Plos ONE: Sonic Hedgehog Pathway je bistvenega pomena za vzdrževanje rakavih matičnih-Like celice v humani Rak želodca

Povzetek

Nenormalno aktivacija Sonic jež (SHH) pot je opisana v različnih človeških raka in raka matičnih celic (FT), pa ima vlogo Pst poti v želodčnem CSCS niso poročali. V tej študiji smo raziskovali možnost, da nenormalno aktiviranje Pst poti ohranila značilnosti želodca FT. Najprej smo ugotovili raka matične podobne celice (CSLCs) iz človeških želodčnega raka celičnih linijah (HGC-27, MGC-803 in podjetja MKN-45), ki uporabljajo tumorsphere kulture. V primerjavi z oprijetih celic, plavajoči tumorsphere celice imel več samostojno obnovi zmogljivosti in chemoresistance. Celice, ki izražajo CSCS markerjev (CD44, CD24 in CD133) so bile tudi v tumorsphere celicah bistveno več kot v oprijetih celic. Še pomembneje je, in vivo ksenotransplantskih študije so pokazale, da bi lahko tumorji ustvarjeni z 2 x 10 ^{4 tumorsphere celic, kar je 100-krat manjša od tistih, ki veljajo za tumorjev Sejanje s oprijetih celic. Dalje, RT-PCR in Western blot je pokazala, da so bile ravni izraz za Ptch in Gli1 (SHH pot ciljnih genov) v tumorsphere celicah bistveno višja kot v oprijetih celic. Rezultati kvantitativne PCR v realnem času so bili podobni tistim, RT-PCR in Western blot. Nadaljnja analiza je pokazala, da SHH pot blokira cyclopamine ali 5E1 povzročil večje zmanjšanje samostojno obnovi zmogljivosti HGC-27 tumorsphere celic, kot je sprijetih celic. Prav tako smo ugotovili, da SHH pot močno blokira povečati učinkovitost citostatikov v HGC-27 tumorsphere celic in vitro in in vivo, vendar ni pomembno vplivala na oprijetih celicah. Na koncu smo izolirali tumorspheres iz želodca raka vzorcu, je bilo te celice tudi chemoresistance in tumorogeno zmogljivosti in SHH pot ohranilo želodčne CSLCs značilnosti tumorsphere celic iz primarnih vzorcev tumorjev. Skratka, naši podatki kažejo, da je SHH pot bistvena za ohranjanje CSLCs v človeškega raka želodca}

Navedba. Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011), Sonic Hedgehog Pathway je bistvenega pomena za vzdrževanje rakavih matičnih podobne celice v humani želodca raka. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687

Urednik: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Združene države Amerike

Prejeto: 27. november 2010; Sprejeto: 10. februar 2011; Objavljeno: 4. marec 2011

Copyright: © 2011 Song et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni visoki tehnologiji raziskovalnem in razvojnem programu Kitajske (È6AA402A04,È6AA02A107), Major državne Temeljni raziskovalni program Kitajske (È9CB521704) in National Nature Science Foundation Kitajske (Ĵ72468,Ĵ73031). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

CSCS igrajo pomembno vlogo pri razvoju raka, ta podskupina znotraj tumorja ima značilnosti samostojne obnovi zmogljivosti, chemoresistance in tumorogenega zmogljivosti tako lahko igrajo ključno vlogo v začetek, napredovanje in ponovitve raka. Proučevanje in manipulacijo biokemične poti, ki sodelujejo pri teh značilnosti je eden od najboljših načinov prispeva k FT, ki vodijo k razvoju novih zdravil in postopkov zdravljenja. SHH poti igra ključno vlogo v številnih FT, kot glioblastom matičnih celic [1], [2], CD34 + levkemične celice [3], [4] in CSCS dojk [5], poleg tega, da je ključnega pomena za razvoj in homeostaze želodca žleze [6], lahko nenormalno aktiviranje Pst poti povzroči raka želodca [7], [8], vendar pa je vloga Pst poti v želodčnem CSCS ni jasna.

Pst poti v celice sesalcev se posreduje z ligandi Pst [9]. V odsotnosti Pst, transmembranski receptor zakrpati (Ptch) zavira aktivnost drugega transmembranskega proteina, zglajena (SMO), zaradi česar je inaktivacijo Pst poti [9], [10]. Vezava Pssst, da Ptch razveljavlja zaviralni učinek Ptch in SMO je derepressed, s čimer se aktivira transkripcijski faktor Gli (Gli1, Gli2 in Gli3) [9], [10]. Gli1 močna pozitivna aktivator nadaljnjim ciljnih genov in je sama po sebi transkripcijski cilj Pst poti [11]. Zato je Gli1 šteje označevalec Pst pathway nenormalno aktivacijo [10], [12]

V zadnjem času so bile ugotovljene in izolirana od malignih tumorjev več vrst CSCS ali CSLCs [13] - [25].. Pri raku želodca, metodološko, je težko izolirati in širiti CSCS iz celičnih linij ali tumor tkivnih vzorcev. V tem trenutku se zdi, da je najbolj uporaben marker za bodoči čiščenje želodca CSCS CD44, vendar ni zelo specifična za želodčne FT [26].

V tej študiji smo izolirali CSLCs iz človeškega želodca rakave celične linije (HGC-27, MGC-803 in MKN-45), ki uporabljajo tumorsphere gojenje v mediju brez seruma in označene zmogljivosti samo-obnove, chemoresistance in tumorogeno zmogljivosti tumorsphere celic; Naslednji, smo pregledali izražanje Pst, povezanih s procesi molekul, vključno Pst, Ptch, SMO, Gli1 in Gli2 v tumorsphere celic in oprijetih celic, predvsem izraz Ptch in Gli1.Then, smo blokirali Pst pot s cyclopamine ali nadzorni tomatidine, 5E1 ali nadzor PBS, da razišče, ali so značilnosti CSLCs v tumorsphere celicah vzdržuje nenormalno aktivacijo ššš poti. Končno smo uporabili primarne želodčne vzorce raka za analizo funkcionalne vidike Pst poti v želodčnih CSLCs.

Cyclopamine je celica prepustna steroidni alkaloid. To moti holesterola biološko sintezo in posebej antagonist Pst signalno pot skozi neposredno povezavo s SMO (zglajena), daljni sorodnik G-protein-sklopljenih receptorjev. To je dragoceno orodje za proučevanje sodelovanja Pst signalizacije pri razvoju različnih tumorjev. Tomatidine je steroidni alkaloid, ki strukturno podoben cyclopamine, vendar ni sposoben zavre ššš signalizacijo. Se lahko uporablja kot negativno kontrolo. 5E1 je monoklonsko protitelo anti-Hh, ki nevtralizira aktivnost ššš in IHH.

Rezultati

1. Tumorsphere celice imela značilnosti CSLCs

zrasel smo HGC-27, MGC-803 in MKN-45 sprijete celice v mediju brez seruma, opisane v poglavju metode. Po 7 dneh smo opazili tumorspheres sestavljeni iz približno 50 do 100 celic (sl. 1A).

Ocenjen je bil sam obnovi zmogljivost teh tumorspheres da jih razkrajanja v eno celico in raste klonske gostoto 1.000 celic na mililiter. Po 2 tednih, ena celica iz HGC-27 tumorsphere celice, ki nastanejo pod-tumorspheres ob 41.83% ± 3,13% v primerjavi z 8,17% ± 2,40% od oprijetih celic, poleg tega, v MGC-803 in MKN-45 je pod-tumorspheres oblikovanje stopnja tumorsphere celic so bili tudi višja od prilepljenih celic. (Sl. 1B). Ti podatki kažejo, da je sam obnovitvi zmogljivost tumorsphere celic znatno višja od prilepljenih celic. Tumorsphere celice pokazala tudi večjo sposobnost za oblikovanje kolonije pod pritrdišč, neodvisno od razmer v standardnem mehki agar testu po 14 dneh v HGC-27 in MKN-45 (sl. 1C).

Prav tako smo izvedli mejno redčenje test za zrnc tvorbo z uporabo HGC-27 tumorsphere celic in prilepljenih celic, oz. Kot je prikazano v tabeli S1, lahko približno 27-35% od tumorsphere celice proizvajajo zrnc, medtem ko je bilo manj kot 5% sprijetih celic ustvarjajo zrnc po 3 tedne kulture. Zato je v tumorsphere celicah HGC-27, lahko ocenjujemo, da zrnca-celice, ki tvorijo prebivalstvo sestavlja največ 35%.

Chemoresistance je še ena značilnost FT, zato smo raziskali, ali je razlika v chemoresistance obstajala med tumorsphere celice in prilepljenih celic. Rezultati so pokazali, da je po 48 urah, tumorsphere celice dokazano bistveno večjo odpornost na zdravila v primerjavi z oprijetih celic pod enakimi pogoji (sl. 1D). Ocenili smo tudi chemoresistance za HGC-27 tumorsphere celic in oprijetih celic različnih koncentracijah drog pa sta tumorsphere celice in sprijete celice niso bistveno chemoresistance z mamili v modi odvisnosti od odmerka (sl. S1).

Nato smo preučili izražanje CD44 v disociiranih tumorsphere celic in oprijetih celic z uporabo imunofluorescenčni test in Western blot. Rezultati so pokazali, da so bile celice, ki izražajo CD44 na celicah tumorsphere bistveno bolj kot v oprijetih celic (sl. 2A). Poleg tega je bila ekspresija drugih CSCS označevalcev (CD24 in CD133) v tumorsphere celic in oprijetih celic pregledali Western Blot, v primerjavi s tumorsphere celicami, je izraz CD24 bistveno nižja v oprijetih celicah, medtem ko je izraz CD133 podobno (sl . 2B). Poleg tega smo frakcionirali HGC-27 celice, ki jih FACS razvrščanje za CD44, smo ugotovili, da bi lahko CD44 (+) celične frakcije ustvariti več elipsoidne kolonije v primerjavi s CD44 (-) frakcije celic, poleg tega, velikost sferoida kolonij od CD44 (+) celice je bil večji od tistih iz CD44 (-) (. slika 2C). celice

2. Tumorsphere celice lahko ustvari tumorje na ksenotransplantacija

Za študije ksenograftov, enako število (2 x 10 ^{4, 2 x 10 5, 2 x 10 6, 2 x 10 7) sveže ločiti tumorsphere celice ali nadzora prilepljenih celic smo injicirali sc v vsaki miši (6 miši na skupino). Rezultati so pokazali, da so tumorji ustvarjeni z 2 x 10 4 tumorsphere celic, kar je 100-krat manjša od tistih, ki veljajo za tumorsko sejanje ga oprijetih celic (tabela 1). Poleg tega tumorsphere celic ustvarili podkožne tumorje z večjim obsegom in krajšem času, v primerjavi s tistimi, pridobljeno iz sprijetih celic (sl. 3A, B). Tako je podkožna injekcija nizkega števila tumorsphere celic, so potrdili, da elipsoidne celice hranijo močnejši tumorogeno zmogljivosti v golih miših kot oprijetih celic}

H &. E pregled presadkov, ki izhajajo iz HGC-27 tumorsphere celice, je pokazala, da so ti tumorji pozorno podoben prvotni človeški tumor, v glavnem vsebuje diferenciranih celic (sl. 3c). Pomembneje, tumorspheres lahko ponovno pridobljeni iz xenotransplanted tumorjev (sl. 3D), in so lahko ponovno dobimo tumor (sl. 3E). Ti podatki torej pokazala, da so tumorsphere celice zastopa CSLCs, ki so imele tumorogeno zmogljivosti.

3. SHH pot je bila višja izražen v tumorsphere celicah kot v oprijetih celic

Da bi raziskali povezavo med SHH procesi in CSLCs značilnosti tumorsphere celic, moramo najprej preučiti izražanje mRNA za SHH, povezanih s procesi molekul, vključno Pst, Ptch, SMO, Gli1 in Gli2 RT-PCR. Rezultati so pokazali, da so bili vsi mRNA visoko izraženo v HGC-27 tumorsphere celic. V primerjavi z tumorsphere celic, so bile ravni izraz za SHH, Ptch, SMO in Gli1 bistveno nižja v oprijetih celicah, medtem ko so stopnje izraženosti v Gli2 podobna tumorsphere celice. V MGC-803 in MKN-45, so bile tudi stopnje izraženosti v SHH, Ptch in Gli1 bistveno nižja v oprijetih celicah kot v tumorsphere celicah, medtem ko se stopnje izraženosti za SMO in Gli2 ni pomembno razliko med oprijetih celice in tumorsphere celice (Slika . 4A).

Tiho poti, Ptch in Gli1 so ciljni geni, ki se štejejo za pomembne označevalcev SHH poti, v nenormalno aktivacijo. Torej, smo podrobneje proučiti raven izražanja Ptch in Gli1 po Western blot in kvantitativno PCR v realnem času.

Pri uporabi Western Blot, smo ugotovili, da so bile ravni izraz za Ptch in Gli1 tudi večja tumorsphere celicah kot v oprijetih celicah (sl. 4B). Mi poleg ocenil raven izražanja Ptch in Gli1 v ksenograftih od HGC-27 s kvantitativno PCR v realnem času. Kvantitativni PCR v realnem času analize Pst ciljnih genov (PTCH in GLI1) je pokazala enake rezultate zgoraj semi-kvantitativno RT-PCR (slika. 4C).

4. SHH pot blokiranje zmanjšala samostojno obnovi zmogljivost in chemoresistance za HGC-27 tumorsphere celice

Za testiranje za morebitno vlogo Pst poti v samostojno obnovi zmogljivosti tumorsphere celic smo uporabili cyclopamine ali nadzor tomatidine, 5E1 ali nadzor PBS, da blokira pot.

Rezultati so pokazali, da je zdravljenje cyclopamine privedlo do znatno zmanjšanje zmogljivosti za oblikovanje sub-tumorspheres v HGC-27 tumorsphere celic v modi odvisnosti od odmerka, vendar je ta učinek ne opazili v oprijetih celicah (sl. 5A). Nadalje smo ocenili, ali bi zdravljenje s cyclopamine vpliva na zmogljivost kolonije nastajanja HGC-27 tumorsphere celic z pritrditve -independent testu rasti. Prav tako je bila sposobnost za tvorbo kolonije več v tumorsphere celicah zmanjša v odvisnosti od odmerka mode glede na sprijetih celic (sl. 5B).

Nato smo raziskovali vpliv Pst poti na chemoresistance od HGC -27 tumorsphere celice, smo obravnavala ločiti celice cyclopamine ali nadzorni tomatidine 48 ur, nato pa je bila ocenjena odpornost zdravilo tumorsphere celic. Ko je bil cyclopamine sledi drog, zdravljenje povzročilo znatno izboljšano splošno stopnjo celične smrti. Najboljše rezultate smo dobili, ko smo cyclopamine kombinaciji z oksaliplatinom plus mitomicin (sl. 5C). Nobena taka sinergijski učinek smo opazili pri oprijetih celicah po izpostavljenosti z zdravili s cyclopamine za 48 ur (sl. 5d).

testiramo tudi učinek različnih koncentracij cyclopamine (2,5 um, 5 um, 10 uM) na smrt celic. Rezultati so pokazali, da bi cyclopamine zgolj na tumorsphere celice da majhno, a dosledno zmanjšanje števila vitalnih celic. V primerjavi s celicami HGC-27 tumorsphere, je bil učinek cyclopamine na celične smrti v oprijetih celic več pomena (sl. 5C, D).

Ko se je SHH pot blokira 5E1 ali nadzor PBS, rezultate sebe -renewing zmogljivosti in chemoresistance od tumorsphere celic in oprijetih celicah, so bili podobni tistim blokiral cyclopamine ali nadzor tomatidine (sl. S2).

5. SHH pot blokira izboljšan odziv tumorja na drog in vivo

Da bi preverila to hipotezo in vivo, smo analizirali, ali je SHH pot blokira izboljšane učinkovitosti kemoterapijo, cyclopamine ali nadzorno tomatidine uporabljajo za zaviranje ššš poti, odgovore. HGC-27 tumorsphere Celice pustimo, da rastejo v obe zadnji boki golih miših, dokler ne doseže večji premer tumorja približno 2 mm. Miši so nato obdelali dvakrat na teden 3 tedne z cyclopamine ali nadzora tomatidine 24 ur pred dobavo oksaliplatin. V vseh obdelanih miših so tumorji, zdravljeni z oksaliplatinom bistveno manjša od tiste, ki niso obdelani z oksaliplatinom. Poleg tega, tumorji so pokazali znatno večjo inhibicijo rasti tumorjev, ko so bili zdravljeni z oksaliplatinom v kombinaciji z cyclopamine je bil odziv tumorja na kemoterapevtskega zdravila okrepiti z cyclopamine (sl. 6A, B). Prav tako smo raziskali, ali SHH pot blokira 5E1 ali nadzor PBS povečati učinkovitost kemoterapije in vivo, so rezultati pokazali, da je 10 mikrogramov zdravljenje /ml 5E1 pripeljalo do bistveno večjega zaviranja na rast tumorja, kot pri bolnikih, zdravljenih samo z Oksaliplatin (sl. 6A, B).

Ti podatki kažejo, da čeprav standardni citostatikov zamudo tumorja izraščanja med zdravljenjem, ko so v kombinaciji z cyclopamine ali 5E1 je bila učinkovitost kemoterapije znatno povečala in tudi bolj trajna po prekinitvi zdravljenja.

Nato, da razišče, ali blokiranje Pst poti in vivo je imel poseben učinek na celice HGC-27 tumorsphere. Miši so bile le zdravljenih cyclopamine na zadnji desni bok ali nadzorni tomatidine na levem zadnjem boku (dvakrat na teden za 3 tedne), ko je tumor iz celic HGC-27 tumorsphere doseže približno 2 mm, po 3 tednih, smo izvedli omejevanje test redčenja za zrnc nastanek uporabo tumorske celice, obdelane z cyclopamine in obdelanih z tomatidine oz. Kot je prikazano v tabeli S2, lahko približno 9-15% celic iz xenotransplanted tumorja, zdravljenih z tomatidine proizvodnjo zrnc, medtem ko bi manj kot 2,5% celic iz xenotransplanted tumorja, zdravljenih z cyclopamine ustvarjajo zrnc. Zato bi blokiranje Pst poti in vivo zmanjša število želodčnih CSLCs.

6. SHH pot ohranilo želodčne CSLCs značilnosti tumorsphere celic iz vzorcev primarnega tumorja

Da bi ugotovili, ali je mogoče SHH pot vključeni v želodčnih CSCS lastnostih tumorsphere celic iz želodca tkiva raka, smo uporabili primarne želodčne vzorce raka za analizo funkcionalne vidike Pst poti v želodcu CSLCs.

Najprej, povečali bomo sveže bil ločen razsuti celice iz želodca osebkov raka v mediju brez seruma, opisane v poglavju metode, po 10 dneh, so opazili tumorspheres (sl. 7A, B). Potem smo raziskovali chemoresistance in tumorogeno zmogljivosti tumorsphere celic iz želodca tkiva raka. Rezultati so pokazali, da tumorsphere celice želodčnega tkiva raka dokazano bistveno večjo odpornost na droge, kot razsuti celic pod enakimi pogoji (sl. 7c). Poleg tega, sveže ločiti razsuti celice iz želodca vzorcih raka vbrizga na 2 x 10 ^{7 celic na miško bilo mogoče dokazati, podkožne tumorje, medtem ko je tako malo, kot 2 x 10 4 od tumorsphere celic iz želodca vzorcih raka lahko tvorijo tumorji (tabela 1), se presadkov tumorji, ki so povzročili, od vbrizga tumorsphere celic predstavila enake značilnosti histopatologijo kot svojih človeškega tumorja (sl. 7F). Ti rezultati so pokazali, da tumorsphere celice želodčnega tkiva raka imela lastnosti CSLCs. Dalje, smo opazili vpliv Pst poti, v blokado na chemoresistance od tumorsphere celic v in vitro in tumorja odziva na zdravila in vivo. Rezultati so pokazali, da cyclopamine ali bi 5E1 povzročila znatno izboljšano splošno stopnjo celične smrti (sl. 7D) in odziv tumorja na zdravila (sl. 7E).}

Pogovor

CSCS delijo mnoge značilnosti z matičnimi celicami tkiv, kot so samo-obnove, orožja, chemoresistance, in so v prvi vrsti odgovorne za ohranjanje rasti tumorjev [27], [28]. Mnogi raziskovalci so uporabili-fluorescence aktivira celice sortiranje prepoznati in izolirati CSCS in ugotovili, da lahko te celice tvorijo področja v specializiranih mediju brez seruma. V tej študiji, smo nasprotno pristop z razvojem tumorsphere celic in določanje, ali te celice pridobljene lastnosti CSCS.

Uporabili smo definiran medij brez seruma, ki jo sestavljajo EGF, FGF-2, B-27 dopolnilo in N-2 dodatek za ohranjanje želodčnih raka celičnih linij. Ti pogoji so bili uporabljeni pred ohraniti endogene živčne matične /zarodnih celic in tumorske matične celice iz človeških tumorjih in tumorskih celic. Na primer, Kondo et al. [24] označen C6 podgane tumorske celične linije in vitro in in vivo in opazili majhno populacijo matičnih podobnih celic, pridobljenih iz dobro označena s stransko populaciji. Setoguchi sod. [29] je pokazala raka celic potencial stebla, tako kot v drugih rakavih celic linij, vključno z linijo MCF7 dojke raka, B104 nevroblastoma, in HeLa adenokarcinom.

V našem poskusu smo uporabili tri želodčni rak celične linije (HGC- 27, MKN-45 in MGC-803) do kulture tumorspheres. HGC-27 celična linija je bila ustanovljena s kulturo metastatskega bezgavke od želodčnega raka bolnikov diagnosticirano histoloških kot nediferencirani karcinom. MKN-45 je bila ustanovljena s slabo diferencirani adenokarcinom želodca za 62-letno žensko. MGC-803 je A epitelijskih slabo diferenciran linijo človeške želodčne muco-adenokarcinom celic iz 74-let starega moškega.

Dve različni pristopi so ponavadi bili uporabljeni za identifikacijo CSCS v objavljenih študij [30] [31] . Ena je in vitro metoda, imenovana "sferoid oblikovanje kolonija", drugo pa v metodi in vivo, ki vključuje vsaditev CSCS kandidatk pod kožo imunsko pomanjkljivostjo miši.

Prva metoda vključuje gojenje CSCS kandidatke kulture jedi posebej prevlečenih za noncell nastavek z medijem brez seruma, ki vsebujejo epidermalni rastni faktor in bazični fibroblastni rastni faktor. Rast sferičnega kolonij po nekaj tednih se šteje kaže samo-obnove sposobnosti, in bi bilo v skladu z CSC fenotipa. Slednja metoda rast celic pri imunsko pomanjkljivostjo miših, je potrebno pokazati resnično tumorjev in na splošno velja za zlati standard za dokazovanje obstoja FT. Številne študije so pokazale, da ta dva pristopa na splošno zagotavljajo podobne rezultate pri ocenjevanju CSCS kandidatke za mnoge čvrstih tumorjev.

Trenutno želodca CSCS nimajo posebne nosilce površine, zato smo razvili tumorsphere celice in nato ugotoviti, ali te celice pridobljene lastnosti FT, vključno z lastnim obnovi zmogljivosti, chemoresistance in tumorogenega zmogljivosti.

Naši podatki so pokazali, da celičnih linij raka želodca (HGC-27, MGC-803, MKN-45) rastejo v določenem serumska brez medij lahko tvorijo tumorspheres, ki vsebuje celice obnašajo kot CSLCs. In vitro tumorsphere celice so pokazale povečano sposobnost oblikovati kolonije v mehki agar pod pritrdišč, neodvisno od razmer in večjo sposobnost za oblikovanje sub-tumorspheres. tudi pokazala smo, da je sposobnost samo-obnova, da tvorijo sub-tumorspheres celic HGC-27 tumorsphere imelo povečanje na prehodov 2 do 8 (od 44,5% do 70,5%), nato pa je ohranila relativno stabilen delež po 8 ali več prehodi pri gojenju na klonske gostote (sl. S3). Ti podatki kažejo, da je bila proliferativni potencial tumorsphere celic ohranila po daljšem prehodov. Poleg tega so bile tumorsphere celice in vitro bolj odporne na oksaliplatinom in mitomicin primerjavi z oprijetih celic, ti podatki kažejo, da tumorsphere celice, sestavljen iz obogatenega števila CSLCs, ki bi lahko iz njih manj dovzetni za ukrepe tako oksaliplatinom in mitomicina. In vivo lahko tumorsphere celice ustvarjajo tumorje na ksenotransplantaciji na višji stopnji kot oprijetih celic. Poleg tega tumorsphere celic ustvarili podkožne tumorje z večjim obsegom in krajšem času, v primerjavi s tistimi, pridobljeno iz sprijetih celic Pomembno je, da bi tumorspheres ponovno izhaja, iz xenotransplanted tumorjev, in se lahko ponovi tumor, ti podatki kažejo, da so bili tumorspheres obogaten CSLCs .

V raziskavi, sprijete celice verjetno vsebuje relativno nizek odstotek FT, ker ni bilo uporabljeno metodo za izolacijo ali odstranitev teh celic. Lahko bi rekli, da je ta majhna populacija FT, ki je odgovoren za nastanek tumorja. Ne glede na to je bilo več FT očitno v tumorsphere celic, ki lahko pojasni svojo bolj agresivno vedenje.

Nato smo raziskovali, ali so značilnosti CSLCs v tumorspheres vzdržuje nenormalno aktivacijo ššš poti. Prvič, smo dokazali, da so bili nivoji mRNA ekspresijski Pst molekul, povezanih s procesi (Pst, Ptch in Gli1) v tumorsphere celicah bistveno višja kot v oprijetih celicah, medtem ko je bila Gli2 visoka izražen v obeh celicah. Mi še preučila raven izražanja Pst ciljnih pot genov (Ptch in Gli1) z Western blot in kvantitativni PCR v realnem času, so bili rezultati podobni tistim, RT-PCR. Drugič, zaviranje Pst poti, v dejavnosti, ki jo cyclopamine ali 5E1 vodila v zmanjšanje sposobnosti samo-obnavljanja in povečana občutljivost do drog v HGC-27 tumorsphere celice, vendar ti učinki niso bili izrazito v oprijetih celicah. In vivo, je bila v vseh zdravljenih miših tumorje zdravijo z oksaliplatinom bistveno manjše od tistih, ki ne zdravijo z oksaliplatinske, po zdravljenju z cyclopamine ali 5E1, je bil povečan odziv tumorja na citostatikov. Ti podatki kažejo, da čeprav standardni citostatikov zamudo tumorja izraščanja med zdravljenjem, ko so v kombinaciji z cyclopamine je bila učinkovitost kemoterapije znatno povečala in tudi bolj trajna po prekinitvi zdravljenja.

Na koncu smo uporabili primarnega raka na želodcu vzorce za analizo funkcionalne vidike Pst poti v želodčnih CSLCs. Rezultati so pokazali, da je chemoresistance in tumorogeno zmogljivosti tudi tumorsphere celice iz želodca raka vzorcu, poleg tega SHH pot blokiranje zmanjšala chemoresistance za tumorsphere celic in večjo odzivnost tumorja do drog in vivo.

Tako kot pri chemoresistance, številne značilnosti CSCS lahko da jih je težko odpraviti. FT so relativno mirovnega in to jim omogoča, da pobegniti od kemoterapije, ki običajno usmerjeni aktivno kolesarske celice. Poleg tega, kot je prikazano za normalno kolegom, ki so bili predlagani CSCS da kažejo visoko izražanje ravni za multidrug transporter družinskih genih, verjetno kar omogoča učinkovitejše iztok citostatikov in prirojene odpornosti proti več, poleg tega pa signalnih poti, kot NT, Jež ali Notch, so dysregulated v FT, ki vodijo k razvoju tumorjev. Razvoj učinkovitega terapevtskega pristopa bi zato zahtevajo opredelitev značilnih molekularnih poteh, ki delujejo na FT in identifikacijo dejavnikov, ki lahko bodisi blok CSC orožja ali povzroči CSC diferenciacijo, s čimer se izboljša občutljivost na citostatikov. Torej, pomembni dejavniki, ki vplivajo na chemoresistance za FT so notranje dejavnike. Mikrookolje, ali nišo, lahko vplivajo na sposobnost CSCS razmnožujejo, selitev ali napadejo. Nišo je sidranje mesto za FT in adhezijskih molekul ali microenvironmental topnih molekul, vključno z rastnimi faktorji in citokini, lahko bistveno prispevajo k neodzivnost na zdravljenje. Čeprav bi zaviranje Pst poti, ki jo cyclopamine ali 5E1 koristen strategija v naši raziskavi smo pokazali, da so sestavni del receptorja Ptch in transkripcijski faktor Gli1 visoka tudi izražen v tumorsphere celicah. Torej, lahko Ptch ali Gli1 biti alternativa tarča za zdravljenje raka želodca. Eden od možnih strategija je, da uporabite male interferenčne RNA (siRNA) ali shRNA specifični za Ptch ali Gli1, ampak želodčne CSLCs v tumorsphere celice niso bile popolnoma očiščen, moramo dodatno očisti želodčne CSLCs, da to delo bo potekalo v naši nadaljnji študija.

na koncu smo pokazali, da se lahko SHH pot vključena v samo-obnove, proliferacijo, odpornost na področju drog in tumorogen od tumorsphere celic in kažejo, da so strategije, namenjene za zaviranje Pst poti predstavljajo Utemeljitev terapevtski pristop za ciljanje želodčne FT.

Etika živali Izjava materiale in metode

Male gole miši (nu /nu), stari od 6 do 8 tednov, so bili pridobljeni iz Pekinga Vital-River Lab Animal Technology Co Ltd (SCXK Jing 2007-0001) in so bile nastanjene v pogojih brez patogenov v obratu za pregrade živali. Vse miši so bile izvedene v skladu s sprejetimi smernicami za laboratorijske Center živali Akademije vojaških medicinskih znanosti (SYXK JUN 2002-001).

Kultura sprijetih celic, tumorspheres in sub-tumorspheres

Human rakom želodca celične linije (HGC-27, MGC-803 in MKN-45), pridobljeni iz Peking Union Medical College je kultivirani v 1640 mediju, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma (FBS) in prekrita na gostoto 1 x 10 ^{6 živih celic na 75-cm 2 bučki. Kadar je pritrjen celice, jih vnesejo na sotočju. Tumorspheres bili pridobljeni z dajanjem prilepljenih celic v 1640 gojišča brez seruma, ki vsebuje 1% N-2 dodatek (Invitrogen), 2% B-27 dopolnilo (Invitrogen), 1% antibiotik mešanico (Gibco), 20 ng /ml človeškega FGF -2 (Chemicon) in 100 ng /ml EGF (Chemicon) in sprijete celice zasadimo pri 24 vdolbinami ultra nizko pritrdilni plošči (Corning) na 500 celic na vdolbino. 2 tedna kasneje, so bili analizirani plošče za tumorspheres formacije in so količinsko, z uporabo obrnjeno mikroskopom (Olympus) 40 × in 100-kratni povečavi.}

Po primarni tumorspheres dosegel velikost približno 200-500 celic na področju je tumorspheres bila ločena v gostoti 1000 celic na mililiter in 100 ml suspenzija posamezna celica smo posejali v vsako vdolbino 24-kanalne ultra nizko pritrdilni plošči (Corning) v mediju brez seruma opisan zgoraj. Vsak dobro je bila preučena v eni celici, in le vodnjaki, ki vsebuje eno celico so označeni. 2 tedna kasneje, so bili analizirani vrtin za sub-tumorspheres nastanka. Normalne adherentne celice smo uporabili kot kontrolo za sposobnost, da se tvori sub-tumorspheres. Če želite preizkusiti povezavo med Pst poti in oblikovanju sub-tumorspheres smo obravnavala ločiti celic z cyclopamine (2,5 LM, 5 uM, 10 mikrometrov) ali nadzorni tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) ali nadzor PBS in opazili nastanek sub-tumorspheres.

rak želodca tkiva vzorec

sveže, sterilni vzorce človeškega raka želodca tkiva so bili pridobljeni v skladu z etičnimi standardi institucionalnega odbora za prehrano eksperimentiranju z 15 bolnikih (starost razpon 70-85 let) doživlja želodčne resekcijo raka, po pridobitvi soglasja od bolnikov (tabela S3).

potem so bili osebki potopi v 95% etanolu za 2-3 sekunde, da se prepreči kontaminacija in opran s fosfatnim pufrom (PBS) in antibiotike večkrat odstraniti kri. Po teh se je površina vzorcev tkiv raka odstranili in notranji deli so narežemo na 1-3 mm ^{3 velikih kosov. Nato so jih razgradili v kolagenaze in dispaze raztopini pri 37 ° C po 4 h inkubacije smo raztopino, ki vsebuje prebavi tkiva centrifugira, da se odstrani raztopino kolagenaze. Celični izperemo enkrat z 1640 mediju, nato pa suspendiramo v serum-free 1640 medij, ki vsebuje 1% N-2 dodatek, 2% B-27 dopolnilo, 1% antibiotik zmesjo, 20 ng /ml humanega FGF-2, 100 ng /ml ESPG in prekrita s 24 ter izjemno nizko pritrdilni plošči. Vse kulture inkubiramo pri 37 ° C v inkubatorjih, ki so priložena navlaženem zraku in 5% CO _2.}

Anchorage neodvisen test rast

Za nadaljnje opazovanje self-obnovi zmogljivost, mehka agar test smo uporabili za določitev kolonije nastanek tumorsphere celic in oprijetih celic pod sidranja neodvisen pogojih. Vsako vdolbino šest vdolbinicami je prevlečena z 1 ml 10% FBS 1640 mediju z 1% agaroze. Po 20 minutah inkubacije pri 37 ° C, dodamo enake številke (500) iz tumorsphere celic ali oprijetih celic v 1 ml 10% FBS 1640 medija z 0,5% agaroze. Če želite preizkusiti povezavo med Pst poti in tvorbe kolonij pod pritrdišč neodvisen od pogojev, smo obravnavala ločiti celice cyclopamine (2,5 LM, 5 pm, 10 J..LM) ali nadzor tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) ali nadzor PBS.

• Plos ONE: NT /β-Catenin signalizacijo Izboljša ciklooksigenaze-2 (COX2) transkripcijske aktivnosti želodčnega raka Cells
• Plos ONE: računalniška metoda za napovedovanje izločanja proteinov in uporabi za identifikacijo želodčnega raka označevalcev v Urine