PLoS ONE: Sonic Hedgehog Pathway Onko Välttämätön huolto Cancer Stem-Like Solut Ihmisen mahasyövän

tiivistelmä

Epänormaali aktivointi Sonic hedgehog (SHH) reitti on kuvattu erilaisia ​​ihmisen syöpien ja syövän kantasoluja (CSCS), kuitenkin, rooli SHH reitin mahalaukun CSCS on ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta, että epänormaali aktivaatio SHH reitin ylläpidetään ominaisuudet mahalaukun CSCS. Ensin tunnistetaan syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSLCs) ihmisen mahasyöpä solulinjoissa (HGC-27, MGC-803 ja MKN-45) käyttäen tumorsphere kulttuuriin. Verrattuna kiinnittyneet solut, kelluva tumorsphere soluja oli enemmän itseuudistuvien kapasiteetin ja chemoresistance. Solut ilmentävät CSCS merkkiaineita (CD44, CD24 ja CD133) olivat myös merkitsevästi enemmän tumorsphere soluissa kuin tarttuneet solut. Vielä tärkeämpää on, in vivo ksenograftin tutkimukset osoittivat, että kasvaimia voitaisiin tuottaa 2 x 10 ^{4 tumorsphere soluja, mikä oli 100 kertaa vähemmän kuin ne, joita vaaditaan kasvainten kylvö mukaan tarttuneet solut. Seuraavaksi RT-PCR ja Western blot osoitti, että ekspressiotasot Ptch ja Gli1 (SHH reitti kohdegeenien) olivat merkittävästi korkeammat tumorsphere soluissa kuin tarttuneet solut. Tulokset kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR olivat samanlaisia ​​kuin RT-PCR: llä ja Western blot. Tarkempi analyysi paljasti, että SHH koulutusjakson estänyt syklopamiini tai 5E1 aiheutti suuremman väheneminen itseuudistuvien kapasiteetti HGC-27 tumorsphere soluja kuin tarttuvien solujen. Olemme myös havainneet, että SHH koulutusjakson estää voimakkaasti parannettu tehokkuus kemoterapeuttisten lääkkeiden HGC-27 tumorsphere solujen kasvua in vitro ja in vivo, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta tarttuneet solut. Lopuksi eristäneet tumorspheres alkaen mahasyöpä näytteestä, nämä solut oli myös chemoresistance ja tuumorigeenisemmiksi kapasiteettia, ja SHH polku säilytti mahalaukun CSLCs ominaisuudet tumorsphere solujen primaarikasvaimen näytteistä. Lopuksi todettakoon, että tiedot osoittivat, että SHH koulutusjakson oli olennaista ylläpitoon CSLCs ihmisen mahasyövän.}

Citation: Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway Onko Välttämätön huolto Cancer Stem-Like Solut Ihmisen syöpään. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687

Editor: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 marraskuu 2010; Hyväksytty: 10 helmikuu 2011; Julkaistu: 04 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiinassa (È6AA402A04,È6AA02A107), Major State Basic Research Program of China (È9CB521704), ja National Nature Science Foundation of China (Ĵ72468,Ĵ73031). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CSCS tärkeä rooli syövän kehittymisessä, tämän alaryhmän sisällä kasvain hallussaan ominaisuudet itseuudistuvien kapasiteettia, chemoresistance ja tuumorigeenisia kapasiteetti voi siten olla ratkaiseva rooli aloittamisen, etenemisen ja uusiutumisen syöpä. Tutkiminen ja manipuloimalla biokemiallisia reittejä mukana niitä ominaisuuksia on yksi parhaista tavoista edistää CSCS, mikä kehittää uusia lääkkeitä ja hoitoa menettelyjä. SHH polku on kriittinen rooli monissa CSCS, kuten glioblastooma kantasolujen [1], [2], CD34 + leukemiasoluja [3], [4] ja rintojen CSCS [5], lisäksi se on avainasemassa kehitettäessä ja homeostaasiin maharauhanen [6], epänormaali aktivaatio SHH reitin voi johtaa mahasyövässä [7], [8], mutta rooli SHH reitin mahalaukun CSCS ei ole selvä.

SHH väylän nisäkässoluissa välittävät ligandien Shh [9]. Koska Shh, transmembraanisen reseptorin patched (Ptch) inhiboi toisen transmembraanisen proteiinin, smoothened (Smo), jolloin inaktivaatio SHH-reitin [9], [10]. Sitovat Shh Ptch: hon kumoaa inhiboivaa vaikutusta Ptch ja Smo tukahduttavat, jolloin aktivoiva transkriptiotekijä Gli (Gli1, Gli2 ja Gli3) [9], [10]. Gli1 on vahva positiivinen aktivaattori alavirran kohdegeenien ja on itse transkription kohteena SHH-reitin [11]. Näin ollen, Gli1 pidetään markkerina SHH-reitin poikkeava aktivaatio [10], [12].

Viime aikoina useita CSCS tai CSLCs on tunnistettu ja eristetty pahanlaatuisia kasvaimia [13] - [25]. Mahasyövän, menetelmällisesti, sitä on vaikea eristää ja vahvistaa CSCS solulinjoista tai kasvain kudosnäytteitä. Tällä hetkellä, CD44 näyttää olevan kaikkein käyttökelpoinen markkeri mahdollisille puhdistamiseksi mahalaukun CSCS, mutta se ei ole erittäin spesifinen mahalaukun CSCS [26].

Tässä tutkimuksessa olemme eristetty CSLCs ihmisen mahalaukun syöpäsolun linjat (HGC-27, MGC-803 ja MKN-45) käyttäen tumorsphere viljellään seerumittomassa väliaineessa ja tunnistanut kyky uusiutua, chemoresistance ja tuumorigeenisia kapasiteetti tumorsphere solujen Seuraavaksi tutkimme ilmentymisen SHH-reittiin liittyvien molekyylien, mukaan lukien Shh, Ptch, Smo, Gli1 ja Gli2 in tumorsphere soluissa ja kiinnittyneet solut, erityisesti ilmaus Ptch ja Gli1.Then, me estänyt SHH reitin syklopamiinilla tai valvontaa tomatidine, 5E1 tai ohjata PBS tutkimaan, onko ominaisuudet CSLCs in tumorsphere soluja pidettiin epänormaali aktivaatio SHH kautta. Lopuksi, käytimme ensisijainen mahasyövän näytteitä analysoida toiminnallisia ominaisuuksia SHH reitin mahalaukun CSLCs.

Syklopamiini on solun läpäisevä steroideihin alkaloidi. Se häiritsee kolesterolin bio- synteesiin ja erityisesti antagonisoi SHH signalointireitin kautta suora vuorovaikutus Smo (tasoittaa), kaukainen sukulainen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien. Se on arvokas työkalu tutkittaessa osallistumista SHH signaloinnin kehittää erilaisia ​​kasvaimia. Tomatidine on steroideihin alkaloidi, joka rakenteellisesti muistuttaa syklopamiini, mutta siitä puuttuu kyky estää SHH signalointia. Sitä voidaan käyttää negatiivisena kontrollina. 5E1 on anti-Hh monoklonaalinen vasta-aine, joka neutraloi SHH ja IHH toimintaa.

Tulokset

1. Tumorsphere solut hallussaan ominaisuudet CSLCs

kasvoi HGC-27, MGC-803 ja MKN-45 tarttuneet solut seerumivapaassa väliaineessa kuvattu menetelmiä osassa. Jälkeen 7 päivää, tumorspheres koostuu noin 50-100 soluja havaittiin (Fig. 1A).

itseuudistuvien kapasiteettia näiden tumorspheres arvioitiin dissosioimalla ne yhteen soluun ja kasvava kloonitiheydessä 1000 solua millilitraa kohden. 2 viikon kuluttua, yksi solu on johdettu HGC-27 tumorsphere soluissa syntyy osa-tumorspheres on 41,83% ± 3,13% verrattuna 8,17% ± 2,40% ja kiinnittyneet solut, lisäksi on MGC-803 ja MKN-45, osa-tumorspheres muodostumisen nopeudella tumorsphere soluja oli myös korkeampi kuin tarttuvien solujen. (Fig. 1 B). Nämä tiedot osoittivat, että itseuudistuvien kapasiteetti tumorsphere solujen oli merkittävästi korkeampi kuin tarttuvien solujen. Tumorsphere soluissa osoitti myös lisääntynyt kyky muodostaa pesäkkeitä alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa standardin pehmytagar määritys 14 vuorokauden kuluttua HGC-27 ja MKN-45 (Fig. 1 C).

suoritettiin myös rajoittava laimennus määritys sferoidia muodostumista käyttämällä HGC-27 tumorsphere solut ja kiinnittyneitä soluja, tässä järjestyksessä. Kuten on esitetty taulukossa S1, noin 27-35% on tumorsphere solut voisivat tuottaa sferoideja, kun taas vähemmän kuin 5% kiinnittyneet solut voitaisiin tuottaa sferoideja jälkeen 3 viikkoa kulttuuriin. Siksi HGC-27 tumorsphere soluja, voimme arvioida, että sferoidit muodostavien solujen populaation, joka koostuu korkeintaan 35%.

Chemoresistance on toinen ominaisuus CSCS, joten tutkimme, onko ero chemoresistance välillä oli tumorsphere solut ja tarttuneet solut. Tulokset osoittivat, että 48 tunnin kuluttua, tumorsphere solut osoittivat merkitsevästi suurempi resistenssi lääkkeille verrattuna tarttuvien solujen samoissa olosuhteissa (Kuva. 1 D). Meillä on myös arvioitu chemoresistance ja HGC-27 tumorsphere soluja ja kiinnittyneet solut eri lääkkeiden pitoisuudet, kuitenkin, sekä tumorsphere solut ja tarttuneet solut eivät osoittaneet merkittävästi chemoresistance huumeiden annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. S1).

Seuraavaksi tutkimme ilmentymistä CD44 dissosioituneissa tumorsphere soluissa ja tarttuneet solut käyttävät immunofluoresoivan määritystä ja western blot. Tulokset osoittivat, että solut, jotka ilmentävät CD44 olivat merkittävästi enemmän tumorsphere soluissa kuin kiinnittyneitä soluja (Fig. 2A). Lisäksi ilmaisu muiden CSCS merkkiaineita (CD24 ja CD133) on tumorsphere soluissa ja tarttuneet solut tutkittiin Western blot, verrattuna tumorsphere solujen ilmentymisen CD24 oli merkitsevästi pienempi kiinnittyneet solut, kun taas ekspressio CD133 oli samanlainen (kuvio . 2B). Edelleen, me fraktioidaan HGC-27 solujen FACS-lajittelu CD44, olemme havainneet, että CD44 (+) solujen osa voi tuottaa enemmän pallomainen pesäkkeitä verrattuna CD44 (-) solufraktio lisäksi, että koko pallomaisten pesäkkeitä CD44 (+) solujen oli suurempi kuin niillä, CD44 (-) solut (Fig. 2C).

2. Tumorsphere soluja voisi tuottaa kasvaimia upon ksenotransplantaatio

ksenografti tutkimuksia, sama määrä (2 x 10 ^{4, 2 x 10 5, 2 x 10 6, 2 x 10 7) on vastaeroteltujen tumorsphere soluja tai kontrolli kiinnittyneitä soluja injektoitiin sc kuhunkin hiiri (6 hiirtä ryhmää kohti). Tulokset osoittivat, että kasvaimia tuotettiin 2 x 10 4 tumorsphere soluja, jotka oli 100 kertaa vähemmän kuin ne, joita vaaditaan kasvainten kylvö mukaan kiinnittyneitä soluja (taulukko 1). Lisäksi tumorsphere soluja syntyy ihon alle kasvaimien suuremman tilavuuden ja lyhyemmässä ajassa verrattuna tuotetaan kiinnittyneitä soluja (Fig. 3A, B). Näin ollen, ihonalainen injektio pieni määrä tumorsphere solujen vahvisti, että pallomainen solut säilytetään vahvempi tuumorigeenisiä kapasiteetti nude-hiirissä kuin kiinnittyneitä soluja.}

H &E-tarkastelu ksenograftien peräisin HGC-27 tumorsphere solut osoittivat, että näiden kasvainten läheisesti muistuttivat alkuperäinen ihmisen kasvain, joka koostuu lähinnä erilaistuneet solut (Fig. 3C). Tärkeää on, tumorspheres voitaisiin uudelleen johdettu ksenotransplantaatio kasvaimia (Fig. 3d), ja ne voivat muodostaa kasvaimen uudelleen (Fig. 3E). Nämä tiedot osoitti siten, että tumorsphere solut edustettuina CSLCs että oli kasvaimia synnyttäviä kapasiteettia.

3. SHH polku oli korkeampi ilmaistu tumorsphere soluissa kuin tarttuvat solut

Tutkiakseen välisen yhteyden SHH koulutusjakson ja CSLCs ominaisuudet tumorsphere soluja, ensin tutkittiin mRNA: t ilmaus SHH reittiin liittyvien molekyylien, kuten Shh, Ptch, smo, Gli1 ja Gli2 RT-PCR: llä. Tulokset osoittivat, että kaikki mRNA: t saatiin korkea ilmaistaan ​​HGC-27 tumorsphere soluja. Verrattuna tumorsphere solujen ekspressiotasot Shh, Ptch, Smo ja Gli1 oli huomattavasti alhaisempi kiinnittyneet solut, kun taas ekspressiotasot Gli2 olivat samanlaiset kuin tumorsphere soluihin. In MGC-803 ja MKN-45, ilmentymistasojen Shh, Ptch ja Gli1 olivat myös merkittävästi vähemmän tarttuneet solut kuin tumorsphere soluissa, kun taas ekspressiotasot Smo ja Gli2 ei ollut merkittävää eroa kiinnittyneet solut ja tumorsphere-soluissa (kuvio . 4A).

SHH koulutusjakson, Ptch ja Gli1 ovat kohde- geenejä, niitä pidetään tärkeänä merkkiaineiden SHH reitin epänormaalin aktivoitumisen. Näin on, tutkitaan edelleen ilmentymistasojen Ptch ja Gli1 Western blot ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä.

Kun käytetään Western blot, olemme havainneet, että ekspressiotasot Ptch ja Gli1 olivat myös korkeampia tumorsphere soluja kuin in kiinnittyneitä soluja (Fig. 4B). Me seuraavaksi arvioi ekspressiotasot Ptch ja Gli1 sisään ksenografteissa peräisin HGC-27 kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysit SHH kohdegeenien (PTCH ja GLI1) osoitti samat tulokset edellä semikvantitatiivisella RT-PCR: llä (Fig. 4C).

4. SHH polku esto vähensi itseuudistuvien kapasiteetti ja chemoresistance on HGC-27 tumorsphere solujen

testaamiseksi mahdollisen roolin SHH väylän itseuudistuvien kapasiteetti tumorsphere soluja, käytimme syklopamiini tai valvontaa tomatidine, 5E1 tai kontrolli-PBS-estää reitin.

tulokset osoittivat, että syklopamiinihoidon johti merkittävästi kapasiteetin vähennys muodostumista osa-tumorspheres in HGC-27 tumorsphere solujen annoksesta riippuvalla tavalla, mutta tällainen vaikutus havaittiin kiinnittyneitä soluja (Fig. 5A). Arvioimme lisäksi, onko hoitoa syklopamiinilla vaikuttaisi pesäkkeet muodostumiseen kapasiteettia HGC-27 tumorsphere soluissa ankkurointi riippumattaman kasvun määrityksessä. Samoin kyky muodostaa pesäkkeitä väheni enemmän tumorsphere soluissa annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kiinnittyneet solut (Fig. 5B).

Seuraavaksi tutkimme vaikutus SHH reitin on chemoresistance ja HGC -27 tumorsphere soluja, käsittelimme erottaa solut syklopamiinilla tai ohjaus tomatidine 48 tuntia, ja sitten lääkeresistenssin tumorsphere solujen arvioitiin. Kun syklopamiinia seurasi lääkkeet, hoito johti merkittävästi parannettu yleistä solujen kuolleisuus. Parhaat tulokset saatiin, kun syklopamiinihoidon yhdistettiin Oksaliplatiini plus mitomysiini (Fig. 5C). Ei ole tällaista synergistinen vaikutus havaittiin kiinnittyneet solut altistuksen jälkeen lääkkeitä syklopamiinilla 48 tunnin ajan (Fig. 5D).

määritettiin myös vaikutus eri pitoisuuksia syklopamiinin (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) solukuolemaan. Tulokset osoittivat, että syklopamiini yksin tumorsphere solut voitaisiin tehdä pieni mutta johdonmukainen lasku elävien solujen määrä. Verrattuna HGC-27 tumorsphere solujen vaikutus syklopamiinin solukuoleman ja kiinnittyneet solut oli merkitystä (Fig. 5C, D).

Kun SHH reitti on estetty 5E1 tai valvoa PBS, tulokset itsenäisten -renewing kapasiteetti ja chemoresistance on tumorsphere solujen ja kiinnittyneet solut olivat samanlaisia ​​kuin estetty syklopamiinilla tai ohjaus tomatidine (Fig. S2).

5. SHH reitin esto parantaa kasvaimen vaste huumeiden in vivo

Tämän hypoteesin testaamiseksi in vivo, analysoimme onko SHH reitin esto tehostetun kemoterapian tehoa, syklopamiini tai kontrolli tomatidine käytettiin estämään SHH reitin vasteita. HGC-27 tumorsphere solujen annettiin kasvaa sekä takana paljaiden hiirien kylkiin, kunnes suurempi halkaisija kasvaimen oli noin 2 mm. Hiiriä käsiteltiin sitten kahdesti viikossa 3 viikkoa syklopamiinilla tai ohjattu tomatidine 24 tuntia ennen Oksaliplatiini toimitusta. Kaikissa käsitellyissä hiirissä kasvaimet hoidettiin Oksaliplatiini olivat merkittävästi pienempiä kuin ei käsitelty Oksaliplatiini. Lisäksi kasvaimet verrokkeja useammin kasvaimen kasvun estäminen, kun niitä käsiteltiin Oksaliplatiini yhdistettynä syklopamiinilla, kasvaimen vaste kemoterapeuttinen lääke oli parannettu syklopamiinilla (Fig. 6A, B). Tutkimme myös, onko SHH reitin estänyt 5E1 tai ohjata PBS tehostetun kemoterapian tehoa in vivo, tulokset osoittivat, että 10 ug /ml 5E1 hoito johti huomattavasti suurempi kasvaimen kasvun estäminen kuin vain hoidettiin Oksaliplatiini (Fig. 6A, B).

Nämä tiedot osoittivat, että vaikka standardi kemoterapeuttisten viivästynyt kasvaimen kasvulta hoidon aikana, kun ne yhdistettiin syklopamiinilla tai 5E1, tehoa kemoterapia merkittävästi parannettu ja myös jatketaan sen jälkeen, hoidon keskeyttämistä.

Seuraavaksi tutkia esto SHH reitin in vivo oli erityinen vaikutus HGC-27 tumorsphere soluissa. Hiiriä vasta käsiteltiin syklopamiinin oikeaan taka kylki tai ohjaus tomatidine vasemmassa takana kylki (kahdesti viikossa 3 viikon ajan), kun kasvainten HGC-27 tumorsphere solut saavuttivat noin 2 mm, 3 viikon kuluttua, teimme rajoittavan laimennuksen määrityksen sferoidit muodostumista käyttäen kasvainsoluja käsiteltiin syklopamiinilla ja käsiteltiin tomatidine, vastaavasti. Kuten on esitetty taulukossa S2, noin 9-15% soluista peräisin ksenotransplantaatio kasvaimen käsiteltiin tomatidine voisi tuottaa pallosia, kun taas alle 2,5% soluista peräisin ksenotransplantaatio kasvaimen käsiteltiin syklopamiinilla voisi tuottaa pallosia. Siksi esto SHH reitin in vivo voisi vähentää määrää mahalaukun CSLCs.

6. SHH polku säilytti mahalaukun CSLCs ominaisuudet tumorsphere solujen primäärikasvain näytteistä

Voit selvittää SHH reitin voisi osallistua mahalaukun CSCS ominaisuudet tumorsphere solujen mahasyöpä kudoksesta, käytimme ensisijainen mahasyövän näytteet analysoidaan toiminnalliset näkökohdat SHH reitin mahalaukun CSLCs.

ensin kasvoivat vastaeroteltujen irtotavarana soluja mahasyöpä yksilöt seerumittomassa väliaineessa kuvattu -osiossa on 10 päivän jälkeen, tumorspheres havaittiin (Fig. 7A, B). Sitten tutkimme chemoresistance ja tuumorigeenisia kapasiteetti tumorsphere solujen mahasyöpä kudoksesta. Tulokset osoittivat, että tumorsphere soluja mahasyöpä kudoksesta osoitti merkittävästi suurempi vastustuskyky lääkkeille kuin irtotavarana soluja samoissa olosuhteissa (Fig. 7C). Lisäksi vastaeroteltujen irtotavarana soluja mahasyöpä näytteitä ruiskutettiin 2 x 10 ^{7 solua per hiiri olivat omiaan osoittamaan ihonalainen kasvaimia, kun taas niin vähän kuin 2 x 10 4 tumorsphere solujen mahasyöpä yksilöt voivat muodostaa kasvaimet (taulukko 1) ksenograftit kasvaimia, jotka johtuivat injektion tumorsphere solujen esitetty sama histopatologia ominaisuudet kuin niiden ihmisen kasvain (Fig. 7F). Nämä tulokset osoittivat, että tumorsphere soluja mahasyövän kudoksesta hallussa ominaisuudet CSLCs. Seuraavaksi havaitaan vaikutus SHH-reitin estäminen on chemoresistance of tumorsphere solujen in vitro ja kasvaimen vasteen lääkkeille in vivo. Tulokset osoittivat, että syklopamiini tai 5E1 voisi johti merkittävästi parannettu yleinen solukuolemaa korko (Fig. 7D) ja kasvaimen vaste huumeiden (Fig. 7E).}

Keskustelu

CSCS monia yhteisiä ominaisuudet kudoksen kantasolujen, kuten itseuudistumisen, leviämisen, chemoresistance, ja ovat ensisijaisesti vastuussa yllä kasvainten kasvua [27], [28]. Monet tutkijat ovat käyttäneet fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu tunnistamiseksi ja eristämiseksi CSCS ja todenneet, että nämä solut voivat muodostaa palloja erikoistuneissa seerumia. Tässä tutkimuksessa, otimme päinvastainen lähestymistapa kehittämällä tumorsphere solut ja sitten määritetään, onko näissä soluissa hankittu CSCS ominaisuudet.

Käytimme määritelty seerumittomassa väliaineessa, joka koostuu EGF, FGF-2, B-27 täydentää ja N-2 täydentää säilyttää mahasyövässä solulinjoissa. Nämä ehdot oli käytetty ennen säilyttää endogeenisen hermostoputken varsi /esisolujen ja kasvaimen kantasoluja ihmisen kasvaimista ja kasvainsolulinjoissa. Esimerkiksi Kondo et ai. [24] ominaista C6 rotan kasvain solulinja in vitro ja in vivo ja havaittiin pieni populaatio kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ovat peräisin hyvin tunnettu puolella väestöstä. Setoguchi et ai. [29] osoittaa, syövän kantasoluja, kuten solun mahdollisten muiden syöpäsolulinjoissa, kuten MCF7 rintasyövän linja, B104 neuroblastooma, ja HeLa-adenokarsinooma.

Meidän kokeessa käytimme kolme mahasyövän solulinjoja (HGC- 27, MKN-45 ja MGC-803) kulttuuriin tumorspheres. HGC-27-solulinja perustettiin kulttuurin metastaattisen imusolmuke peräisin mahasyöpä potilas diagnosoitu histologinen kuten erilaistumaton karsinooma. MKN-45 perustettiin päässä huonosti eriytetty adenokarsinooma vatsaan 62-vuotiaan naisen. MGC-803 on epiteelin huonosti eriytetty ihmisen mahalaukun limakalvoon-Adenokarsinoomasolulinja peräisin 74-vuotiaan miehen.

Kaksi erilaista lähestymistapaa on tyypillisesti käytetty tunnistamaan CSCS julkaistuissa tutkimuksissa [30], [31] . Yksi on in vitro -menetelmä kutsutaan "pallomainen pesäkkeiden muodostumista," ja toinen on in vivo -menetelmä, johon istuttaminen ehdokas CSCS ihon alle immunopuutoksesta hiirillä.

Entinen Menetelmässä viljellään ehdokas CSCS viljelymaljoilla erikoispinnoitettuja varten noncell kiinnitys seerumittomassa elatusaineessa, joka sisältää kasvutekijän ja emäksinen fibroblastikasvutekijä. Kasvu pallomaisen pesäkkeiden muutaman viikon pidetään osoituksena itseuudistumisen kyky, ja olisi sopusoinnussa CSC fenotyyppi. Jälkimmäinen menetelmä-solujen kasvua immuunivajaissa hiirillä-tarvitaan osoittamaan todellisen tuumorigeenisyyteen ja pidetään yleisesti kultakantaan todistaa olemassaolon CSCS. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä kaksi lähestymistapaa tarjoavat yleensä samanlaisia ​​tuloksia arvioitaessa ehdokas CSCS monien kiinteiden kasvaimien.

Tällä hetkellä, mahalaukun CSCS ole spesifinen pinta-päättäjät, joten olemme kehittäneet tumorsphere soluja, ja sitten määritetään, onko näiden solujen hankittu CSCS ominaisuuksia, kuten itseuudistuvien kapasiteettia, chemoresistance ja tuumorigeenisia kapasiteettia.

Tuloksemme osoittivat, että mahasyövän solulinjoissa (HGC-27, MGC-803, MKN-45) kasvatettiin määritelty serum- väliaineessa voisivat muodostaa tumorspheres jotka sisälsivät solut käyttäytyvät kuin CSLCs. In vitro, tumorsphere solut osoittivat lisääntynyttä kykyä muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa ja lisääntynyt kyky muodostaa osa-tumorspheres. Osoitimme myös, että itseuudistumisen kyky muodostaa sub-tumorspheres of HGC-27 tumorsphere soluilla oli nousu kohtia 2-8 (44,5% jopa 70,5%), ja sen jälkeen se säilyy suhteellisen vakaa suhteessa jälkeen 8 tai enemmän Käytävät kasvanut kloonitiheydessä (Fig. S3). Nämä tiedot osoittivat, että proliferatiivista potentiaalia tumorsphere solujen säilyi jälkeen laajennettu kohtia. Lisäksi tumorsphere soluissa in vitro olivat vastustuskykyisempiä Oksaliplatiini ja mitomysiini verrattuna kiinnittyneet solut, nämä tiedot osoittivat, että tumorsphere solut koostuvat rikastettua numerot CSLCs, joka mahdollisesti tehnyt niistä vähemmän alttiita ottaen sekä Oksaliplatiini ja mitomysiini. In vivo, tumorsphere solut voivat tuottaa kasvaimia kun ksenotransplantaatio suuremmalla nopeudella kuin tarttuneet solut. Lisäksi tumorsphere soluja syntyy ihonalainen kasvaimista suurempaa ja lyhyemmässä ajassa verrattuna syntyvät kiinnittyneet solut, Tärkeää on, tumorspheres voitaisiin uudelleen johdettu ksenotransplantaatio kasvaimia, ja ne voisivat muodostaa kasvaimen uudelleen, nämä tiedot osoittivat, että tumorspheres rikastuneet CSLCs .

tutkimuksessamme, kiinnittyneet solut oletettavasti sisälsi suhteellisen pieni prosenttiosuus CSCS, koska mitään menetelmää eristämistä tai poistamista näiden solujen on käytetty. Voidaan väittää, että se on tämä pieni väestö CSCS joka on vastuussa kasvaimen muodostumisen. Riippumatta, lisää CSCS näkyivät tumorsphere soluissa, mikä saattaa selittää sen aggressiivinen käytös.

Seuraavaksi, tutkimme ominaisuudet CSLCs vuonna tumorspheres säilyivät epänormaali aktivaatio SHH reitin. Ensin osoitettiin, että mRNA: n ilmentymisen tasot SHH-reittiin liittyvien molekyylien (Shh, Ptch ja Gli1) olivat merkittävästi korkeammat tumorsphere soluissa kuin kiinnittyneet solut, kun taas Gli2 oli korkea ilmaistuna molemmissa soluissa. Olemme lisäksi tutkineet ekspressiotasot SHH reitin kohdegeenien (Ptch ja Gli1) Western blot ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n tulokset olivat samanlaisia ​​kuin RT-PCR: llä. Toiseksi inhibitio SHH signalointia syklopamiinilla tai 5E1 vähensivät kyky uusiutua ja lisääntynyt herkkyys huumeiden HGC-27 tumorsphere soluja, mutta nämä vaikutukset eivät lausutaan tarttuneet solut. In vivo, kaikilla käsitellyillä hiirillä, käsitellyt kasvaimet Oksaliplatiini olivat merkittävästi pienempiä kuin ei käsitelty Oksaliplatiini, käsittelyn jälkeen syklopamiini tai 5E1, kasvaimen vaste kemoterapeuttisten parannettiin. Nämä tiedot osoittivat, että vaikka standardi kemoterapeuttisten viivästynyt kasvaimen kasvulta hoidon aikana, kun ne yhdistettiin syklopamiinilla, teho kemoterapia merkittävästi parannettu ja myös jatketaan sen jälkeen, hoidon keskeyttämistä.

Lopuksi käytimme ensisijainen mahasyövän näytteitä analysoida toiminnallisia ominaisuuksia SHH väylän mahalaukun CSLCs. Tulokset osoittivat, että tumorsphere soluja mahasyöpä näytteestä oli myös chemoresistance ja tuumorigeenisia kapasiteetin lisäksi SHH reitin esto vähensi chemoresistance on tumorsphere solujen ja parannettu tuumorivaste huumeita in vivo.

Kuten chemoresistance useita piirteitä CSCS voi ne vaikea poistaa. CSCS ovat suhteellisesti lepotilassa ja tämä antaa niille mahdollisuuden paeta solunsalpaajahoitojen että tyypillisesti kohdistamaan aktiivisesti solusykli. Lisäksi, kuten on esitetty niiden normaali vastine, CSCS on ehdotettu näytteille korkean tason ilmentymisen monilääke kuljettajan perheen geenejä, todennäköisesti saadaan tehokkaammin ulosvirtaus kemoterapeuttisten lääkkeiden ja luontaisen monilääkeresistenttisyyden Lisäksi signalointireittien, kuten Wnt, Hedgehog tai Notch, ovat väärin säädellystä vuonna CSCS johtaa kasvainten kehittymiseen. Kehittäminen tehokas terapeuttinen lähestymistapa siis edellyttävät, erottuva molekyyli reittejä aktiivinen CSCS ja tunnistaminen aineita, jotka voivat joko estää CSC lisääntymistä tai aiheuttaa CSC erilaistumista, mikä parantaa herkkyyttä kemoterapeuttisten. Niin tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat chemoresistance on CSCS ovat sisäisiä piirteitä. Mikroympäristö tai kapealla, voivat vaikuttaa kykyyn CSCS lisääntyä, siirtää tai hyökätä. Kapealla on ankkurointi sivusto CSCS, ja adheesiomolekyylit tai microenvironmental liukoiset molekyylit, kuten kasvutekijöiden ja sytokiinien, voi merkittävästi edistää vastareaktioita terapiaan. Vaikka esto SHH reitin syklopamiinilla tai 5E1 olisi hyödyllinen strategia, tutkimuksessamme osoitimme, että reseptorin komponentti Ptch ja transkriptiotekijä Gli1 myös korkea ilmaistu tumorsphere soluissa. Joten, Ptch tai Gli1 voisi olla vaihtoehto tavoite hoitoon mahasyövän. Yksi mahdollinen strategia on käyttää Sirna (siRNA) tai shRNA spesifisiä Ptch tai Gli1, mutta mahalaukun CSLCs in tumorsphere soluissa eivät ole olleet täysin puhdistettuja, meidän täytyy vielä puhdistaa mahalaukun CSLCs, joten tämä työ tehdään meidän edelleen tutkimus.

Yhteenvetona osoitimme että SHH polku voisi olla mukana itseuudistumisen, leviämisen, lääkeresistenssin ja tuumorigeeniset sekä tumorsphere solujen ja viittaavat siihen, että strategiat, joilla pyritään estämällä SHH polkuja edustavat perusteita terapeuttinen lähestymistapa kohdistaa mahalaukun CSCS.

Materiaalit ja menetelmät

Animal Ethics lausunto

Male atyymisissä karvattomia hiiriä (nu /nu), 6-8 viikkoa vanhoja, saatiin Beijing Vital-joen Lab animal Technology Co Ltd (SCXK JING 2007-0001) ja sijoitettiin häkkeihin patogeenivapaissa olosuhteet este eläimen laitokseen. Kaikki hiiret suoritettiin hyväksyttyjen suuntaviivojen Laboratory Animal Center of Academy of Military Medical Sciences (SYXK kesäkuu 2002-001).

Culture of kiinnittyneet solut, tumorspheres ja Saharan tumorspheres

Ihmisen mahasyövän solulinjoja (HGC-27, MGC-803 ja MKN-45) on saatu Peking unionin Medical College, viljeltiin 1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja maljattiin tiheydellä 1 x 10 ^{6 elävien solujen per 75-cm 2 pulloon. Kun solut kiinnitetään, me kuljetettiin niiden tulla yhtymäkohta. Tumorspheres saatiin asettamalla kiinnittyneet solut seerumittomalla 1640 elatusaineessa, joka sisälsi 1% N-2 lisä (Invitrogen), 2% B-27 täydentää (Invitrogen), 1% antibioottia seosta (Gibco), 20 ng /ml ihmisen FGF -2 (Chemicon), ja 100 ng /ml EGF: ää (Chemicon), ja kiinnittyneet solut maljattiin 24-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevy (Corning) 500 solua kuoppaa kohti. 2 viikkoa myöhemmin, levyt analysoitiin tumorspheres muodostumista ja kvantitoitiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus) 40 x ja 100 x suurennus.}

Kun ensisijainen tumorspheres saavutti koon noin 200-500 solua per osa- alueessa tumorspheres hajotettiin tiheydellä 1000 solua millilitraa kohti, ja 100 ui yksisoluinen suspensio ympättiin kuhunkin 24-kuoppaisen ultra-low kiinnityslevy (Corning) seerumittomassa väliaineessa edellä kuvatulla tavalla. Kukin kuoppa tutkittiin yhden solun, ja vain kuoppiin, jotka sisälsivät yhden solun oli merkitty. 2 viikkoa myöhemmin, kaivot analysoitiin Saharan tumorspheres muodostumista. Normaali kiinnittyneet solut käytettiin kontrollina kyky muodostaa osa-tumorspheres. Testata yhteyden SHH polku ja muodostumista Saharan tumorspheres, käsittelimme erottaa solut syklopamiinilla (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) tai kontrolli tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) tai ohjata PBS ja havaittiin muodostuminen sub-tumorspheres.

mahasyöpää kudosnäyte

ihmisen raikas, steriili mahasyövän kudosnäytteet saatiin noudattaen eettisiä institutionaalisten komitean ihmiskokeita 15 potilasta (ikä alue 70-85 vuotta), joille tehtiin mahalaukun syöpä resektio, saatuaan tietoisen suostumuksen potilailta (taulukko S3).

Tämän jälkeen näytteet upotettiin 95% etanolia 2-3 sekunnin saastumisen estämiseksi, ja pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja antibiootteja useita kertoja poistamiseksi verestä. Kun nämä pinta syövän kudosnäytteitä poistettiin ja sisäosat leikattiin 1-3 mm ^{3-kokoisiksi paloiksi. Sitten ne digestoitiin kollagenaasin ja dispaasin liuokseen 37 ° C: ssa, sen jälkeen 4 h inkuboinnin sisältävä liuos pilkottu kudosten sentrifugoitiin poistamiseksi kollagenaasin liuosta. Solupelletti pestiin kerran 1640-alustassa, ennen kuin se suspendoitiin seerumittomaan 1640-alustassa, joka sisälsi 1% N-2 täydentää, 2% B-27 täydentää, 1% antibiootti seosta, 20 ng /ml ihmisen FGF-2, 100 ng /ml EGF ja maljattiin 24-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyyn. Kaikkia viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: hautomakoneisiin mukana kostutetussa ilmassa ja 5% CO _2.}

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä

tarkkailemalla itseuudistuvien kapasiteettia edelleen, pehmeä agar määritystä käytettiin määrittämään pesäkkeiden muodostumista tumorsphere solujen ja tarttuneet solut alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa. Kukin kuoppa kuuden kuoppainen levy päällystettiin 1 ml: lla 10% FBS: 1640-väliaineessa, jossa 1% agaroosia. Kun 20 min inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, yhtä paljon (500) tumorsphere soluja tai kiinnittyneitä soluja, lisättiin 1 ml: aan 10% FBS: 1640-väliaineessa, jossa oli 0,5% agaroosia. Testata yhteyden SHH polku ja pesäkkeiden muodostumista alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa, käsittelimme erottaa solut syklopamiinilla (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) tai kontrolli tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) tai ohjata PBS.

• PLoS ONE: Wnt /β-kateniinin Signaling Parantaa COX-2 (COX2) transkriptioaktiviteettia mahasyövän Cells
• PLoS ONE A Computational Menetelmä ennustaminen excretory Proteiinit ja soveltaminen tunnistaminen mahasyövän Markers in Urine