PLoS ONE: Sonic jež Put je bitno za održavanje raka matične stanice nalik na ljudskog želuca Cancer

Sažetak pregled

Nenormalan aktivacija Sonic jež (SHH) put je opisan u raznim vrstama raka u čovjeka i rak matičnih stanica (eksplozivnim dizanjem utega), međutim, uloga SHH puta u želučanim eksplozivnim dizanjem utega nije prijavio. U ovoj studiji istraživali smo mogućnost da abnormalna aktivacija SHH put održava karakteristike želučane eksplozivnim dizanjem utega. Prvo smo utvrdili raka matične stanice nalik (CSLCs) iz ljudskih staničnih linija raka želuca (HGC-27, MGC-803 i MKN-45) pomoću tumorsphere kulturu. U usporedbi s vezanim stanicama, plutajuće tumorsphere stanice imaju više samo-obnavljanja kapaciteta i kemijska otpornost. Stanice koje eksprimiraju eksplozivnim dizanjem utega markera (CD44, CD24 i CD133) također su bili značajno više u tumorsphere stanicama nego u vezanim stanicama. Što je još važnije, in vivo studije su pokazali da ksenografta tumora može se proizvesti 2 × 10 ^{4 tumorsphere stanica, što je 100 puta manja od one potrebne za tumore zasijanih od adherentnim stanicama. Dalje, RT-PCR i Western blot je pokazala da je razina ekspresije PTCH i Gli1 (SHH put ciljnih gena) bila je značajno viša u tumorsphere stanicama nego u vezanim stanicama. Rezultati kvantitativni PCR u realnom vremenu su bili slični onima u RT-PCR i Western blot. Daljnja analiza pokazala je da SHH put blokirao cyclopamine ili 5E1 izazvao veću redukciju u samo-obnavljanja kapaciteta HGC-27 tumorsphere stanica nego kod vezanim stanicama. Također smo otkrili da SHH put blokira jako poboljšana učinkovitost kemoterapijskih lijekova u HGC-27 tumorsphere stanica in vitro i in vivo, ali nije imao značajan učinak u vezanim stanicama. Konačno, izolirani smo tumorspheres iz želuca kod rak, ove stanice su također imali kemijska otpornost i tumore kapaciteta i SHH put održava želučanog CSLCs karakteristike tumorsphere stanica iz uzoraka primarnih tumora. U zaključku, naši podaci sugerirao da SHH put bio neophodan za održavanje CSLCs u ljudskoj raka želuca pregled}

Izvor:. Pjesma Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic jež Put je bitno za održavanje raka matične stanice nalik na ljudska raka želuca. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687 pregled

Urednik: Mihail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, United States of America pregled

Primljeno: 27. studenog 2010; Prihvaćeno: 10. veljača 2011; Objavljeno: 4 ožujak 2011 pregled

Copyright: © 2011 Tekstovi i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane National High Technology programa istraživanja i razvoja Kine (È6AA402A04,È6AA02A107), glavni Državni Basic Research programa Kine (È9CB521704) i Nacionalne zaklade Nature Science of China (Ĵ72468,Ĵ73031). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

eksplozivnim dizanjem utega igraju važnu ulogu u razvoju raka, ovaj subpopulacija u tumoru ima karakteristike samo-obnavljanja kapaciteta, kemijska otpornost i tumorskih kapaciteta tako može igrati ključnu ulogu u inicijaciji, napredovanje i recidiva raka. Ispitivanje i manipuliranje biokemijskih putova uključenih u tim karakteristikama je jedan od najboljih načina pridonosi eksplozivnim dizanjem utega, što je dovelo do razvoja novih lijekova i postupaka liječenja. SHH put igra ključnu ulogu u mnogim eksplozivnim dizanjem utega, kao što je glioblastom matičnih stanica [1], [2], CD34 + stanice leukemije [3], [4], a grudi eksplozivnim dizanjem utega [5], osim toga, to je presudno za razvoj i homeostaza želučane žlijezde [6], abnormalna aktivacija SHH puta može dovesti do raka želuca [7], [8], međutim, uloga SHH puta u želučanom eksplozivnim dizanjem utega nije jasno.

Tiho put u stanice sisavaca je posredovan liganada shh [9]. U odsutnosti Shh, transmembranski receptor zakrpanim (PTCH) inhibira aktivnost drugog transmembranski protein, zaglađena (SMO), što je rezultiralo u inaktivacije SHH puta [9], [10]. Vezanje SHH za PTCH prekida inhibitorni efekt PTCH i SMO je derepressed, čime se aktivira transkripcijski faktor Gli (Gli1, Gli2 i Gli3) [9], [10]. Gli1 je jaka pozitivna aktivator nizvodno ciljnih gena i sam transkripcije meta SHH puta [11]. Stoga se smatra Gli1 biljeg SHH slijeda abnormalne aktivacije [10], [12] pregled

Nedavno je nekoliko vrsta eksplozivnim dizanjem utega ili CSLCs su identificirane i izolirane od malignih tumora [13] - [25].. U karcinomu želuca, metodološki, to je teško izolirati i pojačati eksplozivnim dizanjem utega iz staničnih linija ili uzoraka tkiva tumora. U današnje vrijeme, CD44 Čini se da je većina koristan marker za potencijalnog pročišćavanje želuca eksplozivnim dizanjem utega, međutim, to nije vrlo specifična za želučane eksplozivnim dizanjem utega [26]. Pregled

U ovoj studiji, izolirani smo CSLCs iz ljudskog želuca stanične linije raka (HGC-27, MGC-803 i MKN-45) pomoću tumorsphere uzgoja u mediju bez seruma i identificirali sposobnost samoobnavljanja, kemijska otpornost i tumore kapacitet tumorsphere stanica; Sljedeći, ispitali smo ekspresiju SHH puta sinteze povezanih molekula, uključujući SHH, PTCH, SMO, Gli1 i Gli2 u tumorsphere stanicama i vezanim stanicama, posebno izraz PTCH i Gli1.Then, blokirani smo SHH put od cyclopamine ili kontrolne tomatidine, 5E1 ili kontrolu PBS istražiti da li su karakteristike CSLCs u tumorsphere stanica održava abnormalne aktivacije SHH puta. Konačno, koristi se primarnih uzoraka raka želuca analizirati funkcionalne aspekte SHH puta u želučanim CSLCs. Pregled

Cyclopamine steroidni alkaloid stanica propusna. To narušava kolesterola biosinteze i posebno antagonizira SHH signalni put kroz izravnu interakciju s SMO (zaglađena), rođak G-protein vezanih receptora. To je vrijedan alat za proučavanje uključenost SHH signalizaciju u razvoju raznih tumora. Tomatidine steroidni alkaloid koji je strukturno sličan cyclopamine, ali nema sposobnost da inhibira Pst signalizaciju. To se može koristiti kao negativna kontrola. 5E1 je anti-Hh monoklonalno antitijelo koje neutralizira djelovanje Psst i IHH. Pregled

Rezultati pregled

1. Tumorsphere stanice posjedovao karakteristike CSLCs

Odrasli smo HGC-27 MGC-803 i MKN-45 adherentne stanice u mediju bez seruma opisane u odjeljku postupcima. Nakon 7 dana tumorspheres se sastoji od oko 50 do 100 stanica zabilježene su (sl. 1). Pregled

samo-obnavljanja kapacitet ovih tumorspheres je određen im odvajanja u jednu ćeliju i raste na klonske gustoće 1,000 stanica po mililitru. Nakon 2 tjedna, jedna stanica izvedena iz HGC-27 tumorsphere stanica dobivenih pod-tumorspheres na 41.83% ± 3,13% u usporedbi s 8,17% ± 2,40% od vezanim stanicama, osim toga, u MGC-803 i MKN-45, formiranje pod-tumorspheres stopa tumorsphere stanica su bili viši od onih adherentnih stanica. (Sl. 1B). Ovi podaci sugerirali da je samo-obnavljanja kapaciteta tumorsphere stanica bila je značajno viša od one vezanim stanicama. Tumorsphere stanice također su pokazali povećanu sposobnost stvaranja kolonija pod pričvršćivanje neovisno uvjetima u standardnom testu mekom agaru nakon 14 dana u HGC-27 i MKN-45 (Sl. 1C). Pregled

također izvodi ograničavajući razrjeđenja test za formiranje sferoidima pomoću HGC-27 stanice i tumorsphere prijanjajuće stanice, pojedinačno. Kao što je prikazano u Tablici S1, približno 27-35% od tumorsphere stanica može proizvesti sferoida, a manje od 5% priljepljenih stanica može proizvesti sferoida nakon 3 tjedna kulture. Dakle, u HGC-27 tumorsphere stanica, možemo procijeniti da su kuglice koje stvaraju stanice populacije čine maksimalno 35%. Pregled

kemijska otpornost je još jedna karakteristika eksplozivnim dizanjem utega, tako da smo istraživali da li je razlika u kemijska otpornost postoji između tumorsphere stanice i prijanjajuće stanice. Rezultati su pokazali da je, nakon 48 sati, stanice tumorsphere pokazuje znatno veću otpornost na lijekove u usporedbi s adherentnim stanicama pod istim uvjetima (sl. 1d). Također se ocjenjuje kemijska otpornost HGC-27 tumorsphere stanica i adheriranih stanica na različite koncentracije lijekova, međutim, obje tumorsphere stanice i pričvršćene stanice ne pokazuju značajno kemijska otpornost na lijekove na način ovisan o dozi (sl. S1). pregled

Dalje je ispitan na ekspresiju CD44 u disociranom tumorsphere stanicama i adherentnim stanicama pomoću Imunofluorescentni testa i western blot. Rezultati su pokazali da su stanice koje eksprimiraju CD44 bile su značajno više u tumorsphere stanicama nego u vezanim stanicama (Sl. 2). Štoviše, izraz drugim eksplozivnim dizanjem utega markera (CD24 i CD133) u tumorsphere stanica i vezanim stanicama se ispituje western blot, u usporedbi s tumorsphere stanicama, ekspresija CD24 bila je značajno niža u vezanim stanicama, dok je ekspresija CD133 bio je sličan (Sl . 2B). Nadalje, razdijeljen smo HGC-27 stanice FACS sortiranje za CD44, otkrili smo da CD44 (+) frakcija stanica može generirati više sferoidne kolonije u usporedbi s CD44 (-) frakcije stanica, Štoviše, veličina sferoidnih kolonije od CD44 (+) stanica bio je veći od onih iz CD44 (-) (Sl. 2C). stanice pregled

2. Tumorsphere stanice mogu generirati tumora nakon transplantacije Netlogu

Za stranog tijela studija, jednakog broja (2 × 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) svježe disocirane tumorsphere stanice ili kontrolu adherentne stanice je subkutano u svakog miša (6 miševa po skupini). Rezultati su pokazali da su tumori generira sa 2 × 10 4 tumorsphere stanica, što je 100 puta manje od onih koje su potrebne za tumor sijanje po vezanim stanicama (Tablica 1). Štoviše, tumorsphere stanice generiraju potkožne tumore s većim volumenom i kraće vrijeme u usporedbi s onima koji su generirani od vezanim stanicama (Sl. 3A, B). Tako, supkutana injekcija malog broja tumorsphere stanica potvrđena tome što u sferoidu stanice zadržane jači tumorogene kapacitet u miševima od adherentne stanice pregled}

H &, e pregled ksenograftova izvedenih iz HGC-27 tumorsphere stanica pokazala je da su tumori usko liči na izvornu ljudsku tumor, uglavnom sadržava diferencirane stanice (Sl. 3c). Važno je, tumorspheres može biti ponovno izvesti iz xenotransplanted tumora (Sl. 3D), i oni mogu formirati tumor ponovno (Sl. 3E). Ovi podaci, dakle, pokazuje da su tumorsphere stanice predstavljeni CSLCs koji su imali tumore kapaciteta. Pregled

3. SHH put bila veća izražena u tumorsphere stanicama nego u vezanim stanicama pregled

Kako bi istražili vezu između SHH put i CSLCs karakteristikama tumorsphere stanica, prvo smo ispitivali izraz mRNA iz SHH puta sinteze povezanih molekula, uključujući Tiho, PTCH, SMO, Gli1 i Gli2 pomoću RT-PCR. Rezultati su pokazali da su sve mRNA je visoko izražen u HGC-27 tumorsphere stanica. U usporedbi s tumorsphere stanica, razina ekspresije SHH, PTCH, SMO i Gli1 bile su značajno niže u vezanim stanicama, dok su razine ekspresije Gli2 bili slični tumorsphere stanice. U MGC-803 i MKN-45, razina ekspresije SHH, PTCH i Gli1 također su bili značajno niži u vezanim stanicama nego u tumorsphere stanicama, dok su razine ekspresije SMO i Gli2 imao značajnu razliku između vezanim stanicama i tumorsphere stanica (Sl . 4A). pregled

U SHH puta, PTCH i Gli1 su ciljani geni, oni se smatraju važnim markere SHH putevima abnormalne aktivacije. Dakle, mi dodatno istražiti razine ekspresije PTCH i Gli1 Western analizom i kvantitativnom real-time PCR. Pregled

Kada koristite Western blot, otkrili smo da je razina ekspresije PTCH i Gli1 su također veći u tumorsphere stanica nego u adherentnim stanicama (Sl. 4B). Sljedeće smo ocijenili razine ekspresije PTCH i Gli1 u ksenografta iz HGC-27 kvantitativnom realnom vremenu PCR. Kvantitativna realnom vremenu PCR analize ciljnih gena SHH (PTCH i GLI1) pokazala iste rezultate iznad polu-kvantitativnog RT-PCR (Sl. 4c). Pregled

4. SHH put blokiranje smanjio samoobnavljajuće kapaciteta i kemijska otpornost HGC-27 tumorsphere stanice

Za testiranje za moguće uloge SHH put u samo-obnavljanja kapaciteta tumorsphere stanica, koristili smo cyclopamine ili kontrole tomatidine, 5E1 ili kontrola PBS blokirati put. pregled

Rezultati su pokazali da cyclopamine tretman je doveo do značajno smanjenje sposobnosti za tvorbu pod-tumorspheres u HGC-27 tumorsphere stanica u način ovisan o dozi, ali takav učinak zabilježeno je u vezanim stanicama (Sl. 5A). Mi i dalje ocjenjuje da li bi tretman cyclopamine će utjecati na sposobnost formiranja kolonije HGC-27 tumorsphere stanica po sidrište neovisnim test rasta. Slično tome, sposobnost da se dobije kolonije su više u tumorsphere stanicama reducira u dozi zavisan o odnosu na adherentnim stanicama (Sl. 5B). Pregled

Zatim smo istraživali učinak SHH puta na kemijska otpornost HGC -27 tumorsphere stanica, pomiješa se Disocirane stanice s cyclopamine ili kontrolnog tomatidine 48 sati, i zatim je procijenjena otpornost lijek tumorsphere stanica. Kad cyclopamine je uslijedila lijekova, liječenje rezultiralo znatno poboljšane ukupne stope stanične smrti. Najbolji rezultati su dobiveni kada se pomiješa s cyclopamine Oksaliplatin plus mitomicin (Sl. 5C). Takav sinergistički učinak zabilježen u vezanim stanicama nakon izlaganja lijekova s ​​cyclopamine 48 sati (Sl. 5D). Pregled

i analiziran učinak različitih koncentracija cyclopamine (2.5 uM, 5 uM, 10 uM) na smrt stanica. Rezultati su pokazali da je samo cyclopamine da tumorsphere stanice može napraviti mali, ali dosljedno smanjenje broja vitalnih stanica. U usporedbi s HGC-27 tumorsphere stanica, učinak cyclopamine na stanične smrti u vezanim stanicama bio veći značaj (sl. 5 C, D). Pregled

Kada je SHH put bio blokiran 5E1 ili kontrolu PBS, rezultati sebe -renewing kapaciteta i kemijska otpornost tumorsphere stanica i vezanim stanicama bile su slične onima blokiran cyclopamine ili kontrolu tomatidine (sl. S2). pregled

5. SHH put blokira pojačan odgovor tumora na lijekove in vivo pregled

Kako bi testirali tu hipotezu in vivo, analizirali smo da li SHH put blokira poboljšanu kemoterapiju učinkovitosti, cyclopamine ili kontrole tomatidine se koristiti za inhibiciju odgovora Psst puta. HGC-27 tumorsphere stanice su ostavljene da rastu u obje stražnje bočne golih miševa dok veći promjer tumora dosegla oko 2 mm. Miševi su zatim tretirani dvaput tjedno tijekom 3 tjedna sa cyclopamine ili kontroli tomatidine 24 sata prije Oksalilplatin isporuke. U svih liječenih miševa tumora tretirane Oksaliplatin bili su značajno manji od onih koje ne pomiješa s Oksaliplatin. Štoviše, tumora pokazalo je značajno veću inhibiciju rasta tumora, kad su tretirani s Oksaliplatin u kombinaciji s cyclopamine, odgovor tumora kemoterapeutski lijek je pojačana cyclopamine (sl. 6A, B). Također smo istraživali da li SHH put blokiran 5E1 ili kontrolu PBS poboljšane kemoterapijom efikasnost in vivo, rezultati su pokazali da je 10 ug /ml 5E1 Tretman je doveo do značajno veće inhibicije rasta tumora u odnosu na one tretirane s Oksalilplatin (sl. 6A, B). pregled

Ovi podaci predlaže da, iako standardne kemoterapijske lijekove koji kasni tumora živaca za vrijeme liječenja, kada su u kombinaciji sa cyclopamine ili 5E1, djelotvornost kemoterapije je znatno poboljšana, a također još kontinuirana nakon prekida liječenja. pregled

Dalje, istražiti je li blokiranje SHH put in vivo ima specifični učinak na HGC-27 tumorsphere stanica. Miševi su tretirani samo cyclopamine u desnoj stražnjoj slabini ili kontrolne tomatidine na lijevi bok (dva puta na tjedan tijekom 3 tjedna), kada su tumori HGC-27 tumorsphere stanice dostignu oko 2 mm, nakon 3 tjedna, proveli smo test ograničavajući razrijeđenja za Sferoidi formiranje pomoću tumorskih stanica liječenih s cyclopamine i pomiješa s tomatidine, respektivno. Kao što je prikazano u Tablici S2, približno 9-15% stanica od xenotransplanted tumora tretiranih s tomatidine može proizvesti sferoida, a manje od 2.5% stanica od xenotransplanted tumora tretiranih s cyclopamine može generirati sferoida. Dakle, blokiranje SHH put in vivo može smanjiti broj želučanih CSLCs. Pregled

6. SHH put održava želučanog CSLCs karakteristike tumorsphere stanica iz uzoraka primarnog tumora

Kako bi se utvrdilo je li SHH put mogao biti uključen u želučanih eksplozivnim dizanjem utega karakteristikama tumorsphere stanica iz želuca tkivu karcinoma, koristi se primarnih uzoraka raka želuca za analizu funkcionalni aspekti SHH puta u želučanom CSLCs. pregled

Prvo, narasle svježe Disocirane bulk stanice želuca uzoraka raka u mediju bez seruma opisane u dijelu metode, nakon 10 dana, uočene tumorspheres (sl. 7A, B). Onda smo istraživali kemijska otpornost i tumore kapacitet tumorsphere stanica iz želuca tkivu karcinoma. Rezultati su pokazali da tumorsphere stanice želuca tkivu karcinoma pokazuje znatno veću otpornost na lijekove nego bulk stanice pod istim uvjetima (Sl. 7C). Osim toga, svježe disocirane bulk stanice iz želuca uzoraka raka ubrizgava na 2 × 10 ^{7 stanica po mišu bili sposobni za uspostavljanje potkožne tumore, a što je manje 2 × 10 4 od tumorsphere stanica iz želuca uzoraka raka se može formirati tumori (Tablica 1), a ksenografta tumora koji su nastali od injekcije tumorsphere stanica predstavljena iste histopatoloških značajke kao njihovim ljudskog tumora (Sl. 7F). Ovi rezultati su pokazali da tumorsphere stanice iz želučanog tkiva raka posjeduju karakteristike CSLCs. Dalje, mi smo opazili učinak SHH slijeda blokiranja na kemijska otpornost tumorsphere stanica in vitro i tumorskog odgovora na lijekove in vivo. Rezultati su pokazali da cyclopamine ili bi 5E1 rezultirao je znatno poboljšane ukupne stope stanične smrti (Sl. 7D), a odgovor tumora na lijek (Sl. 7E). Pregled}

Rasprava pregled

eksplozivnim dizanjem utega dijele mnoge karakteristike s tkivnim matičnim stanicama, kao što je samo-obnavljanja, proliferacijom, kemijska otpornost, te su u prvom redu odgovorni za održavanje rast tumora [27], [28]. Mnogi istraživači koriste fluorescencijom aktiviranog staničnog sortiranja identificirati i izolirati eksplozivnim dizanjem utega i utvrđeno je da ove stanice mogu tvoriti kuglice u specijaliziranim mediju bez seruma. U ovom istraživanju, uzeli smo suprotan pristup razvojem tumorsphere stanice, a zatim određivanje da li te stanice stečene eksplozivnim dizanjem utega karakteristike. Pregled

Mi smo koristili definiranu medij bez seruma koji se sastoji od EGF, FGF-2, B-27 dodatak i N-2 dodatak za održavanje želučanih stanične linije raka. Ovi uvjeti su se prije za održavanje endogene živčanih matičnih /preteče i tumor matičnih stanica iz ljudskih tumora i tumorskih stanica. Na primjer, Kondo et al. [24] karakterizira tumorske stanice linije C6 štakora in vitro i in vivo, i promatrana male populacije matične stanice nalik dobivenih iz dobro karakterizirani strana populacije. Setoguchi et al. [29] pokazala raka potencijal stanica matičnih kao iu drugim staničnim linijama karcinoma, uključujući i liniju MCF7 raka dojke, B104 neuroblastoma i HeLa adenokarcinom. Pregled

U našem istraživanju koristili smo tri želučanog raka stanične linije (HGC- 27. MKN-45 i MGC-803) za tumorspheres kulture. HGC-27 stanična linija uspostavljena je kultura metastatski limfni čvor iz želuca bolesnika dijagnosticiran rak histološkom kao nediferencirani karcinom. MKN-45 je osnovana od slabo diferenciranog adenokarcinoma želuca od 62-godišnje žene. MGC-803 je epitelni slabo diferencirani ljudskog želuca muko-adenokarcinom stanične linije iz 74-godišnjeg muškarca. Pregled

Dva različita pristupa obično se koristi za identifikaciju eksplozivnim dizanjem utega u objavljenim studijama [30], [31] , Jedan od njih je in vitro postupak nazvao "sferoidu formiranje kolonija", a drugi je u postupku vivo uključuje ugradnju eksplozivnim dizanjem utega kandidata pod kožu imunodeficijentnih miševa. Pregled

Bivši metoda uključuje kultiviranje eksplozivnim dizanjem utega kandidatkinjama u uzgojne posude s posebnim premazom za noncell pričvršćivanje s medijem bez seruma koji sadrži faktora epidermalnog rasta i bazični faktor rasta fibroblasta. Rast sfernih kolonija nakon nekoliko tjedana smatra indikativno samoobnavljanja sposobnosti, te će biti u skladu s CSC fenotipa. Drugi postupak rasta stanica u imunodeficijentnih miševa je potreban da pokažu istinsku torn smjeru te se općenito smatra kao zlatni standard za dokazivanje postojanja eksplozivnim dizanjem utega. Brojne studije su pokazala da ova dva pristupa općenito pružaju slične rezultate u procjeni eksplozivnim dizanjem utega kandidata za mnoge solidnih tumora. Pregled

U ovom trenutku, želučani eksplozivnim dizanjem utega nisu određene površine odluka, tako da smo razvili tumorsphere stanice, a zatim utvrditi da li ove stanice koje se stječu eksplozivnim dizanjem utega značajke, uključujući samo-obnavljanja kapaciteta, kemijska otpornost i tumorskih kapaciteta. pregled

Naši podaci su pokazali da je stanične linije karcinoma želuca (HGC-27, MGC-803, MKN-45) uzgojene u definiranom bez seruma slobodan medij mogao formirati tumorspheres koji su sadržavali stanice ponašaju kao CSLCs. In vitro, tumorsphere stanice pokazuju povećanu mogućnost formiranja kolonije u mekanom agaru u pričvršćivanje neovisno uvjeta i povećanu sposobnost stvaranja pod-tumorspheres. Također smo pokazali da je self-obnova sposobnost da se formira pod-tumorspheres iz HGC-27 tumorsphere stanica imala je porast u odlomcima 2 do 8 (od 44,5% do 70,5%), a zatim ga održava relativno stabilan udio nakon 8 ili više prolazi kada se uzgaja na klonskom gustoće (sl. S3). Ovi podaci predložio da se proliferativna potencijal tumorsphere stanica se održava nakon proširene prolaza. Osim toga, tumorsphere stanice in vitro su otpornije na Oksaliplatin i mitomicin usporedbi s adherentnim stanicama, ovi podaci sugerira da tumorsphere stanice sastoje od obogaćenih broja CSLCs što potencijalno su ih manje osjetljivi na djelovanje obje Oksaliplatin i mitomicin. In vivo, tumorsphere stanice mogu generirati tumora nakon transplantacije po višoj stopi nego vezanim stanicama. Štoviše, tumorsphere stanice generiraju potkožne tumore s većim volumenom i kraće vrijeme u usporedbi s onima koji su generirani od vezanim stanicama, važnije, tumorspheres može biti ponovno izvedena iz xenotransplanted tumora, a oni opet mogao formirati tumor, ovi podaci sugerirao da su tumorspheres obogaćen CSLCs . pregled

U našoj studiji, pričvršćene stanice vjerojatno sadržavala relativno nizak postotak eksplozivnim dizanjem utega, jer se nije koristio metode za izolaciju ili uklanjanje tih stanica. Može se reći da je ova mala populacija eksplozivnim dizanjem utega koji je odgovoran za formiranje tumora. Bez obzira na to, sve više eksplozivnim dizanjem utega su evidentno u tumorsphere stanica, što može objasniti više agresivno ponašanje. Pregled

Nadalje, istraživali smo da li karakteristike CSLCs u tumorspheres održava se abnormalne aktivacije SHH puta. Prvo, pokazali smo da su razine ekspresije mRNA molekula shh puta sinteze vezane (Shh, PTCH i Gli1) bile su značajno veće u odnosu na stanice tumorsphere priljepljenih stanica, a Gli2 je bila visoka u obje izražene stanicama. Mi dalje ispituje razine ekspresije SHH put ciljnih gena (PTCH i Gli1) Western analizom i kvantitativnom real-time PCR, rezultati su bili slični onima u RT-PCR. Drugo, inhibicija SHH slijeda aktivnosti od strane cyclopamine ili 5E1 dovelo do smanjenja sposobnost samoobnavljanja i povećana osjetljivost na lijekove u HGC-27 tumorsphere stanice, ali ta djelovanja nisu izražena u vezanim stanicama. In vivo, kod svih tretiranih miševa, tumore liječeni Oksaliplatin bili su značajno manji od onih koje ne obrađuje s Oksaliplatin, nakon obrade s cyclopamine ili 5E1, odgovor tumora kemoterapijskih sredstava je poboljšana. Ti podaci predlaže da, iako standardne kemoterapijske lijekove koji kasni tumora živaca za vrijeme liječenja, kada su u kombinaciji s cyclopamine, djelotvornost kemoterapije je znatno poboljšana, a također još kontinuirana nakon prekida liječenja. Pregled

Konačno, koristi se primarni karcinom želuca uzorci za analizu funkcionalne aspekte SHH puta u želučanim CSLCs. Rezultati su pokazali da tumorsphere stanice iz želuca kod rak imao kemijska otpornost i tumore kapaciteta, štoviše SHH put blokiranje smanjuje kemijska otpornost tumorsphere stanica i bolji odgovor tumora na lijekove in vivo.

Što se tiče kemijska otpornost, nekoliko obilježja eksplozivnim dizanjem utega može da ih je teško ukloniti. Eksplozivnim dizanjem utega su relativno mirno, a to im omogućuje da pobjegne iz kemoterapijskih režima koji obično ciljaju aktivno biciklizma stanice. Osim toga, kao što je prikazano na njihove normalne kolega eksplozivnim dizanjem utega predložene su da pokazuju visoku razinu ekspresije MDR transporter obitelji gena, vjerojatno dovodi do učinkovitijeg izbacivanja kemoterapijskih lijekova i urođene rezistencije na lijekove, osim toga, signalnih puteva, kao što su Wnt, jež ili usjek, su dereguliran u eksplozivnim dizanjem utega koji dovode do razvoja tumora. Razvoj učinkovitog terapijskog pristupa stoga će zahtijevati identifikaciju prepoznatljivim molekularnih puteva koji djeluju u eksplozivnim dizanjem utega i identifikaciju sredstava koja mogu blokirati CSC proliferacija ili inducira diferencijaciju CSC, čime se povećava osjetljivost na kemoterapijskih lijekova. Dakle, važni su čimbenici koji utječu na kemijska otpornost eksplozivnim dizanjem utega su intrinzični faktori. Mikrookoliš ili niša, mogu utjecati na sposobnost eksplozivnim dizanjem utega za proliferaciju, seliti ili napadne. Niša je sidrenje site za eksplozivnim dizanjem utega i adhezijskih molekula ili microenvironmental topljivih molekula, uključujući faktore i citokina rasta, može značajno doprinijeti refraktacije na terapiju. Iako je inhibicija SHH puta po cyclopamine ili 5E1 bio koristan strategija u našem istraživanju, pokazali smo da je komponenta receptor PTCH i transkripcijski faktor Gli1 također visoko izražen u tumorsphere stanicama. Tako, PTCH ili Gli1 može biti alternativa meta u liječenju raka želuca. Jedna od mogućih strategija je koristiti male ometa RNA (siRNA) ili shRNA specifični za PTCH ili Gli1, ali želudac CSLCs u tumorsphere stanice nisu u potpunosti pročistiti, moramo dodatno pročistiti želudac CSLCs, tako da ovaj rad će biti učinjeno u naš daljnji studija. pregled

na kraju, pokazali smo da SHH put može biti uključen u samoobnavljanja, proliferacijom, otpornost na lijek i tumore od tumorsphere stanica i ukazuju na to da strategije usmjerene na inhibirajući SHH putevi predstavljaju Obrazloženje terapijski pristup za ciljanje želučani eksplozivnim dizanjem utega. pregled

materijali i postupci

Izjava Animal Ethics pregled

Muškarac nude miševima bez timusa (nu /nu), 6 do 8 tjedana, dobiveni su iz Pekinga Vital-rijeci laboratorijske životinje Technology Co Ltd (SCXK Jing 2007-0001), a smješteni su u nepatogenim uvjetima u barijere životinjskog uzgoja. Svi miševi su provedena pod odobrenim smjernicama laboratorijskih životinja Center Akademije vojnih medicinskih znanosti (SYXK jun 2002 - 001). Pregled

Kultura vezanim stanicama, tumorspheres i sub-tumorspheres pregled

Human raka želuca stanične linije (HGC-27, MGC-803 i MKN-45), dobivena od Pekinškog Union Medical College se kultivira u 1640 mediju koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i nasađene u gustoći od 1 x 10 ^{6 živim stanicama po 75-cm 2 tikvice. Kad se spoji stanice, njih pasirano smo na ušću. Tumorspheres izvedene su stavljanjem prijanjajuće stanice u 1640 mediju za kulturu bez seruma koji sadrži 1% N-2 dodatak (Invitrogen), 2% dodatka B-27 (Invitrogen), 1% antibiotik smjesa (Gibco), 20 ng /ml humanog FGF -2 (Chemicon) i 100 ng /ml EGF (Chemicon), a vezane stanice su nanesene na ploču s 24 jažica sa ultra malim pričvršćenja ploče (Corning) na 500 stanica po udubljenju. 2 tjedna kasnije, ploče su analizirani za formiranje tumorspheres i kvantificirane su pomoću inverznog mikroskopa (Olympus) na 40 × i 100 × uvećanjem. Pregled}

Nakon što je primarni tumorspheres dosegla veličinu od oko 200 do 500 stanica po zrno, tumorspheres su disocirane pri gustoći od 1000 stanica po mililitru i 100 ul je suspenzija pojedinačnih stanica nasadi se u svaku jažicu 24-jažične ultra-niske pričvršćenja ploče (Corning) u mediju bez seruma je gore opisano. Svako dobro je ispitan za jednu ćeliju, a samo bunari koji su sadržavali jednu ćeliju su označene. 2 tjedna kasnije, bunari su analizirani za formiranje pod-tumorspheres. Normalne Prihvaćene stanice su korištene kao kontrola za sposobnost da se formira pod-tumorspheres. Testirati vezu između SHH puta i oblikovanju pod-tumorspheres, pomiješa se Disocirane stanice s cyclopamine (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) ili upravljačke tomatidine, 5E1 (10 ug /ml), ili kontrolu PBS i promatrati stvaranje pod-tumorspheres. pregled

rak želuca uzorak tkiva

svježe, sterilne uzorke tkiva ljudskih raka želuca dobiveni su u skladu s etičkim standardima institucionalne odbor o ljudskim eksperimentiranjem s 15 bolesnika (dob raspon 70-85 godina) prolazi kroz želučane resekcija raka, nakon dobivanja informiranog pristanka od pacijenata (Tablica S3). pregled

Tada su primjerci uronjeni u 95% -tnom etanolu 2-3 sekundi kako bi se izbjeglo onečišćenje i opere sa slanom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) i antibioticima nekoliko puta da se ukloni krv. Nakon toga, površina uzoraka raka tkiva je uklonjena, a unutarnji dijelovi su rezani u 1-3 mm ^{3 veličine komada. Zatim su razgrađen u kolagenaze i dispase otopinu na 37 ° C, Nakon 4 sata inkubacije, otopina koja sadrži probavljenu tkiva je centrifugirana kako bi se uklonio kolagenaze otopine. Stanični talog je jednom ispran s 1640 mediju prije suspendirana u serum-free 1640 mediju koji sadrži 1% N-2 dodatak 2% dodatka B-27, 1% antibiotik smjese, 20 ng /ml humanog FGF-2, 100 ng /ml EGF i stavljene u 24-te ultra-niske veznu ploču. Sve kulture se inkubiraju na 37 ° C u inkubatorima isporučene s vlažnom zraku i 5% CO _{2. Pregled}}

Anchorage neovisan test rast pregled

Za promatranje samo-obnavljanja kapaciteta dalje, mekana agar analiza je korištena za određivanje formiranje kolonija tumorsphere stanica i adheriranih stanica pod pričvršćivanje neovisno uvjetima. Svakoj jažici šest jažica obložena je sa 1 ml 10% FBS 1640 medij s 1% agaroza. Nakon 20 minuta inkubacije na 37 ° C, jednak broj (500) od tumorsphere stanica ili priljepljenih stanica dodano je u 1 ml 10% FBS 1640 mediju s 0.5% agaroza. Testirati vezu između SHH puta i formiranja kolonija pod pričvršćivanje neovisno uvjetima pomiješa se Disocirane stanice sa cyclopamine (2.5 uM, 5 uM, 10 uM) ili kontrolnim tomatidine, 5E1 (10 ug /ml), ili kontrolu PBS.

• PLoS ONE: Wnt /β-katenina Signalizacija Poboljšava ciklooksigenaze-2 (COX-2) transkripcijsku aktivnost u želudac stanica raka
• PLoS ONE: računalna je metoda za prognozu za izlučivanje proteina i primjenom na Identifikacija rak želuca markere u mokraći