Background
Galectin-3 ass bekannt Kriibs Metastasen ze regléieren. Allerdéngs huet d'Basisdaten Mechanismus net definéiert goufen. Duerch d'DNA microarray Studien no galectin-3 silencing, hien huet mir hei dat galectin-3 eng Schlësselroll spillt an weider-Regulatioun der Ausstralung vun protease-ageschalt receptor-1 (Par-1) an Matrixentgasung metalloproteinase-1 (MMP-1) Par-1 domat gastric Kriibs Metastasen Spur. VerfÜgung
Methodik /Principal effektiv VerfÜgung
Mir der Ausdrock Niveau vun Galectin-3 iwwerpréift, Par-1, an MMP-1 zu gastric Kriibs Patient Stoffer an och d'Auswierkunge vun dëse Proteinen mat spezifesche siRNAs silencing a vun der Regioun-ausdrécken si spezifesch lenti-Haren gesond benotzt. Mir och zebrafish Embryo Modell fir Analyse vun zu VIVO VerfÜgung gastric Kriibs Zell Invasioun agestallt. Dës Studien bewisen datt: e) galectin-3 silencing den Ausdrock vun Par-1 Verloschter. b) galectin-3 iwwer-Ausdrock Erhéijunge Zell Wanderung an Invasioun an dëser Erhéijung kënnt vun Par-1 silencing réckgängeg gemaach ginn, wat beweist, datt galectin-3 erhéicht Zell Wanderung an Invasioun via Par-1-Regulatioun. c) galectin-3 openee direkt mat AP-1 transcriptional Faktor, an dës komplex Photo'en ze Par-1 Promoteur an fiert Par-1 Transkriptiouns. d) galectin-3 verstäerkt och phospho-paxillin, eng Par-1 matgeholl Zil, duerch MMP-1 Ausdrock waarden. MMP-1 Bleck phospho-paxillin amplification an Zell silencing Invasioun vun galectin-3 iwwer-Ausdrock verursaacht. e) Silencing vun entweder galectin-3, Par-1 oder MMP-1 bedeitend reduzéiert Zell Wanderung an der CSV an zebrafish Embryo Modell. f) Galectin-3, Par-1, an MMP-1 sinn héichgradeg ausgedréckt an Co-en der an malignant Stoffer aus gastric Kriibs Patienten. VerfÜgung Konklusiounen /Grousses VerfÜgung Galectin-3 spillt de Schlëssel Roll vun activating gastric Kriibs Metastasen Zell Uewerfläch receptor duerch Produktioun vun protease an boosts. Galectin-3 huet d'Potential als nëtzlech pharmacological Zil fir Préventioun vun gastric Kriibs Metastasen ze déngen VerfÜgung Fro:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi ech-J, Park néirens, et al. (2011) Galectin-3 maaachen Zell Motility zu Gastric Cancer vun Up-regelen Protease-ageschalt Receptor-1 (Par-1) an MATRIX Metalloproteinase-1 (MMP-1). PLoS NËMMEN 6 (9): e25103. Doi: 10.1371 /journal.pone.0025103 VerfÜgung Redakter: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankräich VerfÜgung Arnaque: Mee 18, 2011; Akzeptéiert: 23 August, 2011; Publizéiert: 22. September 2011 VerfÜgung Copyright: © 2011 Kim et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung Funding:. Dës Etude vun der Basic442 Science Research plangen duerch den war vun National Cancer Center (NCC) vun Republik Korea heimat (NCC-0910150 an NCC-0810060), innovativ Fuerschung Institut fir Zell Therapie, Republik Korea (A062260) an dëser Fuerschung ënnerstëtzt ënnerstëtzt gouf national Research Foundation (NRF) finanzéiert duerch den Edukatiounsministère, Wëssenschaft an Technologie (1031790-1), Republik Korea. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung Cancers datt verbreet (metastasize) vun hiren ursprénglechen Site zu engem aneren Deel vum Kierper, sinn metastatic Cancers genannt. metastatic Cancers hunn aarmséileg hätt an héich veruerteelt [1]. A voll Versteesdemech vun der biologescher Mechanismus (s) Équipe an Metastasen a konsequent Approche zu Präventioun oder Metastasen kontroléieren kann fir verbesseren Iwwerliewe Taux vu Patienten mat metastatic Cancers krankheetshalber fir praktesch Approche huet. Am fréiere Studien, fonnt mir dass galectin-3 erhéicht gastric Kriibs Zell motility vun up-Regulatioun fascin-1, eng actin-bundling cytoskeletal FAQ [2]. Galectin-3 ass e 31 kDa rechnen-Unerkennung FAQ, Équipe an tumorigenesis, Kriibs Zell Wuesstem an Metastasen [3], [4], [5] an hirem héijen Ausdrock vun e puer Mënsch Cancers mat den aarme hätt fonnt gouf zu vergläichen vun metastatic Cancers. VerfÜgung fir d'Roll vun galectin-3 an Kriibs Metastasen klären, mir Uewerschenkel-verwandelt hiren Ausdrock an gastric Kriibs Zellen seng siRNA benotzt an iwwerpréift d'Resultater vun der Gentherapie Ausdrock vun DNA microarray Analyse [6]. Dorënner virdrun Resultater, fonnt mir däitleche Minus an de Niveau vun protease-ageschalt receptor-1 (Par-1), e Member vun der Famill vun transmembrane G-FAQ-Koppel kenne [7], a seng activator, Matrixentgasung metalloprotease-1 ( MMP-1) (Dorënner S1). Eenalecn Par-1 ass auto-phosphorylated an transduced vun extracellular Signal (s) duerch verschidde Weeër, an spillt eng kritesch Roll an entholl Metastasen [7], [8], [9]. Iwwer-Ausdrock vun Par-1 ass an e puer Cancers, dorënner melanomas, Broscht an gastric Cancers gemellt. MMP-1 ass och zu enger grousser Villfalt vu fortgeschratt Cancers up-reegelen, an engem groussen negativen Korrelatioun huet tëscht sengem Ausdrock an Patient Iwwerliewe [10], [11], [12], [13] observéiert ginn. Och e puer Studien fonnt dass MMP-1 eng wichteg Roll bei Metastasen vun Broscht Kriibs spillt [14], Liewer an Colon Cancers [15], an gastric Cancers [16], [17], ënner anerem. Et schéngt, datt eemol secreted, MMP-1 Kriibs Zell Invasioun duerch ofgeschnidden vun extracellular matrices an /oder submucosal Schichten vun aaneren männlechen Awunner [10], [14] ënnerstëtzt. Villen Etuden bewisen, dass inhibition vun MMPs féiert zu der inhibition vun Zell Invasioun [18], [19]. VerfÜgung hese Conclusiounen gefouert eis datt galectin-3, Par-1 an MMP-1 zu hypothesize kann zu Équipe ginn Tempo der Migratioun an Invasioun vun gastric Kriibs. Fir dëst Hypothes Test, gehaal mir Etuden fir hir Roll am gastric Kriibs Zellen. An souwuel kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung Etüden, déi mer zebrafish Embryo Modell fir hir Auswierkungen op Wanderung an Invasioun vu Kriibs Zellen mat liewege organelles bestëmmend. Mir sech och den Ausdrock Niveau vun galectin-3, Par-1 an MMP-1 zu malignant Stoffer aus gastric Kriibs Patienten fir de Medeziner kennenzeléieren tëscht dësen Proteinen am mënschleche uplanzen. VerfÜgung Silencing galectin -3 oder Par-1 verklengert der Migratioun an Invasioun vu mënschlechen Zellen gastric Kriibs VerfÜgung den Ausdrock Niveau vun galectin-3 an Par-1 am meeschten gastric Kriibs Zell Linnen héich waren. Mir entsat galectin-3 an Par-1 zu MKN-28 Zellen déi jeweileg siRNAs astellen. Behandlung mat galectin-3 siRNA ofgeholl Ausdrock Niveaue vu béiden galectin-3 an Par-1, hierkommen Par-1 siRNA Traitement nëmme Par-1 Ausdrock ofgeholl iwwerdeems keen Ënnerscheed zu galectin-3 (Dorënner 1A) observéiert gouf. Transfection vun SNU-638 Zellen, déi ursprénglech Ecran keen Ausdrock galectin-3, mat galectin-3-Zeechesaatz plasmid schéinen fräi Meenungsäusserung souwuel Par-1 an galectin-3 (Dorënner 1B). Silencing entweder galectin-3 oder Par-1 ganzen Zuelen vun wanderen ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) reduzéiert (Dorënner 1c) an hypothetesch Zellen ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) (Dorënner 1D), bal vun Halschent. Dës Donnéeë weisen datt galectin-3 fräi Par-1 Ausdrock a béid galectin-3 an Par-1 modulated gastric Kriibs Zell Wanderung an Invasioun. VerfÜgung Galectin-3 verbessert gastric Kriibs Zell Migratioun /Invasioun vun waarden Par-1 Ausdrock VerfÜgung Mir iwwerpréift der Relatioun tëscht galectin-3-entschlof Erhéijunge Zell Wanderung an Invasioun op d'engersäits an Par-1 Ausdrock op der aner Hand. Mir Krankheet SNU638 Zellen mat engem lentivirus der galectin-3 Ausdrock Kassett mat, an iwwerpréift der Ausstralung vun galectin-3 an Par-1, an gemooss Zell Migratioun. Mir hunn erausfonnt, datt méi wéi-Ausdrock vun galectin-3 vun fräi Par-1 mRNA an FAQ Begrëffer (Dorënner 2A) begleet huet, souwéi Zell Migratioun ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) (Dorënner 2B) an Zell Invasioun ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) Aktivitéiten (Dorënner 2C). Dës erhéigt goufe vun Par-1 silencing reduzéiert. Dës Resultater ugeholl datt galectin-3 der Migratioun an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen duerch up-Regulatioun vun Par-1 gefördert. VerfÜgung Galectin-3 Par-1 Transkriptiouns duerch dÉxistenz AP-1 komplex ënnerstëtzt VerfÜgung Mir versicht dann, fir wéi galectin-3 Par-1 Ausdrock reguléieren. Well et huet confirméiert, dass AP-1 transcriptional Aktivitéit vun galectin-3 reglementéiert ass [20], do hu mer iwwert d'Roll vun dëser Transkriptiouns Faktor an dat wat (Dorënner 2D). Mir standing immunoprecipitation Studien an alles dat galectin-3 direkt mat zwee Fra-1 an c-Jun an der AP-1 komplex Experten, an dass dat Gespréich mat an-Regulatioun vun AP-1 transcriptional Aktivitéit (Dorënner 2E) assoziéiert gouf. Next, mir iwwerpréift der DNA bindend Aktivitéit vun AP-1 mat an ouni galectin-3 vun Chip assays (Dorënner 2F). Mir hu fonnt, datt AP-1 komplex de Promoteur vun Par-1 an der Präsenz vun galectin-3 gebonnen, mä net zu senge Flichte. Mir évaluéieren och de transcriptional Aktivitéit vun AP-1 vun luciferase assay der transfection vun engem Rapporteur plasmid wouvun AP-1 bindend Haaptrei virun engem luciferase-Fuere minimal Promoteur am LacZ oder galectin-3 SNU-638 Zellen iwwer-ausdrécken ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) (Dorënner 2G). D'transcriptional Aktivitéit vun AP-1 bedeitend an galectin-3 fräi Zellen iwwer-ausdrécken, mä net zu LacZ iwwer-ausdrécken Zellen. Dës Resultater ugeholl datt galectin-3 der bindend vun der Par-1 Promoteur vereinfacht duerch mat AP-1 komplex proposéiert, domat waarden Par-1 Ausdrock vun transcriptional Regulatioun. VerfÜgung Galectin-3 erhéicht Ausdrock vun MMP-1 an der Aktivatioun vun der Par-1 sécher VerfÜgung MMP-1 huet confirméiert ginn Par-1 Aktivéierung duerch Rëss vun Par-1 tethered intracellular sécher ze regléieren, a Zell Invasioun ze beaflossen [21]. Als zu Dorënner S1 virgestallt, awer mir dass galectin-3 MMP-1 Ausdrock reegelen. Dofir, bestätegt mir de interrelationships vun galectin-3, MMP-1 an Par-1. Mir analyséieren déi mRNA Ausdrock Niveau vun MMP-9, déi eng matgeholl Zilscheif vun Par-1 ass [8], nom silencing galectin-3, MMP-1 an Par-1 individuell (Dorënner 3A). Iwwerdeems galectin-3 silencing den Ausdrock vun all dräi Molekülle (MMP-1, Par-1 an MMP-9), MMP-1 silencing reduzéiert nëmmen MMP-9 Ausdrock an net déi vun galectin-3 oder Par-1 reduzéiert. Spannen, produzéiert Par-1 silencing d'selwecht Effekter wéi MMP-1 silencing. Mir nogewise och de phosphorylation vun der cytoskeletal FAQ paxillin (pY181), e Pionéier vun der Par-1 Aktivéierung [22], [23]. No silencing galectin-3, MMP-1 an Par-1 individuell, war d'phosphorylaion vun paxillin erofgaangen, déi galectin-3 proposéiert och Par-1 Aktivitéit reegelen. Mir kontrolléieren och d'Reduktioun vun MMP-9 Aktivitéit no galectin-3 vun silencing, MMP-1 an Par-1 individuell (Dorënner 3A). VerfÜgung Galectin-3 iwwer-ausdrécken SNU638 Zellen zougedréckt fräi Meenungsäusserung Niveau vun MMP -1 an Par-1 FAQ souwéi hir mRNAs, zousätzlech zu phosphorylated paxillin (pY181). An dësen Zellen, reduzéiert MMP-1 silencing der phosphorylation vun paxillin ouni den Ausdrock vun galectin-3 oder Par-1 (Dorënner 3B) änneren. Desweideren, MMP-1 silencing reduzéiert Zell Invasioun, déi vun galectin-3 iwwer-Ausdrock ausgeléist ass ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) (Dorënner 3C), déi erausfonnt dass galectin-3 fräi MMP-1 Ausdrock amgaang ze Aktivatioun vun Par-1 sécher. VerfÜgung Während-Ausdrock vun MMP-1 zu Kriibs Zellen Erhéijunge Zell Invasioun duerch d'Aktivatioun vun Par-1 sécher VerfÜgung Mir confirméiert datt weider-Regulatioun vun MMP-1 vun galectin-3 ass wichteg fir d'Aktivatioun vun Par-1 sécher an Invasioun gastric Kriibs Zellen fräi. A lentivirus (pLECE3 Vecteure) wouvun MMP-1 Ausdrock Kassett vun CMV Promoteur gereegelt gouf zu AGS gastric Kriibs Zellen (Dorënner 4A-B) préparéiert an Krankheet. Wéi erwaart, MMP-1 iwwer-Ausdrock fräi der Invasioun Potential vun gastric Kriibs Zellen, an Par-1 silencing réckgängeg vill dëser Erhéijung ( p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) (Dorënner 4B). Dëst war och vun der Tatsaach confirméiert datt iwwer-Ausdrock vun MMP-1 d'phosphorylation vun paxillin fräi, an datt zousätzlech silencing vun Par-1 blockéiert esou phosphorylation (Dorënner 4A). An MMP-1 overexpressing Zellen, reduzéiert galectin-3 silencing den Ausdrock vun Par-1, mee net dass vun MMP-1, an och d'phosphorylation vun paxillin an Zell invasiv Potential (Dorënner 4A-B). Dës Beobachtunge datt iwwer-Ausdrock vun MMP-1 Kriibs Zell invasivity zur Aktivatioun vun Par-1 sécher fräi. Geholl all zesummen, dës Resultater ugeholl datt galectin-3 den Ausdrock vun zwou Par-1 fräi an MMP-1, an dass d'fräi MMP-1 Ausdrock ageschalt Par-1 sécher, wat dann, Kriibs Zell Invasioun vereinfacht. Dës Evenementer sinn schematically zu Dorënner 4C duergestallt. VerfÜgung Silencing vun galecin-3, Par-1 oder MMP-1 Bleck gastric Kriibs Zell Migratioun zu VIVO VerfÜgung zu engem zebrafish Modell VerfÜgung Transgenic zebrafish, TG (kdrl: EGFP) läschten Beitrag vun galectin-3, Par-1 an MMP-1 sinn nik, an parallel, an der malignant Stoffer vun gastric Kriibs Patienten VerfÜgung Mir sech d'mRNA an FAQ Ausdrock Niveau vun galectin-3, Par-1 an MMP-1 zu normal an malignant Stoffer aus 20 gastric Kriibs Patienten, dann agestallt RT-Hinnen alleguer e Bild J Organer benotzt. an hir malignant Stoffer wéi an hir normal garantéieren wéi zu Dorënner 5C an Dorënner S3 gewisen, zougedréckt a 73,7% vun de Kriibs Patiente méi Ausdrock Niveau vun galectin-3 an 70% vun hinnen héich Par-1 an MMP-1 Niveauen gewisen. Desweideren, ënnert galectin-3 positive Patienten, ware 71,4% och Par-1 positiv während 64.3% waren och MMP-1 positiv (Dorënner 5D). Dës Donnéeë uginn, datt et eng Parallel Erhéijung vun den Ausdrock vun galectin-3 souwéi Par-1 an MMP-1, an der malignant gastric Stoffer. Mir hunn och, datt dës Proteinen am malignant Beräicher vun Stoffer Co-en der, an net an Net-malignant Beräicher (Dorënner 5C). Galectin-3 war präsent an souwuel de Zytosol an Keimzell, iwwerdeems Par-1 an MMP-1 waren allgemeng am Zytosol an Membran an der selwechter Géigend (Dorënner 5C) gesinn. Dës Conclusiounen ugeholl datt béides Par-1 an MMP-1 Ausdrock vill soll mat galctin-3 Ausdrock vun gastric Kriibs Patienten. VerfÜgung Dës Etude bewisen, dass galectin-3 gastric Kriibs Zell Migratioun verstäerkte an Invasioun. Mechanistically, dëst am Zesummenhang galectin-3 bis erop-Regulatioun vun Par-1 Zell Uewerfläch receptor, an d'Aktivitéit MMP-1 protease. Dëst ass am Accord mat Rapporte eng Korrelatioun tëscht Ausdrock vun Par-1 an entholl Invasioun an Metastasen zu gastric an e puer aner Cancers [25], [26] Musiktherapie-, [27]. Dës Etude ass den éischten direkte Interaktioun vun galectin-3 an AP-1 komplex Voleten, c-Jun a Fra-1, a Regulatioun vun Par-1 Ausdrock vun AP-1 transcriptional Faktor ze beweisen. Well et huet schon vun aneren gewise ginn, datt iwwer-Ausdrock vu Fra-1 ënnerstëtzt Kriibs Zell Invasioun an Metastasen [28], an-Regulatioun vun Par-1 vun c-Jun a Fra-1 war eng méiglech Mechanismus fir d'linkage erkläre vun galectin-3 entschlof up-Regulatioun vun Par-1 Zell Uewerfläch receptor, an d'Aktivitéit MMP-1 protease. Dës Méiglechkeet ass vun eiser Opklärung vun parallel a Co-en der Ausstralung vun galectin-3 an Par-1 zu malignant Stoffer vun gastric Kriibs Patienten ënnerstëtzt. VerfÜgung Et ass eng Verfilmung observation datt galectin-3 erhéicht MMP-1 Ausdrock . Kloer, déi iwwer-Ausdrock vun MMP-1 kann vun erauszesichen Zell zu Zell an Zell zu Matrixentgasung Interaktioune vun ECM ofgeschnidden gastric Kriibs Zell Invasioun Aktivitéit Erhéijung. Dofir, gefördert eng Erhéijung vun MMP-1 Ausdrock vun galectin-3 kéinten duebel Effekter hunn, nämlech, Par-1 Aktivéierung an ECM ofgeschnidden, a béid si kritesch fir gastric Kriibs Metastasen. Mä, wéi galectin-3 MMP-1 Ausdrock reguléieren ass nach net kloer, well den Ausdrock vun MMP-1 vun enger Serie vun komplex Evenementer dorënner Kräiz-Diskussioun tëscht verschiddene transcriptional Faktoren reglementéiert ass, wéi AP-1, Signal Better gëtt reduzéiert a activator vun Transkriptiouns-3, MAP kinase, an hypoxia-inducible Faktor-1 zu hypoxia [29], [30], [31]. VerfÜgung Schafung vun der zebrafish ( Danio rerio VerfÜgung) Embryo Modell fir der Migratioun an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen ënnersicht ass eng besonnesch Witz vun dëser Etude well gëeegent Déier Modeller ënnersicht Mënsch gastric Kriibs Metastasen bis elo net disponibel waren. D'zebrafish Modell genetesch esou Cancers ze studéieren an /oder entholl xenografts, vill Virdeeler huet, dorënner Machbarkeet vu vir an ëmgedréint genetesch Analyse, Transparenz vun der embryonal [32], an suitability fir GFP Etikette vun kritt [32], [33], [34]. Dës Etude gewisen, datt RFP Fortgeschratten gastric Kriibs Zellen Blutt Offshore iwwerfale iwwerdeems galectin-3, MMP-1 oder Par-1 Zellen gastric Kriibs entsat konnt net. Sou, d'zebrafish Embryo eng villverspriechend Modell fir aner Invasioun an Metastasen vun Kriibs Zellen gin schéngt, obwuel weider Studien kloer dat Opklärung ze confirméieren gi waren. VerfÜgung An Conclusioun, hien huet eisen Studien dass galectin-3 gastric Kriibs denke Zell motility vun up-Regulatioun vun Par-1 an MMP-1. Weider Studien sinn kloer fir ausgewielt Cancers gedoe d'Roll vun galectin-3 an Kriibs Metastasen a seng suitability wéi eng therapeutesch Zil waren. VerfÜgung Stoffer VerfÜgung opzefëllen vun 2 mm Stad Fro uplanzen sech aus gastric adenocarcinoma Stoffer vun 20 Patiente amgaang diagnostic endoscopy an Bild submucosal dissection, am National Kriibs Zentrum vun Korea, krut no hir schrëftlech informéiert Autorisatioune Maîtrise. D'Otemschwieregkeeten Echantillon waren am flëssegem Stéckstoff bei -70 ° C direkt no Fro bis benotzen gefruer. Verschiddener vun der Otemschwieregkeeten Echantillon waren fir immunohistochemical Studien paraffindized, wéi néideg. Dës Studien huet duerch den institutionnelle Kritik Verwaltungsrot vun National Kriibs Zentrum (# NCCNSH 03-024) abruecht. VerfÜgung Zell Kultur an siRNA Transfections VerfÜgung Mëttelméisseg ënnerscheet Mënsch gastric adenocarcinoma Zell Linnen, AGS, MKN- 28 an SNU-638 huet sech aus dem Korea Zell Linn Bank kritt an haten wéi virdrun [35] beschriwwen. siRNAs zu transfections benotzt, goufen all vun Invitrogen (Karlsbad CA). Hire Message sinn galectin-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ", Par-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ", an MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 ". Transfections benotzt duerchgefouert Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen), folgende d'Uweisungen d'Hiersteller. Schulung vun flüchteg galectin-3 overexpression zu SNU-638 Zellen war mat pcDNA3.1 /Wees-galectin-3 mat pcDNA3.1 /Wees-GFP erreecht. Fir normalization Kontroll Behandlung, goufen d'gastric Kriibs Zell Linnen mat 1 μg vun LTX reagents (Invitrogen) traitéiert. VerfÜgung RNS Isolatioun an RT-Hinnen alleguer Analyse VerfÜgung Total RNS gouf vum Mënsch gastric Kriibs Zellen isoléiert an Patient Otemschwieregkeeten Echantillonen, mat TRIzol Reagent (Invitrogen) folgenden Fabrikant d'Uweisungen. Ëmgekéierte transcriptase Hinnen alleguer war mat engem ëmgekéierte Transkriptioun System (Promega Corp. USA) gesuergt, folgende Fabrikant d'Uweisungen. D'primers sech benotzt: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 "(Senn) an 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3" (anti-Sënn) fir Mënscherechter LGAL3 (galectin-3) Gentherapie; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 "(Senn) an 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3" (anti-Sënn) fir Mënscherechter F2R (Par-1) Gentherapie; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 "(Senn) an 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3" (anti-Sënn) fir Mënscherechter MMP-1 Gentherapie; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 "(Senn) an 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3" (anti-Sënn) fir Mënscherechter MMP-9 Gentherapie; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 "(Senn) an 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3" (anti-Sënn) fir Mënscherechter β-actin Gentherapie; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 "(Senn) an 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3" (anti-Sënn) fir Mënscherechter glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Hinnen alleguer gouf zu engem 20 μl Volumen benotzt en Ex taq (Takara) gesuergt. D'amplification Zyklus (denaturation 95 ° C fir 1 min, annealing 60 ° C fir 1 min an Extensioun Schrëtt bei 72 ° C fir 2 min) war 32 mol vun final Extensioun bei 72 ° C fir 10 min duerno widderholl. VerfÜgung Bau vun galectin-3 ausdrécken lenti-Haren Vecteure an Wonn VerfÜgung d'voll-Längt Mënsch galectin-3 pcDNA3.1-Nationaléquipe-GFP-gal3, déi pcDNA3.1-Nationaléquipe-GFP Vecteure ausdrécken bauen an der lenti-Haren Vecteure fir iwwer-auszedrécken LacZ, galectin-3 (1-250) zu pLL3.7 virdru beschriwwen hunn [2]. Mënsch F2R war an pLECE3 gekloonten zu BamH1 an Not1 Restriktioun Aktivitéit Siten, an deems d'pLECE3-F2R (Par-1) bauen. Full-Längt cDNAs vun F2R, MMP-1, a Kontroll mRFP sech fir Hinnen alleguer amplification benotzt, zesumme mat der primers opgezielt an Data S1, an doraus Hinnen alleguer Fragmenter waren an der pLECE3 Vecteure gekloonten benotzt Pac1 an Hpa1 Restriktioun Aktivitéit Siten, déi pLECE3 schafen -MMP-1 bauen. Och, déi mRFP Site vun der pGEM-T-Easy Vecteure war fir d'pLL3.7 Vecteure z'ersetzen der GFP Regioun Virée benotzt Age1 an EcoR1 Restriktioun Aktivitéit Siten, fir pLL3.7-mRFP maachen. Lenti-Haren Vecteure Produktioun virdru beschriwwen ass [2] VerfÜgung Western blot Analyse VerfÜgung Zell lysate extractions sech bereet mat Ripa Prellbock (1% NP-40. 0,1% Natrium dodecyl sulfate; 0,5 % desoxycholate; 150 mm NaCl; 50 mm Tris, pH 7.5) an protease inhibiter Cocktail. 20 μg total FAQ vun all lysate war an 8-12% SDS PAGE gels an elektro-transferéiert ze PVDF Membran, an dann gespaart a 5% z'iesse Mëllech vun 0,05% Tween-20 mat 1 × PBS (PBST) geléist. Polyclonal Primärschoul antibodies, anti-Galectin-3, anti-ThrombinR (Par-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 an Anti-β-actin (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillin an Anti-phospho paxillin (pY181) (Epitomics) waren bei 1:1000 dilution zu minimal Bänn vun 5% BSA (Bovine serum albumin) zu PBST Prellbock fir 1 HR Raumtemperatur oder iwwer-Nuecht zu 4 ° C mat blots incubated. Anti-Maus oder anti-Kanéngchen Geess-HRP-conjugated Secondaire antibodies (GE Gesondheetswiesen UK limitéiert) sech fir 1,5 HR bei Raumtemperatur um 1:5000 dilution vun 5% BSA zu PBST gefiermt incubated. Proteinen vun interesséieren sech duerch verstäerkte chemiluminescence (ECL) (Amersham Verletzung, konnt kee mer Heights, IL, USA) fonnt. VerfÜgung Immunoprecipitation VerfÜgung Zell lysate dovu ware bereet mat IP + Prellbock (20 mm Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mm NaCl, 1 mm héich, 1 mm EGTA, 100 mm NaF, 10 mm Natrium pyrophosphate, 1 mm Natrium orthovanadate, 0,2 mm PMSF, 10 μg /ml protease inhibitor Cocktail) fir 30 min an Äis. No Protokoll Entféierung vum centrifugation (13200 Ziichter bei 4 ° C fir 20 min), waren d'supernatants zu engem preclearing Schrëtt mat /G Agarose Glaspärelen FAQ A bei 4 ° C fir 30 min an rotator ënnerworf. Supernatants no engem kuerze centrifugation krut (2000 Ziichter bei 4 ° C fir 4 min) sech un immunoprecipitation ënnerworf eng anti-galectin3 an normal Maus IgG (negativ Kontroll) benotzt. Immunoprecipitates sech zweemol zu IP- Prellbock (20 mm Hepes, 1% Triton X-100, 150 mm NaCl, 1 mm héich, 1 mm EGTA, 100 mm NaF, 10 mm Natrium pyrophosphate) gewäsch. No 30 μl 2 × SDS-Prouf gefiermt Zousätzlech, duerno fir 5 min bei 95 ° C ze kachen. No supernatants no engem kuerze centrifugation kritt, hir FAQ Ausdrock Niveau duerch d'westlech blot Analyse standing sech waren. VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung Fir galectin-3 an Par-1 immunohistochemistry, deparaffinized Rubriken gastric Kriibs Patienten Otemschwieregkeeten sech fir 15 min an citrate Prellbock (Vecteure Laboratoiren) an engem Schleck erëm lénks, an dann mat 3% H 2O 2 fir 15 min ze blockéieren endogenous peroxidase, gefollegt vun incubation mat 10% normal Geess serum (Vecteure incubated Laboratoiren) an 1 × fir 10 min PBS. Primärschoul antibodies sech eng anti-galectin-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) an Anti-Par-1 (1:200) antibodies (Santa Cruz), an nächste Schrëtt war gemaach benotzt no Instruktioune vun Vectastain®ABC Kit (Vecteure Laboratoiren). D'Produite vun diaminobenzidine visualized waren (botzt) Trikoten (Vecteure Laboratoiren). VerfÜgung gelatin zymography VerfÜgung bedingt Medien aus Kulturen vun MKN-28 gastric Kriibs kritt huet Zell Linnen an Konzentratioun vivaspin 6 (Sartorius benotzt ). D'Konzentratioun supernatants zu 6 × Foz gefiermt waren op 10% SDS gels getrennt mat 1 mg /ml vun gelatin. All war zu 100 ml vun zymography Reaktioun gefiermt an Kierchefënster mat Bio-sécher ™ coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratoiren) incubated. No destaining, spatzen transparent Bands gelatinolytic Aktivitéit besot huet op engem bloen Hannergrond visualized. VerfÜgung Transfilter Wanderung an Invasioun assays VerfÜgung Fir d'transfilter Wanderung an Invasioun assay, mir benotzt MKN-28 an SNU-638 Zellen. D'Zellen sech mat siRNAs transfected fir 1 Dag, isoléiert an dobäi ze ieweschte CHAMBERS vun pore Text Transwell mat collagen Typ l (BD bioscience) Beschichtete Filter- an Migratioun assay, an matrigel (BD bioscience) Beschichtete Filter, fir Invasioun assays. RPMI 1640 mat 10% FBS an 1% Antibiotiken (Gibco) gouf fir 20 Stonnen vun incubation duerno un der ënneschter Chambre notéiert. Wanderen an hypothetesch Zellen sech laachen an der H & E staining. All Experimenter war zu triplicate an Daten virgestallt wéi heeschen Wäerter duerchgefouert. VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation assays VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation (Chip) assays sech mat engem Chip assay Kit gesuergt (Millipore). Echantillon waren der siRNA Behandlung galectin-3 op Platen applizéiert an assays folgenden Fabrikant d'Instruktioune gehaal huet. Anti-Galectin-3, anti-c-Jun, anti-Fra-1 an normal Maus /Kanéngchen IgG benotzt goufen DNA wouvun investéiert ze immunoprecipitate. Virum Hinnen alleguer, goufen primers bereet fir AP-1 mat Par-1 Promoteur bindend Siten -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ") an Par-1 Promoteur Site -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3"). Hinnen alleguer war mat enger Ex taq (Takara) gesuergt. VerfÜgung Luciferase assays VerfÜgung An AP-1 luciferase reporter plasmid vum Dr. gesongen-pil Yoon vun der National Kriibs Zentrum vun Korea a Studien kritt huet vun den Auswierkunge vun galectin-3 op AP-1 transcriptional Aktivitéit zu lacZ an galectin-3 iwwer-ausdrécken Zellen sech am Aklang mat enger viregter Rapport [2] gesuergt. No 48 Stonnen, waren d'Zellen gesammelt an luciferase Aktivitéit war mat engem luciferase assay System (Promega) laut den Hiersteller d'Instruktioune gemooss. All Experimenter war zu triplicate an Daten virgestallt wéi heeschen Wäerter duerchgefouert VerfÜgung Zell Migratioun assay mat der zebrafish Modell VerfÜgung D'transgenic zebrafish Linn TG (kdrl: EGFP). Microarray analyteschen VerfÜgung Microarray war zu AGS gesuergt, gastric Kriibs Zell Linn no virdrun vun galectin-3 ëmschriwwen silencing [6]. Microarray Resultater goufen op Geo (GSE29630) eropgelueden. VerfÜgung Statistics Analyse VerfÜgung Data sech als mengen ± Fils virgestallt aus op d'mannst 5-10 Biller kritt aus dräi onofhängeg Experimenter microscope benotzt (× 100, × 200), wann et net anescht uginn. Statistesch Analyse gouf duerch ee-Manéier ANOVA Test mat Prism Software gesuergt. Donnéeën ass wichteg wann p VerfÜgung &Si besteet;. 0,05 VerfÜgung Aféierung VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Ennerstëtzung Informatiounen VerfÜgung Dorënner S1. VerfÜgung entsat galectin-3 mat siRNA zu gastric Kriibs Zellen zu Ännerungen am Zell motility Zesummenhang Gentherapie Ausdrock duerchgesat. A, ënner anerem DNA microarray Analyse, kucke mer Zell motility Zesummenhang Gentherapie MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (Par-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) an zougedréckt fantastesch änneren Verhältnis . B, Detektioun vun mRNA Ausdrock vun MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (Par-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) Hëllef vun Hinnen alleguer. β-actin war als normalization Kontroll benotzt VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s001 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung Dorënner S2. VerfÜgung D'Zuel vun zebrafish embryonal mat migrated Zellen Verhältnis. Detektioun vun gastric Kriibs Zell AGS (RFP) Zuelen no vun AGS transplantéiert (RFP) zu zebrafish Fësch Embryo matt Behandlung spezifesch siRNA (galectin-3, MMP-1 an Par-1) mat negativen Kontroll scRNA (Dorënner 5A-B). Et huet Zuel vun migrated Zell pro embyos gezielt a war als Prozentsaz dës VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung Dorënner S3. VerfÜgung RT-Hinnen alleguer Analyse vun mRNA Niveau vun galectin-3, MMP-1 an Par-1 zu gastric Kriibs Patienten.
Firwat brauch ech eng Koloskopie?
Patienten op Immuntherapie solle méi Faser konsuméieren,
Proteinboten aus dem mënschleche Mikrobiom werfen Liicht op d'mënschlech Gesondheet
Milchsäure Bakterien a Darmbakterien droen zu de gesondheetleche Virdeeler vum Roggen bäi,
Vaginale Bakterien verbonne mat virzäiteger Gebuert
Schwéier COVID-19 Komplikatioune verbonne mat der Darmbarriär Pann
Mënschlech Koronavirus brauch organesch Material fir effizient tëscht Uewerflächen ze transferéieren
De schwéiere akuten Atmungssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) huet séier iwwer 191 Millioune Leit uechter dWelt infizéiert zënter sengem Entstoe Enn Dezember 2019. De Virus verursaacht COVID-19 (Coron
Pankreatitis
DBauchspaicheldrüs ass laang, flaach Drüs, déi hannert dem Mo am ieweschte Bauch ass. Seng Haaptaufgab ass Enzyme ze produzéieren déi an der Verdauung vun enger Persoun hëllefen an Hormone déi reegelm
Darmmikrobiom kann en Deel am schwéiere COVID-19 spillen
Déi aktuell global COVID-19 Pandemie gëtt verursaacht duerch Beta Coronavirus schwéier akut Atmungssyndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), deen iwwer 22.1 Milliounen infizéiert huet a 780 dausend Doudesfä