PLOS ONE: Sonic Hedgehog Pathway är viktigt för underhåll av cancer Stem-liknande celler i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Onormal aktivering av Sonic hedgehog (SHH) -vägen har beskrivits i ett stort antal olika humana cancrar och i cancerstamceller (CSCs), emellertid, har rollen av SHH-vägen i gastrisk CSCs inte rapporterats. I denna studie undersökte vi möjligheten att onormal aktivering av SHH-vägen bibehålls egenskaperna hos gastriska CSCs. Först identifierade vi cancer stamceller-liknande celler (CSLCs) från humana magcancer-cellinjer (HGC-27, MGC-803 och MKN-45) med tumorsphere kultur. Jämfört med vidhäftande celler, de flytande tumorsphere cellerna hade mer självförnyande kapacitet och chemoresistance. De celler som uttrycker CSCs markörer (CD44, CD24 och CD133) var också betydligt mer tumorsphere celler än i vidhäftande celler. Ännu viktigare, in vivo xenograft studier visade att tumörer skulle kunna genereras med 2 x 10 ^{4 tumorsphere celler, som var 100-faldigt mindre än de som krävs för tumörer sådd av vidhäftande celler. Därefter RT-PCR och Western blot visade att expressionsnivåer av Ptch och GLI1 (SHH väg målgener) var signifikant högre i tumorsphere celler än i vidhäftande celler. Resultaten av kvantitativ realtids-PCR var liknande de i RT-PCR och Western blöt. Ytterligare analyser visade att SHH vägen blockeras av cyklopamin eller 5E1 orsakade en högre minskning av självförnyande förmåga HGC-27 tumorsphere celler än av vidhäftande celler. Vi fann också att SHH vägen blockerar kraftigt förbättrat effektiviteten av kemoterapeutiska läkemedel i HGC-27 tumorsphere celler in vitro och in vivo men hade ingen signifikant effekt på vidhäftande celler. Slutligen isolerade vi tumorspheres från magcancer prov, dessa celler hade också chemoresistance och tumörframkallande förmåga, och SHH vägen underhålls mag CSLCs egenskaper tumorsphere celler från primära tumörprover. Sammanfattningsvis våra data antydde att SHH-vägen var väsentlig för bibehållande av CSLCs i human magcancer}

Citation:. Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway är viktigt för underhåll av cancer Stem-liknande celler i Human magcancer. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

Redaktör: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

emottagen: November 27, 2010; Accepteras: 10 februari 2011. Publicerad: 4 mars 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National högteknologi forsknings- och utvecklingsprogram Kina (È6AA402A04,È6AA02A107), Major State Basic Research Program of China (È9CB521704) och National Nature Science Foundation of China (.872.468,.873.031). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

CSCs spelar en viktig roll i utvecklingen av cancer, denna subpopulation inom tumör besitter egenskaperna hos självförnyande kapacitet chemoresistance och tumörframkallande förmåga kan således spela en avgörande roll i initiering, progression och återfall av cancer. Undersöka och manipulera de biokemiska vägar som är involverade i dessa egenskaper är ett av de bästa sätten att bidra till CSCs, vilket leder till utveckling av nya läkemedel och behandlingsprocedurer. SHH vägen spelar en avgörande roll i många CSCs, såsom glioblastoma stamceller [1], [2], CD34 + leukemiceller [3], [4] och bröst CSCs [5], dessutom är det viktigt att utveckla och homeostas funduskörtlar [6], kan onormal aktivering av SHH vägen resultera i magcancer [7], [8], är dock inte klart vilken roll SHH väg i magsäcken CSCs.

SHH väg i däggdjursceller medieras av ligander Shh [9]. I frånvaro av Shh, transmembranreceptor lappade (Ptch) hämmar aktiviteten hos en annan transmembranproteinet, Smoothened (Smo), vilket resulterar i inaktivering av SHH väg [9], [10]. Bindning av Shh till Ptch upphäver den hämmande effekten av Ptch och Smo är derepressed, varitranskriptionsfaktor Gli (GLI1, Gli2 och Gli3) aktivering [9], [10]. GLI1 är en stark positiv aktivator nedströms målgener och är själv en transkriptions mål av SHH väg [11]. Därför GLI1 betraktas som en markör för SHH vägen onormal aktivering [10], [12]

På senare tid har flera olika typer av CSCs eller CSLCs identifierats och isolerats från maligna tumörer [13] - [25].. I magcancer, metodiskt, är det svårt att isolera och förstärka CSCs från cellinjer eller tumörvävnadsprover. För närvarande förefaller CD44 vara den mest användbar markör för prospektiv rening av gastriska CSCs, är det emellertid inte mycket specifik för gastriska CSCs [26].

I denna studie isolerades vi CSLCs från human gastrisk cancercellinjer (HGC-27, MGC-803 och MKN-45) med användning av tumorsphere odling i serumfritt medium och identifierade självförnyelse kapacitet, chemoresistance och tumörframkallande förmågan hos de tumorsphere celler; Därefter undersökte vi uttrycket av Shh pathway relaterade molekyler, inklusive Shh Ptch, SMO, GLI1 och Gli2 i tumorsphere celler och vidhäftande celler, särskilt ett uttryck för Ptch och Gli1.Then, blockerade vi SHH väg genom cyklopamin eller kontroll tomatidine, 5E1 eller styra PBS att undersöka om egenskaperna hos CSLCs i tumorsphere celler upprätthölls av onormal aktivering av SHH vägen. Slutligen utnyttjade vi primära magcancer prover för att analysera funktionella aspekter av SHH väg i mag CSLCs.

Cyklopamin är en cell genomträngligt steroid alkaloid. Det stör kolesterol bio-syntes och specifikt antagoniserar SHH signalväg genom direkt interaktion med Smo (smoothened), en avlägsen släkting till G-proteinkopplade receptorer. Det är ett värdefullt verktyg för att studera engagemang SHH signalering i utvecklingen av olika tumörer. Tomatidine är ett steroidalt alkaloid som strukturellt liknar cyklopamin, men saknar förmåga att hämma SHH signalering. Det kan användas som en negativ kontroll. 5E1 är en anti-Hh monoklonal antikropp, som neutraliserar SHH och IHH aktivitet.

Resultat

1. Tumorsphere celler hade egenskaperna hos CSLCs

Vi växte HGC-27, MGC-803 och MKN-45 vidhäftande celler i serumfritt medium som beskrivs i metodavsnittet. Efter 7 dagar, var tumorspheres bestående av ungefär 50 till 100 celler observerades (Fig. 1 A).

självförnyande kapaciteten hos dessa tumorspheres bedömdes genom att dissociera dem till en enda cell och växer i en klonal täthet av 1000 celler per milliliter. Efter 2 veckor, enda cell härledd från HGC-27 tumorsphere celler genererade under tumorspheres på 41,83% ± 3,13% jämfört med 8,17% ± 2,40% av fastsittande celler, dessutom, i MGC-803 och MKN-45, den under tumorspheres bildning hastighet av tumorsphere celler var också högre än den för vidhäftande celler. (Fig. 1B). Dessa data antydde att den självförnyande förmåga tumorsphere celler var signifikant högre än den för vidhäftande celler. Tumorsphere celler visade också en ökad förmåga att bilda kolonier enligt förankringsoberoende förhållanden i en vanlig mjuk agar analys efter 14 dagar i HGC-27 och MKN-45 (Fig. 1C).

Vi utförde också en begränsande utspädning analys för sfäroider bildning med användning av HGC-27 tumorsphere celler och vidhäftande celler, respektive. Såsom visas i tabell S1, kunde ca 27-35% av tumorsphere celler producerar sfäroider, medan mindre än 5% av adherenta celler kan generera sfäroider efter 3 veckors odling. Därför, i HGC-27 tumorsphere celler, kan vi uppskatta att sfäroiderna-bildande celler befolkning bestod högst 35%.

Chemoresistance är en annan egenskap hos CSCs, så vi undersökte huruvida en skillnad i chemoresistance existerade mellan tumorsphere celler och vidhäftande celler. Resultaten visade att, efter 48 timmar, tumorsphere celler uppvisade väsentligt större motståndskraft mot läkemedel jämfört med vidhäftande celler under samma betingelser (Fig. 1D). Vi bedömde också chemoresistance av HGC-27 tumorsphere celler och vidhäftande celler till olika koncentrationer av läkemedel, dock både tumorsphere celler och vidhäftande celler inte visar signifikant chemoresistance till droger i ett dosberoende sätt (Fig. S1).

Därefter undersökte vi uttrycket av CD44 i dissocierade tumorsphere celler och vidhäftande celler med hjälp av immunofluorescensanalys och Western blot. Resultaten visade att de celler som uttrycker CD44 var signifikant mer i tumorsphere celler än i adherenta celler (Fig. 2A). Dessutom var uttryck av andra CSCs markörer (CD24 och CD133) i tumorsphere celler och vidhäftande celler undersöktes genom western blöt, jämfört med tumorsphere celler, expressionen av CD24 var signifikant lägre i vidhäftande celler, medan uttrycket av CD133 var liknande (fig . 2B). Vidare fraktione vi HGC-27 cell genom FACS sortering för CD44, fann vi att CD44 (+) cellfraktion skulle kunna generera fler sfäroida kolonier jämfört med CD44 (-) cellfraktionen dessutom storleken på sfäroida kolonier från CD44 (+) celler var större än de från CD44 (-) (Fig. 2C). celler

2. Tumorsphere celler kan generera tumörer vid xenotransplantation

För xenograftstudier, lika många (2 x 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) nyligen dissocierade tumorsphere celler eller kontroll vidhäftande celler injicerades sc i varje mus (6 möss per grupp). Resultaten visade att tumörer genererades med 2 x 10 4 tumorsphere celler, som var 100-faldigt mindre än de som krävs för tumörsådd av vidhäftande celler (tabell 1). Dessutom tumorsphere celler genererade subkutana tumörer med större volym och kortare tid jämfört med de som genereras från adherenta celler (fig. 3A, B). Således, subkutan injektion av lågt antal tumorsphere celler bekräftade att sfäroida cellerna behöll starkare tumorigena kapacitet i nakna möss än vidhäftande celler}

H &. E undersökning av xenotransplantat som härrör från HGC-27 tumorsphere celler visade att dessa tumörer noga liknade den ursprungliga human tumör, som huvudsakligen innehåller differentierade celler (Fig. 3C). Viktigt är tumorspheres kunde åter härrör från xenotransplanted tumörer (fig. 3D), och de kunde bilda tumörer igen (Fig. 3E). Dessa data indikerade därför att tumorsphere cellerna representerade CSLCs som hade tumörframkallande förmåga.

3. SHH vägen var högre uttryckt i tumorsphere celler än i vidhäftande celler

För att undersöka sambandet mellan SHH vägen och CSLCs egenskaper tumorsphere celler undersökte vi mRNA uttryck av Shh pathway relaterade molekyler, inklusive Shh Ptch, smo, GLI1 och Gli2 med RT-PCR. Resultaten visade att alla mRNA hög uttryckt i HGC-27 tumorsphere celler. Jämfört med tumorsphere celler, var de expressionsnivåer av Shh, Ptch, Smo och GLI1 betydligt lägre i vidhäftande celler, medan expressionsnivåer av Gli2 liknade tumorsphere celler. I MGC-803 och MKN-45, var de expressionsnivåer av Shh, Ptch och GLI1 också signifikant lägre i adherenta celler än i tumorsphere celler, medan expressionsnivåer av Smo och Gli2 hade ingen signifikant skillnad mellan adherenta celler och tumorsphere celler (Fig . 4A).

I SHH vägen Ptch och GLI1 är målgener, de betraktas som viktiga markörer för SHH vägen onormal aktivering. Så har vi granskat ytterligare uttrycksnivåer Ptch och GLI1 genom Western blot och kvantitativ realtids-PCR.

När du använder Western blöt, fann vi att de expressionsnivåer av Ptch och GLI1 var också högre i tumorsphere celler än i vidhäftande celler (Fig. 4B). Vi bedömde nästa uttrycksnivåer Ptch och GLI1 i xenografter från HGC-27 genom kvantitativ realtids-PCR. Kvantitativ realtids-PCR-analyser av SHH målgener (ptch och GLI1) uppvisade samma resultat av ovan semikvantitativ RT-PCR (Fig. 4C).

4. SHH väg blockering reducerade självförnyande kapacitet och chemoresistance av HGC-27 tumorsphere celler

För att testa för en eventuell roll SHH vägen i självförnyande förmåga tumorsphere celler använde vi cyklopamin eller kontroll tomatidine, 5E1 eller kontroll PBS för att blockera vägen.

resultaten visade att cyklopamin behandling ledde till en signifikant minskning av kapaciteten för bildandet av under tumorspheres i HGC-27 tumorsphere celler på ett dosberoende sätt, men ingen sådan effekt observerades i adherenta celler (Fig. 5A). Vi utvärderade vidare om behandling med cyklopamin skulle påverka kolonier bildandet kapacitet HGC-27 tumorsphere celler genom förankring -oberoende tillväxtanalys. På liknande sätt, var förmågan att bilda kolonier minskas mer i tumorsphere celler på ett dosberoende sätt i förhållande till de vidhäftande cellerna (Fig. 5B).

Nästa undersökte vi effekten av SHH-vägen på chemoresistance av HGC -27 tumorsphere celler, behandlade vi de dissocierade cellerna med cyklopamin eller kontroll tomatidine under 48 timmar, och därefter läkemedelsresistens av tumorsphere celler utvärderades. När cyklop följdes av droger, resulterade behandlingen i en signifikant förbättrad totalcell dödligheten. De bästa resultaten erhölls när cyklopamin kombinerades med Oxaliplatin plus Mitomycin (Fig. 5C). Ingen sådan synergistisk effekt observerades i vidhäftande celler efter exponering för läkemedel med cyklopamin under 48 timmar (Fig. 5D).

Vi analyserade också effekten av olika koncentrationer av cyklop (2,5 iM, 5 iM, 10 ^ M) på celldöd. Resultaten visade att enbart cyklop att tumorsphere celler kan göra en liten men konsekvent minskning av antalet viabla celler. Jämfört med HGC-27 tumorsphere celler, var effekten av cyklopamin på celldöd till vidhäftande celler större betydelse (Fig. 5C, D).

När SHH vägen blockerades av 5E1 eller styra PBS, resultaten av själv -renewing kapacitet och chemoresistance av tumorsphere celler och vidhäftande celler liknade de som blockeras av cyklopamin eller kontroll tomatidine (Fig. S2).

5. SHH väg blockerar förbättrad tumörrespons för läkemedel in vivo

För att testa denna hypotes in vivo, analyserade vi om SHH väg blockerar förbättrad kemoterapi effektivitet, cyklopamin eller kontroll tomatidine användes för att hämma SHH pathway svar. HGC-27 tumorsphere cellerna fick växa till båda bakre flankerna hos nakna möss, tills den större diametern av tumör nådde ca 2 mm. Möss behandlades därefter två gånger i veckan under 3 veckor med cyklopamin eller kontroll tomatidine 24 timmar före oxaliplatin leverans. I alla behandlade möss, tumörer som behandlades med oxaliplatin var betydligt mindre än de ingen behandlades med oxaliplatin. Dessutom tumörer uppvisade signifikant större tumörtillväxthämning när de behandlades med Oxaliplatin i kombination med cyklopamin, var tumörrespons till kemoterapeutiskt läkemedel förbättras genom cyklopamin (Fig. 6A, B). Vi undersökte också om SHH vägen blockeras av 5E1 eller styra PBS förbättrad kemoterapi effektivitet in vivo, visade resultaten att 10 mikrogram /ml 5E1 behandling ledde till en betydligt större tumörtillväxthämning än de endast behandlades med oxaliplatin (Fig. 6A, B).

Dessa data tyder på att även vanliga kemoterapeutiska läkemedel fördröjd tumörtillväxt under behandlingen, när de kombinerades med cyklopamin eller 5E1, var effekten av kemoterapi avsevärt förbättrad och även mer ihållande efter behandlingsavbrott.

Nästa för att undersöka om blockering SHH väg in vivo hade en viss effekt på HGC-27 tumorsphere celler. Möss endast behandlade cyklopamin på den högra bakre flanken eller kontroll tomatidine vid den vänstra bakre flanken (två gånger i veckan under 3 veckor), när tumörer från HGC-27 tumorsphere celler nådde ca 2 mm, efter 3 veckor, utförde vi en begränsande spädningsanalys för sfäroider bildning med användning av tumörceller som behandlats med cyklopamin och behandlades med tomatidine, respektive. Såsom visas i tabell S2, kunde ungefär 9-15% av cellerna från xenotransplanted tumör behandlad med tomatidine producera sfäroider, medan mindre än 2,5% av celler från xenotransplanted tumör behandlad med cyklopamin kan generera sfäroider. Därför kan blockera SHH väg in vivo minska antalet gastric CSLCs.

6. SHH vägen underhålls mag CSLCs egenskaper tumorsphere celler från primär tumörprover

För att avgöra om SHH väg skulle kunna vara involverade i mag CSCs egenskaper tumorsphere celler från magcancer vävnad, utnyttjade vi primära magcancer prover för att analysera funktionella aspekter av SHH vägen i gastric CSLCs.

först vi växte nyligen dissocierade bulk celler från magcancer exemplar i serumfritt medium som beskrivs i metodavsnittet, efter 10 dagar, tumorspheres observer (Fig. 7A, B). Då vi undersökte chemoresistance och tumörframkallande förmågan hos de tumorsphere celler från magcancer vävnad. Resultaten visade att tumorsphere celler från magcancer vävnad uppvisade signifikant större motståndskraft mot läkemedel än bulk celler under samma betingelser (Fig. 7C). Dessutom, nyligen dissocierade bulk celler från magcancer prover injicerades vid 2 x 10 ^{7-celler per mus var kapabel att etablera subkutana tumörer, medan så lite som 2 × 10 4 av de tumorsphere celler från magcancer prover skulle kunna utgöra tumörer (Tabell 1), de xenografter tumörer som resulterade från injektionen av tumorsphere celler presenterade samma histopatologi funktioner som deras respektive human tumör (Fig. 7F). Dessa resultat visade att tumorsphere celler från magcancer vävnad besatt egenskaper CSLCs. Därefter observerade vi effekten av SHH väg blockering på chemoresistance av tumorsphere celler in vitro och tumörrespons för läkemedel in vivo. Resultaten visade att cyklopamin eller 5E1 kunde resulterat i en avsevärt förbättrad övergripande celldöd hastighet (fig. 7D) och tumören svar på läkemedels (Fig. 7E).}

Diskussion

CSCs delar många egenskaper med vävnads stamceller, såsom självförnyelse, spridning, chemoresistance och är primärt ansvariga för att upprätthålla tillväxten av tumörer [27], [28]. Många forskare har använt fluorescensaktiverad cellsortering för att identifiera och isolera CSCs och fastställt att dessa celler kan bilda sfärer i specialiserad serumfritt medium. I denna studie, tog vi det motsatta tillvägagångssättet genom att utveckla tumorsphere celler och sedan bestämma om dessa celler förvärvade CSCs egenskaper.

Vi använde ett definierat serumfritt medium bestående av EGF, FGF-2, B-27 tillägg och N-2 tillägg för att upprätthålla gastriska cancercellinjer. Dessa villkor har använts tidigare för att upprätthålla endogena neurala stamceller /progenitorceller och tumör stamceller från mänskliga tumörer och tumörcellinjer. Till exempel, Kondo et al. [24] karakteriserade C6 rått-tumörcellinjen in vitro och in vivo och observerade en liten population av stamceller-liknande celler härledda från den väl karakteriserade sido populationen. Setoguchi et al. [29] visade cancer stam-liknande cellpotentialen i andra cancercellinjer, inklusive MCF7 bröstcancerlinjen, B104 neuroblastom, och HeLa adenokarcinom.

I vårt experiment använde vi tre gastriska cancercellinjer (HGC- 27, MKN-45 och MGC-803) till kultur tumorspheres. HGC-27 cellinje bildades genom odling av metastaserande lymfkörtel från en gastric cancerpatient diagnosen histologiska som odifferentierade karcinom. MKN-45 bildades från dåligt differentierade adenocarcinom i magen på en 62-årig kvinna. MGC-803 är en epitelial dåligt differentierad human gastric muko-adenokarcinom cellinje från en 74-årig man.

Två olika metoder har typiskt använts för att identifiera CSCs i publicerade studier [30], [31] . Den ena är en in vitro-metod som går under benämningen "sfäroid kolonibildning" och en annan är in vivo-metod som involverar implantation av kandidat CSCs under huden på möss med immunbrist.

Den förra metoden innebär odling kandidat CSCs i odlingsskålar speciellt belagda för noncell fastsättning med serumfritt medium innehållande epidermal tillväxtfaktor och basisk fibroblasttillväxtfaktor. Tillväxten av sfäriska kolonier efter några veckor anses indikera självförnyelse förmåga, och skulle vara förenligt med en CSC fenotyp. Den senare metoden-tillväxten av celler i möss med immunbrist-behövs för att visa sann tumorigenicitet och betraktas allmänt som den gyllene standarden för att bevisa förekomsten av CSCs. Ett antal studier har antytt att dessa två metoder ger i allmänhet liknande resultat vid utvärdering av kandidat CSCs för många solida tumörer.

För närvarande gastric CSCs har inte specifik yta beslutsfattare, så vi utvecklade tumorsphere celler och bestäms sedan huruvida dessa celler förvärvade CSCs egenskaper, inklusive självförnyande kapacitet chemoresistance och tumörframkallande förmåga.

Våra data visade att gastric cancercellinjer (HGC-27, MGC-803, MKN-45) odlas i ett definierat serum- fritt medium kunde bilda tumorspheres som innehöll celler beter sig som CSLCs. In vitro, tumorsphere celler visade en ökad förmåga att bilda kolonier i mjuk agar enligt förankringsoberoende förhållanden och en ökad förmåga att bilda under tumorspheres. Vi visade också att självförnyelse förmåga att bilda under tumorspheres av HGC-27 tumorsphere celler hade en ökning på passagerna 2 till 8 (från 44,5% till 70,5%), och sedan haft en relativt stabil andel efter åtta eller fler passager när den odlas på klon densitet (Fig. S3). Dessa data antydde att den proliferativa potentialen hos tumorsphere celler bibehölls efter förlängda passager. Dessutom tumorsphere celler in vitro var mer motståndskraftiga mot oxaliplatin och Mitomycin jämfört med vidhäftande celler föreslog dessa uppgifter att tumorsphere celler består av anrikade antal CSLCs, vilket potentiellt gjort dem mindre mottagliga för åtgärder både Oxaliplatin och Mitomycin. In vivo kan tumorsphere celler generera tumörer vid xenotransplantation i högre takt än vidhäftande celler. Dessutom tumorsphere celler genererade subkutana tumörer med större volym och kortare tid jämfört med de som genereras från vidhäftande celler, vilket är viktigt, tumorspheres kunde åter härrör från xenotransplanted tumörer, och de skulle kunna utgöra tumör igen föreslog dessa data att tumorspheres anrikades i CSLCs .

i vår studie, vidhäftande celler förmodligen innehöll en relativt låg andel av CSCs, eftersom ingen metod för isolering eller avlägsnande av dessa celler användes. Det kan hävdas att det är denna lilla population av CSCs som är ansvarig för tumörbildning. Oavsett, mera CSCs kunde konstateras hos tumorsphere celler, som kan förklara dess mer aggressivt beteende.

Nästa undersökte vi om de egenskaper hos CSLCs i tumorspheres bibehölls av onormal aktivering av SHH-vägen. Först visade vi att mRNA expressionsnivåer av Shh pathway relaterade molekyler (Shh, ptch och GLI1) var signifikant högre i tumorsphere celler än i vidhäftande celler, medan Gli2 var hög uttryckt i båda cellerna. Vi undersökte vidare uttrycksnivåer Shh väg målgener (ptch och GLI1) med Western blöt och kvantitativ realtids-PCR, var resultaten liknande de i RT-PCR. För det andra, hämning av SHH väg aktivitet genom cyklopamin eller 5E1 ledde till minskad självförnyelse kapacitet och ökad känslighet för läkemedel i HGC-27 tumorsphere celler, men dessa effekter inte uttalas i vidhäftande celler. In vivo, i alla behandlade möss, tumörer som behandlades med oxaliplatin var betydligt mindre än de ingen behandlades med oxaliplatin, efter behandling med cyklopamin eller 5E1, var tumörrespons till kemoterapeutiska läkemedel förbättras. Dessa data tyder på att även vanliga kemoterapeutiska läkemedel fördröjd tumörtillväxt under behandlingen, när de kombinerades med cyklopamin, var effekten av kemoterapi avsevärt förbättrad och även mer ihållande efter behandlingsavbrott.

Slutligen utnyttjade vi primär magcancer prov för att analysera de funktionella aspekterna av SHH väg i mag CSLCs. Resultaten visade att tumorsphere celler från magcancer prov hade också chemoresistance och tumörframkallande förmåga, dessutom SHH väg blockering minskade chemoresistance av tumorsphere celler och ökad tumörrespons för läkemedel in vivo.

för chemoresistance, flera funktioner i CSCs kan gör dem svåra att eliminera. CSCs är relativt lugn och detta gör det möjligt att fly från kemoterapeutiska regimer som normalt riktar aktivt cyklande celler. Dessutom, som visas för deras normala motsvarighet, CSCs har föreslagits för att uppvisa hög nivå uttryck av multitransportören familj gener, sannolikt resulterar i en effektivare utflöde av kemoterapeutiska läkemedel och medfödda multiresistens, dessutom signaleringsvägar som Wnt, Hedgehog eller notch är oreglerad i CSCs leder till tumörutveckling. Utvecklingen av en effektiv terapeutisk metod skulle därför kräva identifiering av distinkta molekylära vägar som är verksamma inom CSCs och identifiering av medel som kan antingen blockera CSC proliferation eller inducera CSC differentiering, vilket ökar känsligheten för kemoterapeutiska läkemedel. Så viktiga faktorer som påverkar chemoresistance av CSCs är inneboende faktorer. Mikromiljön, eller nisch, kan påverka förmågan av CSCs att proliferera, migrera eller invadera. Den nisch är en ankarplats för CSCs och adhesionsmolekyler eller microenvironmental lösliga molekyler, inklusive tillväxtfaktorer och cytokiner, kan avsevärt bidra till refraktäritet för terapi. Trots att hämning av SHH vägen genom cyklopamin eller 5E1 skulle vara en användbar strategi, i vår studie visade vi att receptorkomponent Ptch och transkriptionsfaktor GLI1 också hög uttrycktes i tumorsphere celler. Så Ptch eller GLI1 kan vara ett alternativ målprotein för behandling av magsäckscancer. En möjlig strategi är att använda små störande RNA (siRNA) eller shRNA specifikt för Ptch eller GLI1, men gastric CSLCs i tumorsphere celler har inte varit helt renad, måste vi ytterligare rena mag CSLCs, så detta arbete kommer att ske i vår vidare studie.

Sammanfattningsvis visade vi att SHH vägen kan medverka i självförnyelse, spridning, läkemedelsresistens och tumörframkallande av tumorsphere celler och föreslår att strategier som syftar till att hämma shh vägar representerar en logisk terapeutisk metod för att rikta gastric CSCs.

Material och metoder

Animal Ethics Uttalande

Man atymiska nakna möss (nu /nu), 6 till 8 veckor gamla, erhölls från Peking Vital-floden Lab Animal Technology Co. Ltd (SCXK JING 2007-0001) och inhystes i patogenfria förhållanden i barriärdjuranläggning. Alla möss genomfördes inom ramen för godkända riktlinjer försöksdjurs Center of Academy of Military Medical Sciences (SYXK juni 2002 till 001).

Kultur vidhäftande celler, tumorspheres och sub-tumorspheres

Human magcancer cellinjer (HGC-27, MGC-803 och MKN-45) erhållna från Peking Union Medical College odlades i 1640-medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och ströks ut vid en densitet av 1 x 10 ^{6 levande celler per 75 cm 2 kolv. När cellerna fäst, passe vi dem på sammanflödet. Tumorspheres härleddes genom att placera de vidhäftande cellerna till serumfritt 1640 odlingsmedium innehållande 1% N-2 supplement (Invitrogen), 2% B-27 supplement (Invitrogen), 1% antibiotisk blandning (Gibco), 20 ng /ml humant FGF -2 (Chemicon), och 100 ng /ml EGF (Chemicon), och de vidhäftande cellerna ströks ut i 24-brunnars ultralåg fästplatta (Corning) vid 500 celler per brunn. 2 veckor senare, var plattorna analyserades med avseende tumorspheres bildning och kvantifierades med ett inverterat mikroskop (Olympus) vid 40 × och 100 gångers förstoring.}

Efter primära tumorspheres nådde storleken på cirka 200-500 celler per sfär, den tumorspheres dissocierades vid en densitet av 1000 celler per milliliter och 100 mikroliter enkelcellsuspension ympades i varje brunn i 24-brunnars ultralåg fästplatta (Corning) i serumfritt medium som beskrivits ovan. undersöktes varje brunn för enskild cell, och endast de brunnar som innehöll enda cell markerades. 2 veckor senare, var brunnar analyserades med avseende under tumorspheres formation. Normala vidhäftande celler användes som kontroll för förmågan att bilda under tumorspheres. För att testa kopplingen mellan SHH vägen och bildandet av under tumorspheres, behandlade vi dissocierade celler med cyklop (2,5 pM, 5 pM, 10 pM) eller kontroll tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) eller kontroll PBS och observerade bildandet under tumorspheres.

magcancer vävnadsprov

de humana färska, sterila magcancer vävnadsprover erhölls i enlighet med de etiska normer i det institutionella utskottet för mänskliga experiment från 15 patienter (ålder intervallet 70-85 år) som genomgår en magcancer resektion, efter att ha erhållit informerat samtycke från patienterna (Tabell S3).

Då proverna nedsänktes i 95% etanol under 2-3 sekunder för att undvika kontaminering, och tvättas med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och antibiotika flera gånger för att avlägsna blodet. Efter dessa ades ytan av cancervävnadsprov tas bort och de inre delarna skars i 1-3 mm ^{3 stora bitar. Alltså de digere i kollagenas och dispas-lösning vid 37 ° C, efter 4 h inkubation, lösningen innehållande de digererade vävnaderna centrifugerades för att avlägsna kollagenaslösning. Cellpelleten tvättades en gång med 1640-medium innan de suspenderades i serumfritt 1640-medium innehållande 1% N-2 supplement, 2% B-27 supplement, ett% antibiotisk blandning, 20 ng /ml humant FGF-2, 100 ng /ml EGF och ströks ut i 24-brunnars ultralåg fästplatta. Alla kulturer inkuberades vid 37 ° C i kuvöser levereras med fuktad luft och 5% CO _2.}

förankringsoberoende tillväxtanalys

För att observera självförnyande kapaciteten ytterligare, mjuk agar analys användes för att bestämma den kolonier bildningen av tumorsphere celler och adherenta celler under förankringsoberoende förhållanden. Varje brunn i en sex-brunnar belades med 1 ml 10% FBS 1640-medium med 1% agaros. Efter 20 min av inkubation vid 37 ° C, var lika antal (500) av tumorsphere celler eller vidhäftande celler tillsattes i 1 ml av 10% FBS 1640-medium med 0,5% agaros. För att testa kopplingen mellan SHH vägen och kolonier bildning i förankringsoberoende förhållanden, behandlade vi dissocierade celler med cyklop (2,5 ^ M, 5 ^ M, 10

• PLOS ONE: Wnt /β-catenin Signa Förbättrar cyklooxygenas-2 (COX-2) transkriptionsaktiviteten i Gastric Cancer Cells
• PLOS ONE: En beräkningsmetod för prediktion av utsöndringsproteiner och tillämpning till Identifiering av Gastric cancermarkörer i urin