PLoS ONE: Galectin-3 Palengvina Mobilusis judrumą skrandžio vėžio iki reguliavimo proteazės aktyvuota receptoriaus-1 (PAR-1) ir Matrix metaloproteinazės-1 (MMP-1)

Anotacija

Fonas

Galectin-3 yra žinoma, kad reguliuoti vėžio metastazių. Tačiau pagrindinis mechanizmas nebuvo apibrėžta. Per DNR microarray tyrimų po galectin-3 nuslopinami, mes čia parodė, kad galectin-3 vaidina svarbų vaidmenį iki-reguliuodamas proteazės aktyvuota receptoriaus-1 išraiškas (PAR-1) ir matricos metaloproteinazės-1 (MMP-1) PAR-1 ir taip skatinti skrandžio vėžio metastazių.

Metodologija /Pagrindinės išvados

išnagrinėjo raiškos lygius Galectin-3, PAR-1 ir MMP-1 skrandžio vėžiu audinių, taip pat Triukšmo slopinimo šiuos baltymus su konkrečiais siRNAs ir per išreikšti juos naudojant specialius Lenti-virusines konstruktus poveikis. Mes taip pat dirba zebrafish embrionų modelį analizės in vivo, pervežimas skrandžio vėžio ląstelių invaziją. Šie tyrimai parodė, kad: a) galectin-3 triukšmo slopinimo sumažėja PAR-1 išraiška. b) galectin-3 per išraiška didina ląstelių migraciją ir invazija ir šis padidėjimas gali būti atstatomi PAR-1 nuslopinami, nurodant, kad galectin-3 padidina ląstelių migraciją ir invazija per PAR-1 iki reglamentavimą. c) galectin-3 tiesiogiai sąveikauja su AP-1 transkripcijos faktorių, taip pat šis kompleksas jungiasi par-1 promotoriaus ir diskai PAR-1 transkripciją. d) galectin-3 taip pat sustiprina fosfo-paxillin, par-1 pasroviui tikslą, didinant MMP-1 išraiška. MMP-1 triukšmo slopinimo blokai PHOSPHO-paxillin stiprinimas ir ląstelių invazija sukėlė galectin-3 per-išraiška. e) Triukšmo slopinimo kurios nors galectin-3, PAR-1 arba MMP-1 ženkliai sumažinti ląstelių migracija į zebrafish embriono modelį laivams. f) Galectin-3, PAR-1 ir MMP-1 yra labai išreiškė ir bendro lokalizuotas piktybinių audinių iš skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.

Išvados /Reikšmė

Galectin-3 vaidina pagrindinį vaidmuo suaktyvinant ląstelės paviršiaus receptorių per gamybos proteazės ir didina skrandžio vėžio metastazių. Galectin-3 turi potencialą tapti naudingu farmakologinį taikinį, siekiant išvengti skrandžio vėžio metastazių

nurodomoji dalis:. Kim S-j, duomenis Shin J-Y Lee K D Bae Y K Choi I-J parkas SH ir kt. (2011) Galectin-3 Palengvina Mobilusis judrumą skrandžio vėžio iki reguliavimo proteazės aktyvuota receptoriaus-1 (PAR-1) ir Matrix metaloproteinazės-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. Doi: 10,1371 /journal.pone.0025103

redaktorius: Jean-Marc Vanacker Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Prancūzija

Įstojo: 18 Gegužės, 2011; Priimtas rugpjūčio 23, 2011 m Paskelbta rugsėjo 22, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Kim et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė nacionalinio vėžio centro (NCC) ir Korėjos Respublikos dotacijos (VKEKK-0910150 ir VKEKK-0810060), novatorišką mokslinių tyrimų instituto ląstelių terapija, Korėjos Respublika (A062260) ir šio tyrimo parėmė Basic442 mokslo tyrimų programa per Nacionalinė mokslinių tyrimų fondas (NRP) finansuoja švietimo, mokslo ir technologijų (1031790-1) ministerijos, Korėjos Respublika. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Vėžiai kad sklaidos (metastazuoti) iš jų pirminės svetainės į kitą kūno srityje, yra vadinami neišplitusios vėžio. metastaziniai vėžio prastos prognozės ir didelį mirtingumą [1]. Visą supratimas biologinio mechanizmo (-ų) dalyvauja metastazių ir racionalus požiūris į užkirsti kelią arba kontroliuoti metastazių gali sukelti praktinių metodų tobulinimui išgyvenamumas pacientų serga metastazavusiu vėžiu. Ankstesniais tyrimais, mes nustatėme, kad galectin-3 padidėja skrandžio vėžio ląstelių judrumas iki reguliavimo fascin-1, aktino-susiejimas Citoskeletas baltymų [2]. Galectin-3 yra 31 kDa angliavandenių-pripažinimo baltymų, dalyvauja tumorigenezei, vėžio ląstelės augimo ir metastazių [3], [4], [5] ir jos aukštos išraiška keliose žmogaus vėžio buvo nustatyta, kad jie koreliuoja su prastos prognozės metastaziniai vėžio.

Jei išaiškinti galectin-3 vėžio metastazių vaidmenį, mes išjudinti žemyn savo išraišką skrandžio vėžio ląsteles naudojant savo siRNA ir išnagrinėjo genų raiškos rezultatus DNR mikrogardeliq analizė [6]. Tarp ankstesnių rezultatų, mes nustatėme reikšmingai sumažėjo su proteazės aktyvuota receptoriaus-1 (PAR-1), su į transmembranines G baltymu sujungtas receptorius [7] šeimos narys, ir jo aktyvatorius, matricos metaloproteinazės-1 (lygio MMP-1) (S1 pav). Perskelta PAR-1 yra automatinis-fosforilinto ir transdukuojamos ekstraceliulinio signalą (-us) per įvairius išmetimo kelius, ir vaidina svarbų vaidmenį naviko metastazių [7], [8], [9]. Per išraiška PAR-1 buvo pranešta keliose vėžio, įskaitant melanomos, krūties ir skrandžio vėžio. MMP-1 taip pat yra iki-reguliuojamos įvairių pažangiosios vėžio, ir patikima neigiama koreliacija buvo pastebėta, tarp savo išraiška ir pacientų išgyvenimo [10], [11], [12], [13]. Taip pat keli tyrimai parodė, kad MMP-1 vaidina lemiamą vaidmenį metastazių krūties vėžio [14], kepenų ir storosios žarnos vėžio [15], ir tarp kitų skrandžio vėžio [16], [17],. Atrodo, kad kai išsiskiria, MMP-1 skatina vėžio ląstelių invaziją per skilimo ekstraląsteliniuose matricas ir /ar gleivine sluoksnių lymphatics [10], [14]. Daugybė tyrimų įrodė, kad slopinimas MMP veda prie ląstelių invaziją [18] slopinimas, [19].

hese išvados paskatino mus iškėlė hipotezę, kad galectin-3, PAR-1 ir MMP-1 gali būti įtraukti į stiprinti migracijos ir invazija skrandžio vėžio. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes atlikome tyrimus, jų vaidmenį skrandžio vėžio ląsteles. Tiek in vitro, parsisiųsti ir in vivo
studijas, mes panaudojome zebrafish embrionų modelį nustatant jų poveikį migracijos ir invazijos į vėžines ląsteles, kurių gyvenančių organoidus. Mes taip pat nustatė raiškos lygius galectin-3, PAR-1 ir MMP-1 piktybinių audinių iš skrandžio vėžiu sergantiems pacientams klinikinių koreliacijas tarp šių baltymų žmogaus egzempliorių.

Rezultatai

slopinimo galectin -3 ar PAR-1 sumažina migracijos ir invaziją į žmogaus skrandžio vėžio ląstelių

ekspresijos lygis galectin-3 ir PAR-1 buvo didelė dauguma skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes nutildė galectin-3 ir PAR-1 MKN-28 ląstelių dirba atitinkamus siRNAs. Gydymas galectin-3 siRNA sumažėjo raiškos lygį tiek galectin-3 ir PAR-1, o PAR-1 siRNR gydymas sumažėjo tik PAR-1 išraišką, o ne skirtumas buvo pastebėtas galectin-3 (1A pav.) Transfekciją SNU-638 ląstelių, kurios iš pradžių rodyti jokios ekspresijos galectin-3, su galectin-3-kodavimo plazmidžių lėmė padidėjusios raiškos tiek PAR-1 ir galectin-3 (1B pav.) Triukšmo slopinimo arba galectin-3 ar PAR-1 sumažintas bendras numeriai migruoja ( P
< 0,001) (1c pav) ir užplūsta ląsteles ( P
< 0,001) (1D paveikslas), beveik per pusę. Šie duomenys rodo, kad galectin-3 padidėjo PAR-1 išraišką ir abi galectin-3 ir PAR-1 moduliuojama skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija.

Galectin-3 pagerina skrandžio vėžio ląstelių migraciją /invaziją didinant PAR-1 išraiška

išnagrinėjo tarp galectin-3-sukeltų padidėja ląstelių migracijos ir invazijos iš vienos pusės ir PAR-1 išraiškos kita vertus santykius. Mes užsikrėtę SNU638 ląsteles lentiviruso turinčio galectin-3 ekspresijos kasetė, ir išnagrinėjo galectin-3 ir PAR-1, ir matavo ląstelių migracijos išraiškas. Mes nustatėme, kad per išraiška galectin-3 lydėjo padidėjo PAR-1 mRNR ir baltymų raiškos (2a pav), taip pat ląstelių migracijos ( P
< 0,001) (2B pav) ir ląstelių invazija ( p
< 0,001) veikla (2c pav.) Šis padidėjimas buvo sumažintas PAR-1 nuslopinami. Šie rezultatai rodo, kad galectin-3 skatinama migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles per viršų-reguliavimo PAR-1.

Galectin-3 skatina PAR-1 transkripcijos per sąveiką su AP 1 kompleksas

tada mėgino išsiaiškinti, kaip galectin-3 reguliuoja PAR-1 išraiška. Kadangi tai buvo pranešta, kad AP 1 transkripcijos veiklą reglamentuoja galectin-3 [20], mes sutelktas į šios transkripcijos veiksnio vaidmenį šiuo klausimu (2D paveikslą). Mes atlikome Imunoprecipitacijos studijas ir nustatė, kad galectin-3, tiesiogiai bendravo su tiek FRA-1 ir C-Bir į AP 1 kompleksas, ir kad ši sąveika buvo susijusi su iki-reguliavimo AP 1 transkripcijos veikla (2E pav.) Be to, mes išnagrinėjo DNR surišimo aktyvumą AP-1 su ir be galectin-3 pagal CHIP tyrimai (2f paveikslą). Mes nustatėme, kad AP-1 kompleksas susaistė par-1 promotoriaus į galectin-3 buvimą, bet ne jos nėra. Mes taip pat įvertino transkripcijos veiklą AP-1 iki liuciferazės tyrimą po transfekciją reporterio plazmidžių, kuriame AP-1 privalomąją seka priešais liuciferazės vairavimo minimaliomis promotoriaus lacZ ar galectin-3 per išreikšti SNU-638 ląstelių ( p
< 0,001) (2G pav.) Transkripcijos veikla AP-1 žymiai padidėjo galectin-3 per išreiškiančias, iš ląstelių, bet ne LacZ per išreiškiančias, iš ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad galectin-3 palengvina jungiasi į PAR-1 promotoriaus, sąveikaudamas su AP 1 komplekso, dėl to didėja PAR-1 ekspresiją transkripcijos reguliavimo.

Galectin-3 padidina MMP-1 išraiška ir PAR-1 aktyvavimo signalizacijos

MMP-1 buvo pranešta reguliuoti PAR-1 aktyvavimo per atskėlimo PAR-1 pririšamas ląstelėje signalizacijos ir įtakoti ląstelių invaziją [21]. Kaip pateikti S1 paveiksle, mes parodėme, kad galectin-3 reguliuojamos MMP-1 išraiška. Todėl, mes patvirtino galectin-3 tarpusavio ryšius, MMP-1 ir par-1. Mes analizuojami mRNR ekspresijos lygį MMP-9, kuri yra pasroviui tikslas par-1 [8], po to, kai triukšmo slopinimo galectin-3, MMP-1 ir par-1 atskirai (3A pav). O galectin-3 triukšmo slopinimo sumažino visų trijų molekulių (MMP-1, PAR-1 ir MMP-9) išraiška, MMP-1 triukšmo slopinimo sumažintas tik MMP-9 išraiška, o ne tiems, iš galectin-3 arba par-1. Įdomu tai, kad PAR-1 slopinimo gaminamas tas pačias pasekmes kaip ir MMP-1 nuslopinami. Mes taip pat nustatėme, kad Citoskeletas baltymų paxillin (pY181), iš PAR-1 aktyvavimo [22] prabos, [23] fosforilinimas. Po triukšmo slopinimo galectin-3, MMP-1 ir PAR-1 individualiai, iš paxillin phosphorylaion sumažėjo, kuri pasiūlė galectin-3 taip pat reglamentuoja PAR-1 aktyvumui. Mes taip pat patikrino MMP-9 veiklos sumažinimą po slopinimo ir galectin-3, MMP-1 ir PAR-1 atskirai (3A pav.)

Galectin-3 per ekspresija SNU638 ląstelės parodė padidėjo išraiška lygiai MMP -1 ir PAR-1 baltymo, taip pat jų mRNR, be to, fosforilinto paxillin (pY181). Šių ląstelių, MMP-1 triukšmo slopinimo sumažino paxillin fosforilinimą, nekeičiant galectin-3 arba par-1 (3B pav) išraiška. Be to, MMP-1 triukšmo slopinimo sumažintas ląstelių invaziją, kuris inicijuojamas naudojant galectin-3 per-išraiškos ( P
< 0,001) (Fig.3C), o tai reiškia, kad galectin-3 dalis, o MMP-1 išraiška todėl aktyvavimo PAR-1 signalams.

per išraiška MMP-1 vėžinių ląstelių padidina ląstelių invaziją per PAR-1 aktyvavimo signalizacijos

patvirtino, kad iki-reguliavimo MMP-1 iki galectin-3 yra svarbios PAR-1 signalizacijos įjungimo ir padidėjusio skrandžio vėžio ląstelių invaziją. Lentiviruso (pLECE3 Vektorius), kuriame yra MMP-1 ekspresijos kasetė reglamentuoja CMV rengėjo parengta ir užsikrėtę AGS skrandžio vėžio ląstelių (pav 4A-B). Kaip ir tikėtasi, MMP-1 per išraiška padidėjo invazijos potencialą skrandžio vėžio ląsteles ir PAR-1 slopinimo žymiai pasikeitė šis padidėjimas ( P
< 0,001) (4B pav.) Tai taip pat buvo patvirtinta dėl to, kad per-išraiškos MMP-1 išaugo, paxillin fosforilinimą, ir, kad papildomas triukšmo slopinimo par-1 užblokuotas tokį fosforilinimą (4a pav). Be MMP-1 ekspresija ląstelės, galectin-3 triukšmo slopinimo sumažino PAR-1 išraišką, bet ne tai, kad MMP-1 ir taip pat paxillin ir ląstelių invazinio potencialo (pav 4A-B) fosforilinimas. Šios pastabos rodo, kad per išraiška MMP-1 padidintas vėžinių ląstelių invasivity aktyvacija PAR-1 signalams. Atliekami visi kartu, šie rezultatai rodo, kad galectin-3 didino ir par-1 ir MMP-1 išraiška, ir kad padidėjo MMP-1 išraiška aktyvuota PAR-1 signalinė, kuris savo ruožtu, padedant vėžinių ląstelių invaziją. Šie renginiai yra schematiškai pavaizduota 4C pav.

Triukšmo slopinimo ir galecin-3, PAR-1 ar MMP-1 blokai skrandžio vėžio ląstelių migracija vivo
į zebrafish modelio

Transgeniniai Danio rerio TG (kdrl: EGFP) ^{s843
[24], išreikšti EGFP konkrečiai jų kraujagyslėse. Atitinkami zebrafish embrionai yra skaidrūs su žaliais fluorescencinės laivams. Mes dirbo šių žuvų atlikti in vivo
tiriant žmogaus skrandžio vėžio ląstelių migraciją (5a pav.) Kai raudona fluorescencinė paženklinti AGS ląstelės buvo švirkščiamas į trynio maišelį zebrafish embrionų 48 HPF (valandos po apvaisinimo), kad transplantuotų AGS ląstelių buvo įsikūrę nuo trynio maišeliu embrionų centru 4 val balsų dauguma po transplantacijos ( HPT). Po 26 RPK, abu normalus ir scRNA Transfekuoti ląstelės migravo į kamieno regione, gyveno kamieno ir /ar uodegos embrionų laivo 50 RPK. Tačiau,; perkelta AGS ląstelių skaičius, kuriame kiekvienas iš galectin-3, PAR-1 arba MMP-1 Tildomi, žymiai sumažėjo (5B pav). Mes taip pat skaičiuojamas iš zebrafish embrionų, kuri parodoma migruojančius ląsteles ir rezultatai rodomi (S2 pav) skaičių. Aštuoniasdešimt keturių iki devyniasdešimt trys procentai zebrafish embrionus, kurie buvo persodinti su kontrolinių ląstelių ar scRNA paveiktų ląstelių rodomas ląsteles migruojančius į savo liemens ir uodegos laivų 50 RPK. Tačiau, tik 7-11% embrionų, kurie buvo transplantuotų su ląstelėmis, kurioje buvo engiamų galectin-3, PAR-1 arba MMP-1, rodomas migruoja ląsteles. Šie rezultatai parodė,, kad pirma, kad Danio rerio embrionų modelis gali būti naudojamas stebėti skrandžio vėžio ląstelių migraciją kaip gyvo gyvūno, ir, antra, kad kiekvieno iš galectin-3 triukšmo slopinimo, PAR-1 ir MMP-1, kurią sukelia labai sumažinus skrandžio vėžio ląstelių migracija vivo
.}

išraiškos galectin-3, PAR-1 ir MMP-1 yra padidėjusi, lygiagrečiai į piktybinių audinių skrandžio vėžiu sergantiems pacientams

nulėmė mRNR ir baltymų ekspresijos lygį galectin-3, PAR-1 ir MMP-1 normalių ir piktybinių audinių iš 20 skrandžio vėžiu sergančių pacientų, tada dirbančių AT-PGR, naudojant vaizdo J analizatorių. Kaip parodyta 5C paveiksle ir S3 paveiksle, 73,7% iš vėžiu sergančių pacientų parodė didesnės ekspresijos lygis galectin-3 ir 70% iš jų parodė aukštesnius PAR-1 ir MMP-1 lygį jų piktybinių audinių nei įprastas savo kolegomis. Be to, tarp galectin-3 teigiamiems pacientams, 71,4% Taip pat buvo PAR-1 teigiamas, o 64,3% Taip pat buvo MMP-1 teigiamas (5D pav.) Šie duomenys rodo, kad ten yra lygiagreti padidėjimas galectin-3, taip pat par-1 ir MMP-1 išraiška, į piktybinių skrandžio audiniuose. Mes taip pat nustatyta, kad šie baltymai bendrai lokalizuotas piktybinių sričių audinių, o ne nepiktybinių srityse (5c pav). Galectin-3 buvo pateikti tiek citozolyje ir branduolio, o PAR-1 ir MMP-1 paprastai buvo vertinamas citozolyje ir membranos toje pačioje zonoje (5C pav). Šie rezultatai parodė, kad abi PAR-1 ir MMP-1 posakiai reikšmingai koreliavo su galctin-3 išraiškos skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.

Diskusijos

Šis tyrimas parodė, kad galectin-3 patobulintas skrandžio vėžio ląstelių migraciją invaziją. Mechaniškai, tai susiję galectin-3 į iki-reguliavimo PAR-1 ląstelės paviršiaus receptorių ir veiklos MMP-1 proteazės. Tai susitarimo su ataskaitos rodo koreliaciją tarp išraiškos PAR-1 ir naviko invazija ir metastazių skrandžio ir kelių kitų vėžio [25], [26], [27]. Šis tyrimas yra pirmasis įrodyti tiesioginę sąveiką galectin-3 ir AP-1 sudėtingų komponentų, c-Jun ir Fra-1 ir reguliavimo PAR-1 išraiškos AP-1 transkripcijos faktorius. Kadangi ji jau buvo parodyta kitiems, kad per išraiška FRA-1 skatina vėžinių ląstelių invaziją ir metastazes [28], iki-reguliavimo PAR-1 C-Bir ir FRA-1 atrodė, kad galimą mechanizmą, paaiškinantį, trauklė iš galectin-3 sukeltas iki-reguliavimo PAR-1 ląstelės paviršiaus receptorių ir veiklos MMP-1 proteazės. Ši galimybė yra palaikoma mūsų išvados lygiagrečių ir bendro lokalizuota pareikšti galectin-3 ir PAR-1 piktybinių audinių skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.

Tai romanas pastebėjimas, kad galectin-3 padidėja MMP-1 išraiška , Akivaizdu, kad per išraiška MMP-1 gali padidinti skrandžio vėžio ląstelių invazija veikla blokuoja ląstelių ląstelių ir ląstelių matricos sąveika pagal ECM degradacija. Todėl, iš MMP-1 išraiškos didėjimas skatino galectin-3 gali turėti dvigubą poveikį, ty, PAR-1 aktyvinimą ir ECM degradaciją, ir abu yra labai svarbūs skrandžio vėžio metastazių. Tačiau, kaip galectin-3 reguliuoja MMP-1 išraiška vis dar neaišku, nes MMP-1 išraiška reguliuoja sudėtingų renginių, įskaitant kryžminį pokalbių tarp kelių transkripcijos faktorių, tokių kaip AP-1, signalo keitiklio ir aktyvatorius transkripcija-3, ŽEMĖLAPIS kinazės ir hipoksija-indukuojamąją faktorius-1 hipoksija [29], [30], [31].

Nustatyti zebrafish ( Danio rerio
) embriono modelis studijuoja migracija ir invazija skrandžio vėžio ląstelių yra ypač pasiekimas šio tyrimo, nes tinkamo gyvūnų modeliai nebuvo galima studijuoti žmogaus skrandžio vėžio metastazių iki šiol. Danio rerio modelis studijuoti genų inžinerijos vėžio ir /ar navikų audiniuose, turi daug privalumų, įskaitant įgyvendinamumo pirmyn ir atgal genetinius tyrimus, skaidrumo embrionų [32], ir tinkamumo laivų GFP ženklinimo [32], [33], [34]. Šis tyrimas parodė, kad RFP paženklinti skrandžio vėžio ląstelės įsiveržė kraujagysles, o galectin-3, MMP-1 ar PAR-1 nutildė skrandžio vėžio ląstelės negalėjo. Taigi, Danio rerio embrionas atrodo perspektyvus modelis studijuoja invazija ir metastazes vėžinių ląstelių, tačiau tolesni tyrimai aiškiai reikia patvirtinti šį faktą.

Taigi, mūsų tyrimai parodė, kad galectin-3 paspartino skrandžio vėžiu ląstelių judrumas iki reguliavimo par-1 ir MMP-1. Tolesni tyrimai aiškiai reikia nustatyti galectin-3 vaidmenį vėžio metastazių ir jos tinkamumą kaip terapinio tikslo pasirinktų vėžio.

Medžiagos ir metodai

audinių

poros 2 mm dydžio biopsijos mėginiai buvo gauti iš skrandžio adenokarcinoma audinių 20 pacientų, kuriems atliekama diagnostikos endoskopija ir endoskopinės gleivine išpjaustymo nacionaliniu vėžio centru Korėjoje, gavęs raštiškus sutikimus informuoti. Audinių mėginiai buvo užšaldyti skystame azote -70 ° C temperatūroje iš karto po to, kai biopsijos iki naudojimo. Kai kurie iš audinių mėginių buvo paraffindized už Imunohistocheminiais tyrimais, kiek reikia. Šie tyrimai buvo patvirtinti pagal institucinius ekspertizės valdyba Nacionalinio vėžio centro (# NCCNSH 03-024).

Mobilusis Kultūra ir siRNA transfekcija

Vidutiniškai diferencijuoti žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijas, AGS, MKN- 28 ir SNU-638 buvo gauti iš Korėjos ląstelių linijos bankas ir prižiūrimi taip, kaip aprašyta anksčiau [35]. siRNAs naudojamas transfekcija, visi buvo pateikta Invitrogen (Carlsbad, CA). Jų sekos yra galectin-3 (LGAL3) siRNR; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNR; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', ir MMP-1 siRNR; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfekcija buvo atliekami naudojant Lipofectamine RNAiMAX reagento (Invitrogen), pagal gamintojo instrukcijas. Indukcija trumpalaikis galectin-3 ekspresija SNU-638 ląstelių buvo pasiektas naudojant pcDNA3.1 /NT galectin-3 su pcDNA3.1 /NT-GFP. Normalizuoti kontroliniu variantu, skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo gydomi 1 mikrogramų iki LTX reagentų (Invitrogen).

RNR išskyrimo ir PGR analizė

Viso RNR buvo išskirta iš žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir pacientų audinių mėginiai, naudojant TRIzol reagentas (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Atvirkštinės transkriptazės PGR buvo atliekama naudojant atvirkštinę transkripciją sistemą (Promega Corp JAV), pagal gamintojo instrukcijas. buvo naudojami pradmenys: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(pojūtis) ir 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (anti-prasmės), skirtų žmonių LGAL3 (galectin-3) geno,; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 "(jausmas) ir 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3" (anti-prasme) už žmogaus F2R (PAR-1) geno; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(pojūtis) ir 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (anti-prasmės), skirtų žmonių MMP-1 geno; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(pojūtis) ir 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (anti-prasmės), skirtų žmonių MMP-9 geno; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 "(jausmas) ir 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3" (anti-prasme) žmonių beta-aktino genų; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(pojūtis) ir 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-prasmės), skirtų žmonių gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH). PGR buvo atliekama 20 iL tūrio panaudodamas ex Taq (TAKARA). Amplifikacijos ciklas (denatūracija 95 ° C temperatūroje 1 min, atkaitinimo 60 ° C temperatūroje 1 min ir pratęsimo pakopą 72 ° C temperatūroje 2 min) buvo pakartotas 32 kartus po to paskutinį kartą pratęsti 10 min 72 ° C temperatūroje.

Statybos galectin-3 išreikšti LENTI-virusinis vektorius ir infekcijos

pilnametražis žmogaus galectin-3 išreikšti statyti pcDNA3.1-NT-GFP-gal3, The pcDNA3.1-NT-GFP vektorius ir Lenti-virusinis vektorius, kad per aiškaus lacZ, galectin-3 (1-250) į pLL3.7 buvo aprašyta anksčiau [2]. Žmogaus F2R buvo klonuotas į pLECE3 į BamH1 ir Not1 restrikcijos fermentų svetainių, kuriant pLECE3-F2R (PAR-1) statyti. Visas ilgio cDNR F2R, MMP-1, ir kontrolės mRFP buvo naudojamas PGR, kartu su išvardytais duomenų S1 pradmenis, ir dėl to PGR fragmentai buvo klonuoti į pLECE3 vektoriaus naudojant Pac1 ir Hpa1 restrikcijos fermento svetaines, kuriant pLECE3 -MMP-1 konstruktas. Be to, mRFP svetainė iš pGEM T-Easy vektorius buvo perkeltas į pLL3.7 vektoriaus pakeičiantis GFP regioną naudojant AGE1 ir EcoR1 restrikcijos fermento svetainių, kad pLL3.7-mRFP. Lenti-virusinis vektorius gamyba buvo aprašyta anksčiau [2]

Vakarų dėmė analizė

traukimo Mobilusis lizate buvo parengtas Ripa buferiniu tirpalu (1% NP-40;. 0,1% natrio laurilsulfatas; 0,5 % desoxycholate; 150 mm NaCl; 50 mM Tris, pH 7,5) ir proteazės inhibiter kokteilis. 20 mikrogramų bendras baltymų kiekvieno lizate buvo išspręstas 8-12% SDS PUSLAPIS geliai, elektro-perduota PVDF membrana, tada blokavo 5% lieso pieno 0,05% Tween-20 su 1 × PBS (PBST). Polikloniniai pirminiai antikūnai, anti-Galectin-3, anti-ThrombinR (PVP-1), anti-c-birželis, anti-FRA-1 ir anti-β-aktino (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillin ir anti-PHOSPHO paxillin (pY181) (Epitomics) buvo inkubuojami su dėmės ne 1:1000 skiedimo minimalių apimčių 5% BSA (galvijų serumo albumino) į PBST buferis 1 val kambario temperatūroje arba per naktį 4 ° C temperatūroje. Anti-pelės arba anti-triušio ožkų-HRP-konjuguoto antriniai antikūnai (GE sveikatos priežiūros UK Limited) buvo inkubuojami 1:5000 praskiedus 5% BSA PBST buferyje 1,5 val kambario temperatūroje. Baltymai objektai buvo aptikti glaudesnio cheminės liuminescencijos (ECL) (Amersham Corp ", Arlington Heights, IL, JAV).

Imunoprecipitacijos

Mobilusis lizate ekstraktai paruošti su IP + buferio (20 mm Hepes 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natrio pirofosfato, 1 mM natrio orthovanadate, 0,2 mM PMSF 10 mikrogramai /ml proteazės inhibitorius kokteilio) ledu 30 min. Po to, kai šiukšlių išvežimo centrifuguojant (13200 rpm ir ties 4 ° C temperatūroje 20 min), supernatantq buvo atliktas preclearing žingsnio su baltymų A /G agarozės karoliukų, esant 4 ° C temperatūroje 30 min rotatoriaus. Supernatantai gauti po trumpo centrifuguojant (2000 aps esant 4 ° C 4 min) buvo atliktas Imunoprecipitacijos naudojant anti-galectin3 ir įprastą pelę IgG (neigiama kontrolė). Immunoprecipitates buvo išplauti du kartus per IP-buferyje (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mm NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mm Naf, 10 mM natrio pirofosfatas). Po to, kai 30 mikrol, 2 × SDS-pavyzdžių buferio Be to, po verdančio 95 ° C temperatūroje 5 min. Po gautas supernatantai po trumpo centrifuguojant, jų baltymų ekspresijos lygis buvo nustatytas per Vakarų dėmė analizė atliekama.

imunohistocheminis

galectin-3 ir PAR-1 imunohistocheminiu, deparaffinized skrandžio vėžiu sergančių pacientų audinių atkarpas liko mikrobangų krosnelėje 15 min citrato buferio (Vector Laboratories), ir tada inkubuojami su 3% H _{2O 2 15 min blokuoti endogeninio peroksidaze, o po to inkubacijos su 10% normalaus ožkos serumas (Vector laboratorijos) 1 × PBS 10 min. Pirminiai antikūnai buvo naudojamas anti-galectin-3 (1:200) Anti-MMP1 (Epitomics) ir anti-PAR-1 (1:200) antikūnai (Santa Cruz), o kitas žingsnis buvo daroma pagal instrukcijas Vectastain®ABC komplektas (Vector Laboratories). Produktai buvo regimos diaminobenzidinu (DAB) Rinkiniai (Vector Laboratories).}

Želatina zymography

Sąlyginiai žiniasklaida buvo gauti iš kultūrų MKN-28 skrandžio vėžio ląstelių linijų ir koncentruota naudojant vivaspin 6 (Sartorius ). Koncentruoto supernatantus 6 × Foz buferio buvo atskirtas nuo 10% SDS geliai, kurių sudėtyje yra 1 mg /ml želatinos. Kiekvienas buvo inkubuojami 100 ml zymography reakcijos buferinio tirpalo ir nudažomi su Bio-saugus ™ coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Po blukinimo, aštrių skaidrios juostos nurodant gelatinolytic veiklą buvo ryškinamos mėlyname fone.

Transfilter migracija ir invazija tyrimai

Dėl transfilter migracijos ir invazijos metodu, mes panaudojome MKN-28 ir SNU-638 ląstelės. Ląstelės buvo pernešta su siRNAs 1 dieną, izoliuota ir pridedamas prie viršutinių rūmų porų įterpia Transwell su kolageno L tipo (BD biologijos) dengta filtrų migracijos tyrimo ir Matrigel (BD biologijos) dengta filtrai, dėl kišimosi tyrimus. RPMI 1640 su 10% FBS ir 1% antibiotikams (Gibco) buvo įtraukta į apatinę kamerą po inkubuojant 20 val. Migruojantys ir užplūsta ląstelės buvo kiekybiškai po H & El dažymo. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais ir pateikti duomenys, kaip vidutines vertes.

chromatino Imunoprecipitacijos tyrimai

Chromatino imunoprecipitacijos (Chip) tyrimai buvo atliekami naudojant lustas Bandymo rinkinį (MILLIPORE). Mėginiai buvo taikomas patiekalų po galectin-3 siRNR apdorojimas ir tyrimai buvo atliekami pagal gamintojo instrukcijas. Anti-Galectin-3, anti-c-birželis, anti-FRA-1 ir įprastą pelę /triušiui IgG buvo naudojami immunoprecipitate DNR, kurių sudėtyje yra kompleksus. Prieš PGR, gruntai buvo parengti AP-1 su PAR-1 rengėjas jungimosi vietų -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3) ir PAR-1 rengėjas svetainė -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3 "). PGR buvo atliekama su Ex Taq (Takara).

liuciferazės tyrimai

AP-1 liuciferazė reporteris plazmidės buvo gauti iš dr Sung-Pil Yoon Nacionalinio vėžio centro Korėjoje ir studijų iš galectin-3 poveikio AP-1 transkripcijos aktyvumo lacZ ir galectin-3 per išreiškiančias, iš ląstelės buvo atliekami pagal ankstesniam pranešimui [2]. Po 48 valandų, ląstelės buvo surinktos ir liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant liuciferazės tyrimo sistema (PROMEGA) pagal gamintojo instrukcijas. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais ir pateikti duomenys, kaip vidutines vertes

Mobilusis migracijos tyrimas naudojant Danio rerio modelio

transgeninių Danio rerio linija, TG (kdrl: EGFP). ^{s843
[24], kurioje EGFP specialiai išreikštas kraujagyslėse, buvo prižiūrimos laikantis pripažintų standartinių veiklos procedūrų [36] pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto prie nacionalinio vėžio centro Korėjoje patvirtintas; leidimo numeris: VKEKK 11-116. Gavome zebras-žuvų embrionus iš Nacionalinio vėžio centro zebrafish vandens-kambaryje. Vėžys ląstelių transplantacija buvo atlikta pagal NICOLI et al [37] su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, dechorionated embrionai buvo anestezuoti tricaine (sigma) ir vėžio ląstelės buvo suleistas (150 200 per embriono) į embrioninių trynio maišelių centrų 48 HPF (valandos po apvaisinimo), naudojant Micromanipulator (Narishige) ir pneumatinės Picopump (WPI ) įrengtas su borosilikatinio stiklo adata. Embrionai buvo laikomi po transplantacijos procedūrų ir buvo tiriami migruojantys vėžio ląsteles fluorescencijos mikroskopija. Dėl vaizdo, embrionai ir lervos buvo gydomi N-phenylthiourea (sigma), nuo 12 HPF išvengti pigmentacijos ir išnagrinėjo su fluorescencinė apversto mikroskopu (Carl Zeiss) pagal epifluorescenciniu optika. Liuminescencinės vaizdai buvo užfiksuoti su CCD kamera (Carl Zeiss). Stabilus fluorescencinės skrandžio ląstelių linijos "AGS (mRFP) buvo sukurtas Lenti-viruso infekcijos pLL3.7-mRFP po FACS rūšiavimo.}

mikrogardeliq duomenų analizė

mikrogardeliq buvo atliktas AGS, skrandžio vėžys ląstelių linija po to, kai triukšmo slopinimo iš galectin-3, kaip aprašyta anksčiau [6]. Mikrogardeliq rezultatai buvo įkelta GEO (GSE29630).

Statistika analizė

Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD bent iš 5-10 vaizdų, gautų iš trijų nepriklausomų eksperimentų, naudojant mikroskopą (× 100, x 200), nebent nurodyta kitaip. Statistinė analizė buvo atlikta vieną pusę ANOVA testas, naudojant Prism programinę įrangą. Duomenys buvo laikomi reikšmingais, jei P
. ≪ 0,05

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Silenced galectin-3 su siRNA skrandžio vėžio ląstelės lėmė pokyčius ląstelių judrumas, susijusių genų ekspresiją. A, Tarp DNR mikrogardelių analizės, mes pasirinkome ląstelių judrumas susijusių genų MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PVP-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) ir parodė kartus kaitos santykis , B, aptikimas mRNR ekspresijos MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PVP-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1), naudojant PGR metodu. β-aktino buvo naudojamas kaip normalizavimo kontrolės
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
S2 pav.
į zebrafish embrionus su migravo ląstelių santykis skaičių. Aptikta skrandžio vėžio ląstelių AGS (RFP) skaičių po persodinami iš AGS (RFP) į zebrafish žuvų embrionui su gydymo konkrečiu siRNA (galectin-3, MMP-1 ir PAR-1) su neigiamu kontroliniu scRNA (pav 5A-B). Tai parodė skaičių migravo ląstelių vienam embyos buvo skaičiuojamas ir rodomas procentais
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF)
S3 pav.
RT-PGR analizė lygis mRNR galectin-3, MMP-1 ir PAR-1 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.

• PLoS ONE: naviko-Prisijungti Kursai limfmazgių-Metastazė sustojimo sistema, perspektyvi nauja sustojimo sistema skrandžio vėžio po D2 rezekcija į China
• PLoS ONE: Honokiol Skatina kalpainas tarpininkaujant Gliukozė reguliuojama Baltymų-94 Įskilimai ir apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir sumažina naviko augimą