ir konkrečiai antagonizmą Ša signalizacijos kelią per tiesiogine sąveika su BRO (smoothened), tolimo giminaičio G baltymu sujungto receptorius. Tai vertinga priemonė studijuoti SHH signalizacijos dalyvavimą įvairių auglių vystymąsi. Tomatidine yra nesteroidinis alkaloidas, kad struktūriškai panaši cyclopamine, tačiau trūksta pajėgumų slopinti Ša signalizacijos. Jis gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė. 5E1 yra anti-Hh monokloninis antikūnas, kuris neutralizuoja Ša ir IHH veiklą.

Rezultatai

1. Tumorsphere ląstelės turėjo Charakteristikų CSLCs

išaugo HGC-27, MSV-803 ir MKN-45 prisitvirtinę ląstelės aprašytą metodai skyriuje vidutinio serumo nemokamai. Po 7 dienų, tumorspheres, sudarytos iš maždaug 50 iki 100 ląstelių buvo pastebėtas (1a pav.).

buvo įvertintas savarankiškai-atnaujinant talpa iš šių tumorspheres pagal smulkinimo juos į vienos ląstelės ir auga kloninį tankio 1000 ląstelių skaičius viename mililitre. Po 2 savaičių, vieno ląstelių, gautų iš HGC-27 tumorsphere ląsteles sukurtas sub-tumorspheres ne 41.83% ± 3,13%, palyginti su 8.17% ± 2.40% nuo lipnių ląstelių, be to, MGC-803 ir MKN-45, sub-tumorspheres formavimas norma tumorsphere ląstelių taip pat buvo didesnis nei, kad nuo lipnių ląstelių. (Pav. 1B). Šie duomenys rodo, kad savarankiškai atnaujinimo pajėgumai tumorsphere ląstelių buvo reikšmingai didesnis negu nuo lipnių ląstelių. Tumorsphere ląstelės taip pat parodė padidėjusį sugebėjimą suformuoti kolonijas pagal tvirtinimo nepriklausomas sąlygomis standartiniame minkštu agaro testo po 14 dienų HGC-27 ir MKN-45 (1C pav.).

Taip pat atliekamas ribinę praskiedimo bandinys sferoidai formavimas naudojant HGC-27 tumorsphere ląsteles ir prilipusios ląsteles, atitinkamai. Kaip parodyta S1 lentelėje, maždaug 27-35% iš tumorsphere ląstelių galėtų gaminti sferoidus, o mažiau nei 5% nuo lipnių ląstelių gali generuoti sferoidus, po 3 savaičių kultūros. Todėl, atsižvelgiant į HGC-27 tumorsphere ląstelių, galime apskaičiuoti, kad sferoidai gaminančias ląsteles gyventojų sudaro ne daugiau kaip 35%.

Atsparumas cheminėms yra dar CSCS charakteristika, todėl tiriama, ar skirtumas Atsparumas cheminėms egzistavo tarp tumorsphere ląsteles ir prilipusios ląsteles. Rezultatai parodė, kad, praėjus 48 valandoms, tumorsphere ląstelės buvo nustatytas reikšmingai didesnį atsparumą narkotikų, palyginti su lipnių ląstelių tomis pačiomis sąlygomis (pav. 1d). Mes taip pat buvo įvertintas Atsparumas cheminėms iš HGC-27 tumorsphere ląstelių ir lipnių ląstelių į skirtingų koncentracijų narkotikų, tačiau, abi tumorsphere ląstelės ir prisitvirtinę ląstelės neparodė žymiai Atsparumas cheminėms į su narkotikais, priklausomai nuo dozės (S1 pav.).

Be to, mes išnagrinėjo CD44 ekspresiją atsieti tumorsphere ląstelių ir lipnių ląstelių naudojant imunofluorescencinių tyrimą ir Vakarų dėmė. Rezultatai parodė, kad ląstelės, ekspresuojančios CD44 buvo žymiai daugiau tumorsphere ląstelių nei lipnių ląstelių (pav. 2a). Be to, kitų CSCS žymekliai (CD24 ir CD133) į tumorsphere ląstelių ir lipnių ląstelių išraiška buvo nagrinėjamas Vakarų dėmė, palyginti su tumorsphere ląstelių, iš CD24 ekspresija buvo žymiai mažesnis lipnių ląstelių, o CD133 išraiška buvo panaši (pav . 2B). Be to, mes frakcionuotas HGC-27 ląstelių FACS rūšiavimo už CD44, mes nustatėme, kad CD44 (+), ląstelių frakcija gali generuoti daugiau STIPRIOJO kolonijas palyginti su CD44 (-) ląstelių frakcija, be to, sferoido kolonijų dydis nuo CD44 (+) ląstelių buvo didesnis negu nuo CD44 (-) (pav. 2C). ląstelės

2. Tumorsphere ląstelės gali generuoti navikai upon ksenotransplantacija

ksenografiniuose studijas, vienodo skaičiaus (2 × 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) šviežiai atskirti tumorsphere ląstelių arba kontrolės prilipusios ląsteles buvo švirkščiamas sc į kiekvieną pele (6 peles kiekvienai grupei). Rezultatai parodė, kad navikai buvo sukurtas su 2 × 10 4 tumorsphere ląstelių, kurios buvo 100 kartų mažesnis nei reikalingas auglio sėjos iki lipnių ląstelių (1 lentelė). Be to, tumorsphere ląstelės susidaro poodiniai navikai su tūris didesnis ir trumpesnį laiką, palyginti su tais, gautos iš lipnių ląstelių (pav. 3A, B),. Taigi, poodinė injekcija nedaug tumorsphere ląstelių patvirtino, kad STIPRIOJO ląstelės išlieka stipresnis tumorogeniškas gebėjimus nuogas pelių, nei lipnių ląstelių}

O &Amp;. El tyrimas audiniuose, gautų iš HGC-27 tumorsphere ląstelės parodė, kad šie navikai glaudžiau panašus į originalų žmogaus navikų, daugiausia kurių sudėtyje yra diferencijuotas ląsteles (pav. 3c). Svarbiau yra tai, tumorspheres gali būti iš naujo kilęs iš xenotransplanted navikų (pav 3D.), Ir jos gali būti auglys vėl (pav 3E.). Todėl šie duomenys rodo, kad tumorsphere ląstelės atstovavo CSLCs, kurie turėjo tumorogeniškas pajėgumus.

3. SHH kelias buvo didesnis išreikštas tumorsphere ląstelių nei lipnių ląstelių

Jei ištirti ryšį tarp SHH kelio ir CSLCs charakteristikas tumorsphere ląstelių nuorodą, mes iš pradžių išnagrinėjo mRNR išraiška Ša kelią susijusių molekulių, įskaitant Ša, Ptch, smo, Gli1 ir Gli2 RT-PGR. Rezultatai parodė, kad visi iš mRNAs buvo aukštos išreikštas HGC-27 tumorsphere ląstelių. Palyginti su tumorsphere ląstelių ekspresijos lygis Ša, Ptch, smo ir Gli1 buvo gerokai mažesnis lipnių ląstelių, o ekspresijos lygis Gli2 buvo panašus į tumorsphere ląsteles. Be MGC-803 ir MKN-45, ekspresijos lygis Ša, Ptch ir Gli1 taip pat buvo žymiai mažesnis lipnių ląstelių negu tumorsphere ląstelių, o ekspresijos lygis smo ir Gli2 neturėjo reikšmingo skirtumo tarp lipnių ląstelių ir tumorsphere ląstelių (pav 4A.).

SHH keliu, Ptch ir Gli1 yra tikslinės genai, jie laikomi svarbiomis žymenų SHH rūšyse nenormalus aktyvacijos. Taigi, mes toliau nagrinėjo raiškos lygius Ptch ir Gli1 Western dėmė ir kiekybinės realaus laiko PGR.

Kai naudojate Vakarų dėmė, mes nustatėme, kad sąvoka lygiai Ptch ir Gli1 taip pat buvo didesnis tumorsphere ląstelių nei sukibusių ląstelių (pav. 4B). Mes šalia įvertino raiškos lygius Ptch ir Gli1 į audiniuose, iš HGC-27 kiekybinė realaus laiko PGR. Kiekybinis realaus laiko PGR analizė Ša tikslinių genų (PTCH ir GLI1) parodė tuos pačius rezultatus aukščiau pusiau kiekybiniam RT-PCR (pav. 4c).

4. SHH kelias blokavimas sumažino savarankiškai atnaujinimo pajėgumus ir Atsparumas cheminėms iš HGC-27 tumorsphere ląstelės

Jei išbandyti galimą vaidmenį SHH keliu savęs atnaujinimo pajėgumai tumorsphere ląstelių, mes panaudojome cyclopamine ar kontrolės tomatidine, 5E1 arba kontrolė PBS blokuoti kelią.

rezultatai parodė, kad cyclopamine gydymas buvo gerokai sumažinti pajėgumų sub-tumorspheres formavimo HGC-27 tumorsphere ląstelių priklauso nuo dozės mados, bet ne tokio efekto buvo pastebėtas lipnių ląstelių (pav. 5A). Mes taip pat įvertino, ar gydymas cyclopamine turėtų įtakos kolonijos formavimo gebėjimus HGC-27 tumorsphere ląstelių tvirtinimo -independent augimo tyrimu. Panašiai, gebėjimas sudaryti kolonijas buvo sumažintas daugiau į tumorsphere ląstelių nuo dozės priklausomu mados lyginant su ta lipnių ląstelių (5B pav.).

Be to, mes tyrė SHH būdo poveikį Atsparumas cheminėms iš HGC -27 tumorsphere ląstelės, mes gydė išskirti ląsteles cyclopamine arba kontrolės tomatidine 48 valandas, o tada buvo įvertintas varža tumorsphere ląstelių narkotikų. Kai cyclopamine lydėjo narkotikų, gydymas lėmė žymiai geresnė bendra ląstelių mirtingumas. Geriausi rezultatai buvo gauti, kai cyclopamine buvo derinamas su oksaliplatinos bei mitomicino (pav. 5c). Nėra tokio sinergetinis efektas buvo pastebėtas lipnių ląstelių po kontakto su narkotikais su cyclopamine 48 valandas (pav. 5d).

Taip pat tiriami skirtingų koncentracijų cyclopamine poveikį (2,5 um, 5 Hm, 10 um) nuo ląstelių mirties. Rezultatai parodė, kad vien cyclopamine į tumorsphere ląsteles galėtų padaryti nedidelį, bet nuosekliai sumažėjimą gyvų ląstelių skaičių. Palyginti su HGC 27 tumorsphere ląstelių, iš cyclopamine poveikis ląstelių mirtį lipnių ląstelių buvo daugiau reikšmės (pav. 5C, D).

SHH kelias buvo užblokuotas 5E1 arba kontroliuoti PBS, savarankiškai rezultatai -renewing pajėgumai ir Atsparumas cheminėms iš tumorsphere ląstelių ir lipnių ląstelių buvo panašios į tas, blokavo cyclopamine ar kontrolės tomatidine (pav. S2).

5. SHH kelias blokuoja sustiprintą naviko atsaką į narkotikų in vivo

Norėdami patikrinti šią hipotezę in vivo, mes analizuojama, ar SHH kelias blokuoja sustiprintą chemoterapija veiksmingumo, cyclopamine arba kontrolės tomatidine buvo naudojamas slopinti Ša kelią atsakymus. HGC-27 tumorsphere ląstelės buvo leidžiama augti į abi galines šonus nuo nuogas pelių iki didesnio skersmens auglio pasiekė apie 2 mm. tada Pelės buvo gydomi du kartus per savaitę 3 savaites su cyclopamine ar kontrolės tomatidine 24 valandoms iki oksaliplatinos pristatymo. Visais pelių, gydomi oksaliplatinos navikai buvo gerokai mažesnis nei ne gydomi oksaliplatinos. Be to, navikai parodė žymiai didesnį naviko augimo slopinimą, kai jie buvo gydomi oksaliplatinos kartu su cyclopamine, naviko atsakas į chemoterapiniu vaisto buvo sustiprintas cyclopamine (pav. 6A, B). Mes taip pat tyrė, ar SHH kelias užblokuotas 5E1 arba kontroliuoti PBS sustiprintas chemoterapijos veiksmingumą in vivo, rezultatai parodė, kad 10 mikrogramų /ml, 5E1 gydymas buvo gerokai didesnis navikas augimo slopinimas, negu tik gydomi oksaliplatina (pav. 6A, B),.

Šie duomenys rodo, kad nors standartiniai chemoterapiniai vaistai atidėtas naviko išaugą gydymo, kai jie buvo kartu su cyclopamine ar 5E1 metu, chemoterapijos veiksmingumas buvo daug didesnis ir taip pat daugiau patyrė po gydymo nutraukimo.

be to, ištirti, ar blokuoja Ša kelią in vivo turėjo konkretų poveikį HGC 27 tumorsphere ląsteles. Pelės buvo gydomi tik cyclopamine reikiamu galinio sparno arba valdymo tomatidine kairėje užpakalinio krašto (du kartus per savaitę 3 savaites), kai augliai iš HGC 27 tumorsphere ląstelių pasiekė apie 2 mm, po 3 savaičių, mes atliekame ribinę praskiedimo metodu už sferoidai formavimas naudojant navikines ląsteles gydomi cyclopamine ir gydomiems tomatidine, atitinkamai. Kaip parodyta S2 lentelę, maždaug 9-15% ląstelių nuo xenotransplanted naviko gydomi tomatidine galėtų gaminti sferoidus, o mažiau nei 2,5% ląstelių nuo xenotransplanted naviko gydomi cyclopamine gali generuoti sferoidus. Todėl, blokuoja Ša kelią in vivo gali sumažinti skrandžio CSLCs numerius.

6. SHH kelias išlaikytas skrandžio CSLCs charakteristikas tumorsphere ląstelių iš pirminio naviko mėginių

Norėdami nustatyti, ar SHH kelias galėtų dalyvauti skrandžio CSCS charakteristikas tumorsphere ląstelių iš skrandžio vėžio audinyje, mes naudojamas pirminis navikas mėginius analizuoti funkciniai aspektai SHH keliu skrandžio CSLCs.

Pirmiausia, mes išaugo šviežiai atsieti urmu ląstelės skrandžio vėžio bandinių aprašytą metodai skyriuje, po 10 dienų, buvo pastebėtas tumorspheres vidutinio serumo nemokamai (pav. 7A, B). Tada mes ištirti Atsparumas cheminėms ir tumorogeniškas pajėgumą tumorsphere ląstelių iš skrandžio vėžio audinyje. Rezultatai parodė, kad tumorsphere ląstelės iš skrandžio vėžio audinio buvo nustatytas reikšmingai didesnį atsparumą narkotikų kaip birių ląstelių tomis pačiomis sąlygomis (pav. 7c). Be to, šviežiai atsieti urmu ląstelės skrandžio vėžio egzempliorių įpurškiamas 2 × 10 ^{7 ląstelės per pele galėjo steigimo poodinio navikai, o kiek 2 × 10 4 iš tumorsphere ląstelių iš skrandžio vėžio egzempliorių galėtų būti navikai (1 lentelė), kad ksenoimplantai navikų, lėmė nuo injekcijos tumorsphere ląstelių pristatė pačius histopatologiniai funkcijas, kaip jų atitinkamos žmogaus naviko (7F pav.). Šie rezultatai parodė, kad tumorsphere ląstelės skrandžio vėžio audinio turėjo su CSLCs savybes. Be to, mes stebėjo SHH rūšyse blokavimo poveikį Atsparumas cheminėms iš tumorsphere in vitro ir navikų atsakas į narkotikų in vivo ląsteles. Rezultatai parodė, kad cyclopamine arba 5E1 galėtų lėmė žymiai geresnė bendra ląstelių mirtingumas (7d pav.) Ir naviko atsaką į vaistą (7E pav.).}

Diskusijos

CSCS praleisite daug charakteristikos su audinių kamieninių ląstelių, tokių kaip savęs atnaujinimo, platinimo, Atsparumas cheminėms, ir yra tiesiogiai atsakingi už palaikyti navikų augimą [27], [28]. Daugelis tyrėjai naudoti fluorescencijos aktyvuota ląstelių rūšiavimo atpažinti ir išskirti CSCS ir nustatė, kad šios ląstelės gali sudaryti sferas specializuotose serumo neturinčioje terpėje. Šiame tyrime mes priėmėme priešingą požiūrį kuriant tumorsphere ląsteles ir tada nustatyti, ar šios ląstelės įgijo CSCS savybes.

Mes naudojome apibrėžtą serumo terpę, kurią sudaro EGF, FGF-2, B-27 papildymo ir N-2 papildas išlaikyti skrandžio vėžio ląstelių linijas. Šios sąlygos buvo naudojamas prieš išlaikyti vidines neuroninių kamieninių /pirmtakus ir naviko kamienines ląsteles iš žmogaus navikų ir navikinių ląstelių linijoms. Pavyzdžiui, Kondo ir kt. [24] buvo būdingas C6 žiurkių naviko ląstelių liniją in vitro ir in vivo ir buvo pastebėtas mažas populiaciją kamieninių-kaip ląstelės, gautos iš gerai apibūdintas šoninės populiacijos. Setoguchi ir kt. [29] parodė, vėžio kamieninių ląstelių kaip potencialą kitose vėžio ląstelių linijų, įskaitant MCF7 krūties vėžio linija, B104 neuroblastoma, ir HeLa adenokarcinoma.

Mūsų eksperimentas, mes panaudojome tris skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC- 27, MKN-45 ir MSV-803) į kultūros tumorspheres. HGC-27 ląstelių linija buvo įkurta kultūros metastazavusiu limfmazgiuose iš skrandžio vėžys diagnozuotas histologinių kaip nediferencijuotą karcinoma. MKN-45 buvo nustatytas nuo prastai diferencijuotai adenokarcinoma į 62-erių metų moteriai skrandį. MSV-803 yra epitelio blogai diferencijuotas žmogaus skrandžio gleivinių ir adenokarcinoma ląstelių linijos iš 74-erių metų vyras.

Du skirtingi požiūriai paprastai buvo naudojami siekiant nustatyti CSCS paskelbtuose tyrimuose [30], [31] , Vienas iš jų yra in vitro metodas vadinamas "Sferoida kolonija formavimas", o kitas yra in vivo metodu, apimančiu implantacijos kandidačių CSCS pagal imuninės pelių odą.

Buvęs metodą kultivuojant kandidates CSCS kultūra patiekalų, specialiai padengtą noncell pakabinimo su žiniasklaida be serumo, kurių sudėtyje yra epidermio augimo faktorių ir pagrindinio fibroblastų augimo faktorių. Iš sferinių kolonijų augimas po kelių savaičių laikomas rodo savarankiškai atnaujinimo galimybes, ir būtų suderinami su CSC fenotipą. Pastarasis metodas-ląstelių augimą imuninės pelių-reikia parodyti tikrąjį tumorogeniš- ir paprastai laikoma aukso standarto įrodyti egzistavimą CSCS. Daugybė tyrimų parodė, kad šie du požiūriai paprastai pateikia panašius rezultatus vertinant kandidates CSCS daugelį solidinių navikų.

Šiuo metu skrandžio CSCS neturite savitasis paviršius aparatai, todėl mes sukūrėme tumorsphere ląsteles ir tada nustatyti, ar Šios ląstelės įgytos CSCS charakteristikos, įskaitant savarankiškai atnaujinimo pajėgumai, Atsparumas cheminėms ir tumorogeniškas pajėgumus.

Mūsų duomenys rodo, kad skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC-27, MGC-803, MKN-45) auginami nustatytoje serum- nemokama vidutinio galėtų būti tumorspheres kad esančias ląsteles elgiasi kaip CSLCs. In vitro tumorsphere ląstelės parodė padidėjusį sugebėjimą suformuoti kolonijas minkštas agaro pagal tvirtinimo nepriklausomas sąlygas ir didesnį gebėjimą formuoti pakomitečius tumorspheres. Mes taip pat parodė, kad savarankiškai atnaujinti sugebėjimas sudaryti pogrupius tumorspheres iš HGC 27 tumorsphere ląstelių turėjo ne ištraukas 2 didinama iki 8 (iš 44,5% iki 70,5%), ir tada ji išlaikė gana stabilų dalį po 8 ar daugiau ištraukos, kai jie auginami sėjos klonų tankio (S3 pav.). Šie duomenys rodo, kad proliferacijos potencialas tumorsphere ląstelių išliko po ilgesnio ištraukas. Be to, tumorsphere in vitro ląstelių buvo atsparesni oksaliplatina ir mitomicino palyginti su lipnių ląstelių, šie duomenys rodo, kad tumorsphere ląstelės susideda iš prisodrinto skaičių CSLCs, kurie potencialiai padarytų jas mažiau jautrūs tiek oksaliplatina ir mitomicino veiksmus. In vivo tumorsphere ląstelės gali generuoti navikai upon ksenotransplantacijai didesniu tarifu nei lipnių ląstelių. Be to, tumorsphere ląstelės susidaro poodiniai navikai su didesniais apimties ir trumpesnį laiką, palyginti su tais, gautos iš lipnių ląstelių, Svarbu, tumorspheres gali būti iš naujo kilęs iš xenotransplanted navikų, ir jie vėl galėtų būti auglys, šie duomenys rodo, kad tumorspheres buvo prisodrintas CSLCs .

mūsų tyrimo duomenimis, prisitvirtinę ląstelės matyt esančius santykinai mažą procentą CSCS, nes buvo naudojamas ne metodas, izoliuoti ar pašalinti šias ląsteles. Galima teigti, kad tai yra mažas gyventojų CSCS, kad yra atsakingas už navikų susidarymo. Nepaisant to, daugiau CSCS buvo akivaizdus tumorsphere ląstelių, kurios gali paaiškinti savo daugiau agresyvų elgesį.

Be to, mes ištirti, ar CSLCs į tumorspheres charakteristikos išliko nenormalus aktyvavimo SHH keliu. Pirma, mes parodė, kad iRNR raiška lygiai Ša kelią susijusių molekulių (Ša, Ptch ir Gli1) buvo reikšmingai didesnis tumorsphere ląstelių nei lipnių ląstelių, o Gli2 buvo didelis išreikšta abiejų ląstelių. Mes taip pat išnagrinėjo raiškos lygius Ša kelias tikslinių genų (Ptch ir Gli1) Vakarų dėmė ir kiekybinius realaus laiko PGR, rezultatai buvo panašūs į RT-PGR. Antra, slopinimas SHH rūšyse veiklumą cyclopamine ar 5E1 lėmė sumažėjęs savarankiškai atnaujinti gebėjimus ir padidėjęs jautrumas narkotikų HGC 27 tumorsphere ląstelės, tačiau šis poveikis nebuvo ryškus lipnių ląstelių. In vivo visose pelių, gydomi oksaliplatinos navikai buvo gerokai mažesnis nei ne gydomi oksaliplatinos, po gydymo cyclopamine ar 5E1, naviko atsakas į chemoterapiniais vaistais buvo sustiprintas. Šie duomenys rodo, kad nors standartiniai chemoterapiniai vaistai atidėtas naviko išaugą gydymo, kai jie buvo kartu su cyclopamine metu, chemoterapijos veiksmingumas buvo daug didesnis ir taip pat daugiau patyrė po gydymo nutraukimo.

Galiausiai, mes naudojamas pirminis navikas mėginiai analizuoti funkcinius aspektus SHH keliu skrandžio CSLCs. Rezultatai parodė, kad tumorsphere ląstelės skrandžio vėžio pavyzdį taip pat turėjo Atsparumas cheminėms ir tumorogeniškas pajėgumus, be to SHH kelias blokavimas sumažino tumorsphere ląstelių Atsparumas cheminėms ir tvirčiau naviko atsaką į narkotikų in vivo.

Kaip ir Atsparumas cheminėms, keli bruožai CSCS gali juos sunku pašalinti. CSCS, yra gana ramus ir tai leidžia jiems pabėgti nuo chemoterapinių schemas, paprastai taikomoms aktyviai važinėjimo dviračiu ląsteles. Be to, kaip matyti jų normalaus kolega, buvo pasiūlytos CSCS eksponuoti aukšto lygio išraiška daugeliui vaistų transporteris šeimos genus, greičiausiai todėl efektyviau ištekėjimo gydymo chemoterapiniais vaistais ir įgimto naviko atsparumą daugeliui vaistų, be to, signalizacijos būdus, pavyzdžiui, WNT, ežys ar klasės, yra dysregulated į CSCS pirmaujančių auglių vystymuisi. Todėl efektyvaus terapinį metodą kurti reikia skiriamojo molekulinės kelius veikiančių CSCS identifikavimą ir agentų tapatybės, kuri gali arba blokuoti "CSC platinimo rizika, arba sukelti CSC diferenciaciją, taip padidinant jautrumą chemoterapiniais vaistais. Taigi, svarbiausi veiksniai, darantys įtaką CSCS Atsparumas cheminėms yra neatsiejami veiksniai. Mikroaplinka, ar nišą, gali turėti įtakos CSCS gebėjimas daugintis, migruoti ar įsiveržti. Niša yra įtvirtinimas svetainę CSCS, ir adhezijos molekulių ar mikroklimato tirpių molekulių, įskaitant augimo faktoriais ir citokinais, gali reikšmingai prisidėti prie refraktoriškumui į gydymą. Nors slopinimas SHH keliu iki cyclopamine ar 5E1 būtų naudinga strategija, mūsų tyrime mes parodė, kad receptorius komponentas Ptch ir transkripcijos faktorius Gli1 taip pat buvo didelis išreikštas tumorsphere ląsteles. Taigi, Ptch arba Gli1 gali būti alternatyva tikslas gydant skrandžio vėžio. Vienas iš galimų strategija yra naudoti sirnr (siRNA) arba shRNR specifinis Ptch ar Gli1, bet skrandžio CSLCs į tumorsphere ląstelių nebuvo visiškai išvalytas, turime toliau valo skrandžio CSLCs, todėl šis darbas bus daroma mūsų toliau tyrimas.

Taigi, mes parodė, kad SHH kelias gali būti įtraukti į savęs atnaujinimo, platinimo, atsparumo vaistams ir tumorogeniškas iš tumorsphere ląsteles ir leidžia manyti, kad strategijos, kuriomis siekiama slopina Ša kelius atstovauti Loginis terapinis metodas nukreipti skrandžio CSCS.

medžiagos ir metodai

gyvūnų etikos taisyklės

Vyras athymic nuogas pelėmis (nu /nu), nuo 6 iki 8 savaičių amžiaus, buvo gauti iš Pekino Vital-upės lab gyvūnų Technology Co Ltd "(SCXK Jing 2007-0001) ir buvo laikomi pagal patogenais neužkrėstų sąlygų barjeras gyvūnų galimybe. Visi pelėms buvo atlikta pagal patvirtintas gaires laboratorinių gyvūnų centras akademijos Karo medicinos mokslų (SYXK JUN 2002-001).

Kultūra lipnių ląstelių, tumorspheres ir sub-tumorspheres

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC-27, MSV-803 ir MKN-45), pagaminti iš Pekino Sąjungos medicinos koledžo buvo kultivuojamos 1640 terpėje, turinčioje 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) ir padengtas pasibaigus 1 × 10 ^{6 gyvų ląstelių tankio už 75 cm 2 kolbą. Kai ląstelės pridedamas, mes passaged juos ant santakoje. Tumorspheres buvo gautos, patalpinant prilipusios ląsteles į serumo neturinčioje 1640 mitybinės terpės sudėtyje yra 1% N-2 priedas (Invitrogen), 2% B-27 priedas (Invitrogen), 1% antibiotikų mišinio (Gibco), 20 ng /ml žmogaus FGF -2 (Chemicon), ir 100 ng /ml EGF (Chemicon), ir prisitvirtinę ląstelės buvo talpinami i 24 šulinėlių ultra žemos tvirtinimo plokštės (Corning) ne 500 ląstelių viename gerai. 2 savaičių plokštelės buvo analizuojami tumorspheres formavimo ir buvo įvertinami naudojant apverstos mikroskopą (Olympus) 40 × iki 100 × priartinimas.}

Po pirminės tumorspheres pasiekė maždaug 200-500 ląstelių dydį vienam srityje, tumorspheres buvo atskirti tuo 1000 ląstelių skaičius viename mililitre ir 100 pL vieno ląstelių suspensija buvo sėklomis kiekvienoje 24 šulinėlių ultra žemos tvirtinimo plokštės (Corning) Na aukščiau aprašytą terpėje serumo neturinčioje tankio. Kiekvienas gerai buvo tiriama vienos ląstelės, ir tik šuliniai, kuriuose buvo vienos ląstelės buvo pažymėtos. 2 savaičių šuliniai buvo analizuojami antriniai tumorspheres formavimas. Normalus prisitvirtinę ląstelės buvo naudojamas kaip valdymo pajėgumų formuoti pakomitečius tumorspheres. Norėdami patikrinti ryšį tarp SHH keliu ir sub-tumorspheres formavimo nuorodą, mes gydė išskirti ląsteles cyclopamine (2,5 mkm, 5 mkm, 10 mikromolių), arba valdymo tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) arba kontroliuoti PBS ir stebėjo formavimas sub-tumorspheres.

skrandžio vėžio audinio pavyzdys

žmogaus šviežios, sterilus skrandžio vėžio audinio mėginiai buvo gauti laikantis etinių standartų institucinės komiteto žmogaus eksperimentavimo iš 15 pacientų (amžiaus diapazonas 70-85 metų) išgyvena skrandžio vėžio rezekcijos, gavęs sutikimą iš pacientų (lentelė S3).

Tada bandiniai buvo panardintas į 95% etanolio 2-3 sek išvengti užteršimo ir išplauti su fosfato-buferio druskų tirpalo (PBS) ir antibiotikų kelis kartus, kad kraujo pašalinti. Po šių, nuo vėžio audinių pavyzdžių paviršius buvo pašalintas ir vidiniai dalys buvo supjaustyti 1-3 mm ^{3 dydžio gabalėliais. Tada jie buvo supūdytos kolagenazės ir dispazės tirpalo 37 ° C temperatūroje, po to, kai 4 h inkubacijos, tirpalas, kurio sudėtyje Virškinant audinius buvo centrifuguoti ir taip pašalinti kolagenazė tirpalą. Ląstelių nuosėdos buvo plaunamas vieną kartą 1640 terpėje prieš sustabdytas į serumo neturinčioje 1640 terpėje, turinčioje 1% N-2 papildų, 2% B-27 papildų, 1% antibiotikų mišinio, 20 ng /ml žmogaus FGF-2, 100 ng /ml, bendras EGF ir padengtą į 24 šulinėlių ultra žemos tvirtinimo plokštelės. Visos kultūros buvo inkubuojami 37 ° C inkubatoriuose tiekiama drėkinamame oro ir 5% CO _2.}

Ankoridžas nepriklausomas augimo tyrimas

toliau stebint savarankiškai atnaujinimo pajėgumus, minkštas agaras tyrimas buvo naudojamas, norint nustatyti kolonijų susidarymo tumorsphere ląstelių ir lipnių ląstelių pagal tvirtinimo-nepriklausomas sąlygomis. Kiekvienas iš šešių-šulinėlių plokštelės gerai buvo padengtas 1 ml 10% FBS 1640 terpėje, turinčioje 1% agarozės. Po to, kai 20 min inkubuojamos 37 ° C temperatūroje, lygios numeriai (500) iš tumorsphere ląstelių ar greta esančiais ląstelių buvo pridėta 1 ml 10% FBS 1640 terpėje, turinčioje 0,5% agarozės. Norėdami patikrinti ryšį tarp SHH keliu ir kolonijų susidarymo pagal tvirtinimo nepriklausomas sąlygomis nuorodą, mes gydė išskirti ląsteles cyclopamine (2,5 mkm, 5μM, 10μM) arba kontrolės tomatidine, 5E1 (10 ug /ml), arba kontroliuoti PBS.

• PLoS ONE: WNT /β-kateninai Signalizacijos Pagerina ciklooksigenazę-2 (COX2) transkripcijos veikla Skrandžio vėžio ląsteles
• PLoS ONE: skaičiavimo metodas prognozuojant šalinimo baltymų ir taikymo identifikavimo skrandžio vėžio žymenų šlapime