PLoS ONE: Sonic Hedgehog Pathway is essentieel voor het onderhoud of Cancer Stem-achtige cellen in Menselijke Maag Cancer

Abstract

Abnormale activering van de Sonic egel (SHH) route is beschreven in een breed scala van menselijke kankers en kanker stamcellen (CSC), maar de rol van SHH route in de maag CSC is niet gemeld. In deze studie hebben we de mogelijkheid dat abnormale activatie van de SHH route handhaafde de kenmerken van maag CSCs. Ten eerste hebben we geïdentificeerd kanker stamcellen-achtige cellen (CSLCs) uit humane maagkanker cellijnen (HGC-27, MGC-803 en MKN-45) met behulp van tumorsphere cultuur. Vergeleken met hechtende cellen, de drijvende tumorsphere cellen had meer self-vernieuwing van capaciteit en chemoresistance. De cellen die CSCs merkers (CD44, CD24 en CD133) waren ook significant meer dan tumorsphere cellen in hechtende cellen. Belangrijker in vivo xenograft studies toonden aan dat tumoren kunnen worden gegenereerd met 2 x 10 ^{4 tumorsphere cellen, die 100-voudig minder dan die voor tumoren zaaien van hechtende cellen. Vervolgens RT-PCR en Western-blot toonde dat de expressie van Ptch en Gli1 (SHH route doelgenen) waren tumorsphere cellen significant hoger dan in hechtende cellen. De resultaten van kwantitatieve real-time PCR waren vergelijkbaar met die van RT-PCR en Western blot. Verdere analyse toonde aan dat SHH route geblokkeerd door cyclopamine of 5E1 veroorzaakte een hogere vermindering zelfvernieuwende capaciteit van HGC-27 tumorsphere cellen dan die van hechtende cellen. We vonden ook dat SHH route blokkeren sterk verhoogde de effectiviteit van chemotherapeutische middelen in HGC-27 tumorsphere cellen in vitro en in vivo maar had geen significant effect op hechtende cellen. Tot slot, geïsoleerde we de tumorspheres van maagkanker specimen, deze cellen had ook chemoresistance en tumorigene capaciteit en SHH route handhaafde de maag CSLCs kenmerken van tumorsphere cellen uit de primaire tumor samples. Samenvattend zijn onze gegevens suggereren dat SHH route was essentieel om de CSLCs in menselijke maagkanker}

Citation:. Song Z, W Yue, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway is essentieel voor het onderhoud of Cancer Stem-achtige cellen in Human maagkanker. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

Editor: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 27 november 2010; Aanvaard: 10 februari 2011; Gepubliceerd: 4 maart 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National High Technology Research en Development Program van China (È6AA402A04,È6AA02A107), de Major State Basic Research Program van China (È9CB521704) en de National Nature Science Foundation of China (.872.468,.873.031). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

CSCs spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van kanker, deze subpopulatie binnen tumor bezit de kenmerken van zelf-vernieuwing capaciteit chemoresistance en tumorigene capaciteit kan dus een cruciale rol spelen in de initiatie, progressie en herhaling van kanker. Bestuderen en manipuleren van de biochemische wegen betrokken bij deze kenmerken is een van de beste manieren dragen aan CSCs, leidt tot de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en behandelingsprocedures. SHH route speelt een cruciale rol in vele CSCs, zoals glioblastoom stamcellen [1], [2], CD34 + leukemische cellen [3], [4] en borst CSC [5], bovendien, is cruciaal voor de ontwikkeling en homeostase van maagklierwerking [6], abnormale activatie van de SHH route zou kunnen leiden tot maagkanker [7], [8], maar de rol van SHH route in de maag CSC is niet duidelijk.

SHH route in zoogdiercellen wordt gemedieerd door liganden Shh [9]. Aangezien Shh, het transmembrane receptor patched (Ptch) remt de activiteit van een ander transmembraaneiwit, smoothened (Smo), resulterend in inactivatie van SHH pathway [9], [10]. Binding van Shh aan Ptch heft het remmende effect van Ptch en Smo wordt opnieuw onderdrukt, waardoor transcriptiefactor Gli (Gli1, Gli2 en Gli3) activeren [9], [10]. Gli1 is een sterke positieve activator van downstream doelgenen en zelf een transcriptioneel doel van SHH pathway [11]. Derhalve Gli1 wordt beschouwd als een marker van SHH route abnormale activatie [10], [12]

Recentelijk zijn verschillende soorten CSCs of CSLCs geïdentificeerd en geïsoleerd van kwaadaardige tumoren [13] -. [25]. Bij maagkanker, methodologisch, is het moeilijk te isoleren en amplificeren CSCs van cellijnen of tumor tissue specimens. Momenteel, CD44 lijkt de meest bruikbare marker voor potentiële zuivering van gastrische CSCs zijn, is het echter niet erg specifiek voor gastrische CSCs [26].

In deze studie, die we CSLCs uit menselijke maag kankercellijnen (HGC-27, MGC-803 en MKN-45) onder toepassing tumorsphere kweken in serumvrij medium en die de zelfvernieuwingscapaciteit, chemoresistance en tumorigene vermogen van de tumorsphere cellen; Vervolgens hebben we de expressie van SHH-pathway-gerelateerde moleculen, waaronder Shh, Ptch, Smo, Gli1 en Gli2 onderzocht tumorsphere cellen en hechtende cellen, in het bijzonder de expressie van Ptch en Gli1.Then, geblokkeerde we SHH pad door cyclopamine of control tomatidine, 5E1 of controle PBS te onderzoeken of de kenmerken van CSLCs in tumorsphere cellen door abnormale activatie van de SHH route gehandhaafd. Tenslotte gebruikten we primaire maagkanker monsters de functionele aspecten van SHH route analyseren maag CSLCs.

Cyclopamine is een cel-permeabele steroïde alkaloïde. Verstoort cholesterol biosynthese en specifiek antagoneert SHH signaleringsroute door directe interactie met Smo (glad), verre familie van G-proteïne-gekoppelde receptoren. Het is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de rol van SHH signalering bij de ontwikkeling van diverse tumoren. Tomatidine is een steroïdaal alkaloïde dat structureel lijkt cyclopamine, maar mist het vermogen om SHH signalering remmen. Het kan worden gebruikt als een negatieve controle. 5E1 is een anti-Hh monoklonaal antilichaam, dat de SHH en IHH activiteit neutraliseert.

Resultaten

1. Tumorsphere cellen bezat de kenmerken van CSLCs

We groeiden HGC-27, MGC-803 en MKN-45 hechtende cellen in serumvrij medium in de paragraaf werkwijzen beschreven. Na 7 dagen werden tumorspheres bestaande uit ongeveer 50 tot 100 cellen waargenomen (Fig. 1A).

De zelfvernieuwende capaciteit van deze tumorspheres werd beoordeeld door dissociëren ze in afzonderlijke cellen en groeien in een klonale dichtheid van 1000 cellen per milliliter. Na 2 weken, enkele cel afgeleid van HGC-27 tumorsphere cellen gegenereerd sub-tumorspheres op 41,83% ± 3,13% tegenover 8,17% ± 2,40% van de hechtende cellen bovendien in MGC-803 en MKN-45, de sub-tumorspheres formatie percentage tumorsphere cellen waren ook hoger dan die van hechtende cellen. (Fig. 1B). Deze gegevens suggereerden dat de zelfvernieuwende capaciteit van tumorsphere cellen was significant hoger dan die van hechtende cellen. Tumorsphere cellen vertoonden ook een verhoogd vermogen om kolonies onder verankering-onafhankelijke omstandigheden functioneren in een standaard zachte agar-analyse na 14 dagen in HGC-27 en MKN-45 (Fig. 1C).

Ook voerden een beperkte verdunning test voor sferoïden vorming behulp HGC-27 tumorsphere cellen en hechtende cellen. Zoals getoond in Tabel S1, kan ongeveer 27-35% van tumorsphere cellen sferoïden produceren, terwijl minder dan 5% van de hechtende cellen sferoïden na 3 weken kweken kunnen genereren. Daarom is in de HGC-27 tumorsphere cellen, kunnen we schatten dat de sferoïden-vormende cellen populatie bestaat maximaal 35%.

chemoresistance is een ander kenmerk van CSCs, dus we onderzocht of een verschil bestond tussen chemoresistentie tumorsphere cellen en hechtende cellen. De resultaten toonden aan dat na 48 uur, tumorsphere cellen significant grotere resistentie tegen geneesmiddelen tegen hechtende cellen onder dezelfde omstandigheden (Fig. 1D). Wij hebben eveneens chemoresistance van HGC-27 tumorsphere cellen en hechtende cellen aan verschillende concentraties van geneesmiddelen hebben echter zowel tumorsphere cellen hechtende cellen niet significant chemoresistance tonen aan drugs op een dosis-afhankelijke wijze (Fig. S1).

Vervolgens onderzochten we de expressie van CD44 in gedissocieerde tumorsphere cellen en hechtende cellen met behulp van immunofluorescentie assay en western blot. De resultaten toonden aan dat de cellen die CD44 significant meer tumorsphere cellen dan in hechtende cellen (Fig. 2A). Bovendien is de expressie van andere CSCs merkers (CD24 en CD133) in tumorsphere cellen en hechtende cellen werd onderzocht door western blot, tegenover tumorsphere cellen, de expressie van CD24 was significant lager in hechtende cellen, terwijl de expressie van CD133 was vergelijkbaar (Fig . 2B). Verder hebben we gefractioneerd HGC-27 cellen door FACS sortering van CD44, vonden we dat CD44 (+) fractie cel meer bolvormige kolonies kunnen genereren tegen CD44 (-) celfractie bovendien de omvang van sferoïde kolonies van CD44 (+) cellen was groter dan die van CD44 (-) (fig. 2C). cellen

2. Tumorsphere cellen kunnen tumoren bij xenotransplantatie
genereren

Voor xenograft studies, gelijk aantal (2 x 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) van vers gescheiden tumorsphere cellen of controle hechtende cellen werd geïnjecteerd sc in elke muis (6 muizen per groep). De resultaten toonden aan dat tumoren werden gemaakt met 2 x 10 4 tumorsphere cellen, die 100-voudig minder dan die van tumoren zaaien van hechtende cellen (Tabel 1). Bovendien tumorsphere cellen gegenereerd subcutane tumoren met groter volume en een kortere tijd vergeleken met die gegenereerd hechtende cellen (fig. 3A, B). Zo subcutane injectie van lage aantal tumorsphere cellen bevestigd dat de bolvormige cellen behouden sterker tumorigene capaciteit in naakt muizen dan hechtende cellen}

H &. E onderzoek van xenotransplantaten afgeleid van HGC-27 tumorsphere cellen bleek dat deze tumoren nauw leek het oorspronkelijke menselijke tumor, vooral met gedifferentieerde cellen (Fig. 3C). Belangrijker tumorspheres kan opnieuw worden afgeleid uit het xenogetransplanteerd tumoren (fig. 3D), en ze konden tumor weer (Fig. 3E) te vormen. Deze gegevens dan ook aangegeven dat de tumorsphere cellen vertegenwoordigde CSLCs dat tumorigene capaciteit had.

3. SHH route werd hoger uitgedrukt in tumorsphere cellen dan in hechtende cellen

Om het verband tussen SHH route en CSLCs kenmerken van tumorsphere cellen te onderzoeken, hebben we eerst gekeken naar de mRNA expressie van SHH-pathway-gerelateerde moleculen, waaronder Shh, Ptch, Smo, Gli1 en Gli2 door RT-PCR. De resultaten toonden dat alle mRNA hoog werden uitgedrukt in HGC-27 tumorsphere cellen. Vergeleken met tumorsphere cellen, de expressie van Shh, Ptch, Smo en Gli1 waren significant lager in hechtende cellen, terwijl de expressieniveaus van Gli2 waren vergelijkbaar met cellen tumorsphere. In MGC-803 en MKN-45, de expressieniveaus van Shh, Ptch en Gli1 waren ook significant lager in hechtende cellen dan in tumorsphere cellen, terwijl de expressieniveaus van Smo en Gli2 had geen significant verschil tussen de hechtende cellen en tumorsphere cellen (Fig . 4A).

In SHH route, Ptch en Gli1 zijn doelwit genen, ze worden beschouwd als belangrijke markers van SHH route abnormale activering. Dus, verder onderzocht we de expressie van Ptch en Gli1 door Western blot en kwantitatieve real-time PCR.

Bij gebruik van Western blot, we vonden dat de expressie van Ptch en Gli1 waren ook hoger in cellen dan tumorsphere in hechtende cellen (Fig. 4B). We vervolgens onderzocht de expressie van Ptch en Gli1 in xenotransplantaten van HGC-27 met behulp van kwantitatieve real-time PCR. Kwantitatieve real-time PCR analyses van SHH doelgenen (PTCH en GLI1) vertoonde dezelfde resultaten van hierboven semi-kwantitatieve RT-PCR (Fig. 4C).

4. SHH route blokkeren verlaagde de zelf-vernieuwing van capaciteit en chemoresistance van HGC-27 tumorsphere cellen

Om te testen voor een mogelijke rol van SHH route in zelf-vernieuwing capaciteit van tumorsphere cellen, gebruikten we cyclopamine of controle tomatidine, 5E1 of controle PBS om de route te blokkeren.

de resultaten toonden aan dat cyclopamine behandeling leidde tot een significante vermindering van de capaciteit voor de vorming van sub-tumorspheres in HGC-27 tumorsphere cellen op een dosis-afhankelijke wijze, maar dergelijk effect werd waargenomen in hechtende cellen (Fig. 5A). We verder geëvalueerd of de behandeling met cyclopamine de koloniën vorming capaciteit van HGC-27 tumorsphere cellen door verankering-onafhankelijke groei assay zou beïnvloeden. Ook werd het vermogen om kolonies te vormen meer de tumorsphere cellen op een dosis-afhankelijke wijze ten opzichte van de hechtende cellen (Fig. 5B) verminderd.

Vervolgens onderzochten we het effect van SHH route op chemoresistentie van HGC -27 tumorsphere cellen, behandelden wij de gedissocieerde cellen met cyclopamine of control tomatidine gedurende 48 uur en vervolgens geneesmiddelresistentie van tumorsphere cellen werd geëvalueerd. Wanneer cyclopamine werd gevolgd door geneesmiddelen, de behandeling resulteerde in een significant verhoogde totale percentage celdood. De beste resultaten werden verkregen wanneer cyclopamine werd gecombineerd met oxaliplatine plus mitomycine (fig. 5C). Dergelijke synergistische effect werd waargenomen in hechtende cellen na blootstelling aan geneesmiddelen met cyclopamine gedurende 48 uur (fig. 5D).

Ook onderzocht het effect van verschillende concentraties van cyclopamine (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) op celdood. De resultaten toonden aan dat cyclopamine alleen aan cellen tumorsphere een kleine maar consistente verlaging in het aantal levensvatbare cellen kon maken. Vergeleken met HGC-27 tumorsphere cellen, het effect van cyclopamine op celdood hechtende cellen was significantie (Fig. 5C, D).

Wanneer SHH route werd geblokkeerd door 5E1 of controle PBS, de resultaten van het zelf -renewing capaciteit en chemoresistance van tumorsphere cellen hechtende cellen zijn vergelijkbaar met die geblokkeerd door cyclopamine of control tomatidine (afb. S2).

5. SHH route blokkeren verhoogde tumor reactie op drugs in vivo

Om deze hypothese in vivo testen, hebben we onderzocht of SHH route blokkeren verbeterde werkzaamheid chemotherapie, cyclopamine of control tomatidine werd gebruikt om SHH route reacties te remmen. HGC-27 tumorsphere cellen liet men groeien tot de beide achterste flanken van naakt muizen tot de grootste diameter van de tumor bereikt ongeveer 2 mm. Muizen werden daarna tweemaal per week behandeld gedurende 3 weken met cyclopamine of control tomatidine 24 uur voor oxaliplatine bevalling. In alle behandelde muizen tumoren behandeld met oxaliplatine significant kleiner dan die niet behandeld met oxaliplatine. Bovendien tumoren vertoonden significant hogere remming van tumorgroei wanneer ze werden behandeld met oxaliplatine in combinatie met cyclopamine, werd de tumor respons op chemotherapeutische geneesmiddelen versterkt door cyclopamine (Fig. 6A, B). We hebben ook onderzocht of SHH route geblokkeerd door 5E1 of controle PBS verhoogde chemotherapie werkzaamheid in vivo, de resultaten bleek dat 10 ug /ml 5E1 behandeling leidde tot een significant hogere remming van de tumorgroei dan alleen behandeld met oxaliplatine (fig. 6A, B).

Deze gegevens suggereren dat hoewel standaard chemotherapeutische geneesmiddelen tumor uitgroei vertraging in de behandeling, wanneer ze werden gecombineerd met cyclopamine of 5E1, de effectiviteit van chemotherapie werd aanzienlijk verbeterd en ook voortgezet nadat onderbreking van de behandeling.

Next, om te onderzoeken of het blokkeren van SHH route in vivo een bepaald effect op de HGC-27 tumorsphere cellen hadden. Muizen werden slechts behandeld cyclopamine rechtsachter flank of control tomatidine aan de linker achterflank (twee keer per week gedurende 3 weken) bij tumoren met HGC-27 tumorsphere cellen bereikte ongeveer 2 mm na 3 weken, voerden we een beperkende verdunning assay voor sferoïden vorming behulp tumorcellen behandeld met cyclopamine en behandeld met tomatidine respectievelijk. Zoals getoond in Tabel S2, kan ongeveer 9-15% van de cellen van xenogetransplanteerd tumor behandeld met tomatidine bolletjes produceren, terwijl minder dan 2,5% van de cellen van xenogetransplanteerd tumor behandeld met cyclopamine bolletjes kunnen genereren. Daarom blokkeren SHH route in vivo kunnen de aantallen maag CSLCs verminderen.

6. SHH route handhaafde de maag CSLCs kenmerken van tumorsphere cellen uit de primaire tumor samples

Om te bepalen of SHH pathway betrokken zou kunnen zijn in de maag CSCs kenmerken van tumorsphere cellen van maagkanker weefsel, we benut primaire maagkanker monsters aan het analyseren functionele aspecten van SHH route in de maag CSLCs.

First groeide het net losgemaakte bulk cellen van maagkanker monsters in serumvrij medium in de paragraaf werkwijzen, na 10 dagen, tumorspheres waargenomen beschreven (fig. 7A, B). Vervolgens onderzochten we chemoresistance en tumorigene capaciteit van de tumorsphere cellen van maagkanker weefsel. De resultaten toonden aan dat tumorsphere cellen van maagkanker weefsel significant grotere resistentie tegen geneesmiddelen dan bulk cellen onder dezelfde omstandigheden (Fig. 7C). Bovendien, vers gedissocieerde bulk cellen van maagkanker monsters geïnjecteerd met 2 x 10 ^{7 cellen per muis in staat waren tot oprichting van subcutane tumoren, terwijl zo weinig als 2 × 10 4 van de tumorsphere cellen van maagkanker monsters zouden kunnen vormen tumoren (Tabel 1), de xenotransplantaten tumoren die het gevolg is van de injectie van tumorsphere cellen gepresenteerd histopathologie dezelfde eigenschappen als hun humane tumor (fig. 7F). Deze resultaten toonden aan dat tumorsphere cellen van maagkanker weefsel bezat de kenmerken van CSLCs. Vervolgens zagen we het effect van SHH route blokkeren op chemoresistance tumorsphere van cellen in vitro en tumor respons op geneesmiddelen in vivo. De resultaten toonden aan dat cyclopamine of kon 5E1 leidde tot een significant verhoogde totale percentage celdood (fig. 7D) en de tumor respons op geneesmiddel (fig. 7E).}

Discussie

CSC hebben veel eigenschappen met weefsel stamcellen, zoals zelfvernieuwing, proliferatie, chemoresistance en zijn primair verantwoordelijk voor het ondersteunen van de groei van tumoren [27], [28]. Vele onderzoekers hebben fluorescentie-geactiveerde celsortering te CSCs identificeren en isoleren gebruikt en vastgesteld dat deze cellen in gespecialiseerde gebieden serumvrij medium kan vormen. In deze studie hebben we het tegenovergestelde aanpak door het ontwikkelen tumorsphere cellen en vervolgens bepalen of deze cellen verworven CSCs kenmerken.

We gebruikten een gedefinieerd serumvrij medium dat bestaat uit EGF, FGF-2, B-27 aan te vullen en N-2 supplement maagkanker cellijnen handhaven. Deze omstandigheden werden eerder gebruikt om endogene neurale stam /voorlopercellen en tumor stamcellen van humane tumoren en tumorcellijnen te handhaven. Bijvoorbeeld, Kondo et al. [24] het kenmerk C6 rat tumor cellijn in vitro en in vivo waargenomen en een kleine populatie van stamcellen-achtige cellen afkomstig van de goed gekarakteriseerde side population. Setoguchi et al. [29] toonde kanker steelachtige celpotentiaal bij andere kankercellijnen, zoals de MCF7 borstkanker lijn, B104 neuroblastoom en HeLa adenocarcinoom.

Bij ons experiment gebruikten we drie maagkanker cellijnen (HGC- 27, MKN-45 en MGC-803) cultuur tumorspheres. HGC-27 cellijn werd vastgesteld door de cultuur van de metastatische lymfeklier van een maagkanker patiënt gediagnosticeerd histologische als ongedifferentieerd carcinoom. MKN-45 werd vastgesteld op basis van de slecht gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag van een 62-jarige vrouw. MGC-803 is een epitheliale slecht gedifferentieerde menselijke maag muco-adenocarcinoom cellijn van een 74-jarige man.

Twee verschillende benaderingen zijn doorgaans gebruikt om CSCs identificeren in gepubliceerde studies [30], [31] . Eén is een in vitro werkwijze genoemd "sferoïde kolonievorming," en de andere in vivo werkwijze waarbij implantatie van kandidaat CSCs onder de huid van immunodeficiënte muizen.

De eerste werkwijze omvat het kweken kandidaat CSC in kweekschalen speciaal gecoat voor noncell bevestiging met serumvrij medium dat epidermale groeifactor en basische fibroblast groeifactor. De groei van bolvormige kolonies na enkele weken als indicatief voor zelfvernieuwing capaciteit, en volgens een CSC fenotype zou zijn. De laatste methode-celgroei in immunodeficiënte muizen-nodig om waar tumorigeniciteit tonen en wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor het bewijs van het bestaan ​​van CSCs. Een aantal studies hebben gesuggereerd dat deze twee benaderingen algemeen soortgelijke resultaten bij het evalueren kandidaat CSC vele solide tumoren.

Momenteel maag CSCs zijn niet specifiek oppervlak makers, dus we tumorsphere cellen ontwikkeld en vervolgens bepaald of deze cellen verworven CSCs kenmerken, met inbegrip van zelf-vernieuwing capaciteit chemoresistance en tumorigene capaciteit.

Onze gegevens toonden aan dat maagkanker cellijnen (HGC-27, MGC-803, MKN-45), gekweekt in een gedefinieerde serum vrij medium kon tumorspheres dat cellen zich gedragen als CSLCs bevatte vormen. In vitro tumorsphere cellen vertoonden een toegenomen vermogen om kolonies in zachte agar te vormen onder verankering-onafhankelijke omstandigheden en een toegenomen vermogen om sub-tumorspheres vormen. We toonden ook aan dat de zelfvernieuwing vermogen om sub-tumorspheres van HGC-27 tumorsphere cellen vormen hadden een verhoging bij passages 2-8 (van 44,5% tot 70,5%), en handhaafde een relatief stabiele verhouding na 8 of meer passages wanneer gegroeid bij klonale dichtheid (Fig. S3). Deze gegevens suggereerden dat de proliferatieve potentie van tumorsphere cellen na langdurige passages werd gehandhaafd. Bovendien tumorsphere cellen in vitro waren beter bestand tegen Oxaliplatin en mitomycine opzichte van hechtende cellen, suggereren deze gegevens dat tumorsphere cellen uit verrijkte aantallen CSLCs die potentieel ze minder gevoelig voor de werking van zowel Oxaliplatine en mitomycine gemaakt. In vivo, kon tumorsphere cellen tumoren na xenotransplantatie te genereren tegen een hoger tarief dan hechtende cellen. Bovendien tumorsphere cellen gegenereerd subcutane tumoren met groter volume en een kortere tijd vergeleken met die gegenereerd hechtende cellen, belangrijk, tumorspheres kan opnieuw worden afgeleid uit het xenogetransplanteerd tumoren, en ze konden tumor weer vormen, suggereren deze gegevens dat tumorspheres werden verrijkt in CSLCs .

In onze studie hechtende cellen bevatten vermoedelijk een relatief laag percentage CSCs, aangezien geen werkwijze voor isolatie of verwijdering van deze cellen werd gebruikt. Het kan worden aangevoerd dat het deze kleine populatie van CSC, dat verantwoordelijk is voor de vorming van de tumor. Ongeacht, meer CSCs waren duidelijk in de tumorsphere cellen die zijn agressiever gedrag kan verklaren.

Vervolgens onderzochten we of de kenmerken van CSLCs in tumorspheres door abnormale activatie van de SHH route gehandhaafd. Eerst hebben we aangetoond dat mRNA-expressieniveaus van SHH-route gerelateerde moleculen (Shh, Ptch en Gli1) waren tumorsphere cellen significant hoger dan in hechtende cellen, terwijl Gli2 was hoog tot expressie gebracht in beide cellen. Verder hebben we de expressieniveaus van SHH route doelgenen (Ptch en Gli1) onderzocht met Western blot en kwantitatieve real-time PCR, de resultaten waren vergelijkbaar met die van RT-PCR. Ten tweede, remming van SHH route activiteit door cyclopamine of 5E1 leidde tot een verminderde zelfvernieuwingscapaciteit en overgevoeligheid voor geneesmiddelen in HGC-27 tumorsphere cellen, maar deze effecten zijn niet uitgesproken in hechtende cellen. In vivo, in alle behandelde muizen tumoren behandeld met oxaliplatine significant kleiner dan die niet behandeld met oxaliplatine, na behandeling met cyclopamine of 5E1, tumorrespons chemotherapeutica werd versterkt. Deze gegevens suggereren dat hoewel standaard chemotherapeutische geneesmiddelen tumor uitgroei vertraging in de behandeling, wanneer ze werden gecombineerd met cyclopamine, de effectiviteit van chemotherapie werd aanzienlijk verbeterd en ook voortgezet nadat onderbreking van de behandeling.

Tenslotte gebruikten we primaire maagkanker monsters de functionele aspecten van SHH route analyseren maag CSLCs. De resultaten toonden aan dat tumorsphere cellen van maagkanker specimen had ook chemoresistance en tumorigene capaciteit bovendien SHH route blokkeren verminderde de chemoresistance van tumorsphere cellen en verhoogde tumor reactie op drugs in vivo.

Als voor chemoresistance, verschillende functies van CSCs kan ze moeilijk te elimineren. CSC's zijn relatief rustig en dit hen in staat stelt om te ontsnappen aan chemotherapeutische behandelingen die doorgaans gericht zijn actief delende cellen. Zoals getoond voor de normale tegenhanger, CSCs voorgesteld om hoge expressie van multidrug transporter familie genen vertonen, waarschijnlijk resulteert in een efficiëntere efflux van chemotherapeutische geneesmiddelen en aangeboren multidrug resistentie, Bovendien signaleringsroutes, zoals Wnt, Hedgehog of notch, worden ontregeld in CSCs leiden tot de ontwikkeling van tumoren. De ontwikkeling van een efficiënte therapeutische aanpak zou vereisen daarom de identificatie van de onderscheidende moleculaire pathways actief in CSCs en de identificatie van de agenten die ofwel blok CSC proliferatie of kan induceren CSC differentiatie, waardoor de gevoeligheid voor chemotherapeutische geneesmiddelen versterken. Dus, belangrijke factoren die de chemoresistance van CSCs zijn intrinsieke factoren. De micro-omgeving, of niche, kan het vermogen van CSCs te laten groeien, migreren of binnenvallen beïnvloeden. De nis is een verankering site CSCs en adhesiemoleculen of micro-omgeving van oplosbare moleculen, zoals groeifactoren en cytokinen, kan aanzienlijk bijdragen tot de vuurvastheid therapie. Hoewel de remming van SHH pad door cyclopamine of 5E1 een nuttige strategie zou zijn in onze studie hebben we aangetoond dat receptorcomponent Ptch en transcriptiefactor Gli1 werden hoge expressie in tumorsphere cellen. Dus, Ptch of Gli1 kan een alternatieve doelwit voor de behandeling van maag- kanker. Een mogelijke strategie is om kleine interfererende RNA (siRNA) of shRNA specifiek voor Ptch of Gli1, maar maag CSLCs gebruiken tumorsphere cellen zijn niet volledig gezuiverd is, moeten we verder te zuiveren de maag CSLCs, dus dit werk zal worden uitgevoerd in onze verdere studie.

tot slot hebben we aangetoond dat SHH route kan worden betrokken bij de zelf-vernieuwing, proliferatie, resistentie tegen geneesmiddelen en tumorigene van tumorsphere cellen en suggereren dat die gericht zijn op het remmen van SHH paden vormen een rationale therapeutische benadering te richten maag CSCs.

Materialen en methoden

Verklaring Animal Ethics

Male athymische naakt muizen (nu /nu), 6 tot 8 weken oud, werden verkregen van Beijing Vital-River Lab Animal Technology Co Ltd (SCXK JING 2007-0001) en werden gehuisvest onder pathogeen-vrije omstandigheden in de barrière dier faciliteit. Alle muizen werden uitgevoerd onder goedgekeurde richtlijnen van Laboratory Animal Center van de Academie van Militaire Medische Wetenschappen (SYXK juni 2002-001).

Cultuur van hechtende cellen, tumorspheres en sub-tumorspheres

Human maagkanker cellijnen (HGC-27, MGC-803 en MKN-45) verkregen Peking Union Medical College werd gekweekt in 1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en uitgeplaat in de dichtheid van 1 x 10 ^{6 levende cellen per 75 cm 2 kolf. Wanneer de cellen gehecht, doorgekweekt wij ze op confluentie. Tumorspheres werden verkregen door het plaatsen van de hechtende cellen in serumvrij 1640 kweekmedium dat 1% N-2 supplement (Invitrogen), 2% B-27 supplement (Invitrogen), 1% antibiotisch mengsel (Gibco), 20 ng /ml humaan FGF -2 (Chemicon) en 100 ng /ml EGF (Chemicon) en de hechtende cellen werden uitgeplaat in 24-well ultralage bevestigingsplaat (Corning) bij 500 cellen per putje. 2 weken later werden de platen geanalyseerd op tumorspheres vorming en werden gekwantificeerd onder toepassing van een omgekeerde microscoop (Olympus) 40 x en 100 x vergroting.}

Na de lagere tumorspheres de grootte van ongeveer 200-500 cellen per gebied bereikt, tumorspheres werden gedissocieerd met de dichtheid van 1000 cellen per milliliter en 100 pi enkele celsuspensie werd in elk putje van 24-well ultralage bevestigingsplaat (Corning) gezaaid in serumvrij medium hierboven beschreven. Elk putje werd onderzocht op enkele cel, en alleen de putten die enkele cel bevatten, werden gekenmerkt. 2 weken later, werden gaten geanalyseerd op sub-tumorspheres formatie. Normale hechtende cellen werden gebruikt als controle voor de capaciteit om sub-tumorspheres vormen. Om de link tussen de SHH route en de vorming van sub-tumorspheres testen, behandelden wij de gescheiden cellen met cyclopamine (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) of de controle tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) of controle PBS en observeerde de vorming van sub-tumorspheres.

maagkanker weefselmonster

het menselijk vers, steriel maagkanker weefselmonsters werden verkregen in overeenstemming met de ethische normen van de institutionele commissie menselijke experimenten uit 15 patiënten (leeftijd range 70-85 jaar) ondergaat een maagkanker resectie, na het verkrijgen van informed consent van de patiënten (Tabel S3).

Daarna werden de monsters ondergedompeld in 95% ethanol gedurende 2-3 seconden om besmetting te voorkomen, en gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en antibiotica herhaaldelijk om het bloed te verwijderen. Hierna werd het oppervlak van de kanker weefselmonsters verwijderd en het binnenste werden in 1-3 mm ^{3-stukjes gesneden. Daarna werden ze verteerd in collagenase en dispase oplossing bij 37 ° C na 4 uur incubatie, de oplossing die het gedigereerde weefsel werd gecentrifugeerd om de collagenase oplossing te verwijderen. De celpellet werd eenmaal met 1640 medium gewassen alvorens zij in serumvrij 1640 medium dat 1% N-2 supplement, 2% B-27 supplement, 1% antibiotisch mengsel, 20 ng /ml humaan FGF-2, 100 ng /is opgehangen ml EGF en uitgeplaat in 24-well ultra-lage bevestigingsplaat. Alle kweken werden geïncubeerd bij 37 ° C in incubatoren met bevochtigde lucht en 5% CO _2.}

Anchorage-onafhankelijke groei assay

Meer waarnemen van de zelf-vernieuwing capaciteit zachte geleverd agar assay werd toegepast om de vorming van kolonies tumorsphere cellen en hechtende cellen onder verankering-onafhankelijke omstandigheden bepalen. Elk putje van een zes-puts plaat werd bekleed met 1 ml 10% FBS 1640-medium met 1% agarose. Na 20 min incubatie bij 37 ° C werden gelijke aantallen (500) van tumorsphere cellen of adherente cellen in 1 ml 10% FBS 1640-medium met 0,5% agarose toegevoegd. Om de link tussen de SHH route en de koloniën formatie onder verankering-onafhankelijke omstandigheden te testen, behandelden wij de gescheiden cellen met cyclopamine (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) of de controle tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) of te beheersen PBS.

• PLoS ONE: Wnt /β-catenine signalering Verbetert cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptie-activiteit bij maagkanker Cellen
• PLoS ONE: Een rekenmethode voor de voorspelling van uitscheidingsmechanisme Eiwitten en Toepassing op Identificatie van maagkanker Markers in Urine