PLoS ONE: MicroRNA-410 onderdrukt Migratie en invasie door zich te richten MDM2 in Gastric Cancer

Abstract

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren in tumoren in de Oost-Aziatische landen. Kunnen bepalen welke prognostische merkers en effectieve therapeutische doelwitten van belang bij de behandeling van maagkanker. microRNAs (miRNAs) spelen een belangrijke rol in het ontstaan ​​van tumoren. Echter, de mechanismen die miRNAs regelen maagkanker metastase blijven slecht begrepen. In deze studie hebben we vastgesteld dat de niveaus van miR-410 in maagkanker en cellijnen waren veel lager dan die in de normale controle, respectievelijk, en het lagere niveau van miR-410 was significant geassocieerd met lymfe-metastase. Transfectie van miR-410 bootst aanzienlijk kunnen remmen de celproliferatie, migratie en invasie in de HGC-27 maagkanker cellijnen. Daarentegen knockdown van miR-410 het tegenovergestelde effect op de celproliferatie, migratie en invasie. Bovendien vonden we ook dat MDM2 negatief gereguleerd door miR-410 op post-transcriptioneel niveau, via een specifieke doelwitplaats de 3'UTR van luciferase reporter assay. De expressie van MDM2 was omgekeerd gecorreleerd met miR-410 expressie bij maagkanker weefsels, en overexpressie van MDM2 in miR-410-getransfecteerde maagkanker cellen effectief redde de remming van cel proliferatie en de invasie veroorzaakt door miR-410. Aldus onze bevindingen suggereerden dat miR-410 fungeerde als een nieuwe tumor suppressor doelwit de MDM2-gen en remming maagkanker celproliferatie, migratie en invasie. De bevindingen van dit onderzoek hebben bijgedragen aan de huidige kennis van deze functies van miR-410 bij maagkanker

Visum:. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, J Ma, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 onderdrukt Migratie en invasie door zich te richten MDM2 bij maagkanker. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 6 mei 2014; Aanvaard: 9 juli 2014; Gepubliceerd: 19 augustus 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Anhui Provinciaal Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Verschillende strategieën zijn gebruikt voor de behandeling van maagkanker (GC), die de vierde meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker ter wereld [1], [2]. De meeste GC patiënten gediagnosticeerd in stadium III of IV, en de snelheid van de lymfeklier metastase is hoog [3], [4]. Vandaag de dag, de patiënten met de late stadium GC zijn met overleving van appoximately 20% [5] een algemene 5 jaar. Daarom is het van grote klinische waarde opheldering van de moleculaire mechanismen GC metastase en op nieuwe merkers voor de diagnose, prognose en behandeling van patiënten met GC.

microRNA's (miRNA's) zijn kleine niet-coderende RNAs van ~22 nucleotiden in de lengte die de expressie van hun doelwit mRNA te reguleren door middel van translationele repressie of mRNA splitsing [6]. Ze zijn betrokken bij belangrijke biologische processen, waaronder de ontwikkeling en differentiatie [7], [8]. De ontregeling van miRNAs is gecorreleerd met een belangrijke rol in de ontwikkeling en progressie van kanker spelen door het reguleren van celproliferatie, differentiatie en apoptosis carcinogesis [9], [10]. Afwijkende expressie van miRNAs of mutaties van miRNA genen zijn goed onderzocht in verschillende typen tumoren, zoals lymfoom, long, pancreas, leukemie, borst, colon en lever kanker [11] - [15]. De rol van miRNAs in GC blijven grotendeels onbekend.

Eerdere studies hebben de rol van miR-410 onderzocht bij verschillende kankers. Gattolliat et al [16] .demonstrated dat de expressie van miR-410 geassocieerd is met de ziekte overleving van de niet-versterkte gunstig neuroblastoom. Verder Chen bij el [17] vonden dat de expressie van miR-410 werd gereduceerd menselijke gliomen en gedwongen expressie van miR-410 in glioomcellen sterk remde de celproliferatie, invasie gemedieerd doelwit MET. Bovendien Chien et al [18] bleek dat miR-410 negatief gereguleerd pRb /E2F route door direct targeting CDK1 die een oncogen bij borstkanker was. De rol van miR-410 in GC nog onduidelijk. In deze studie hebben we aangetoond dat verlaagde miR-410 expressie is een karakteristieke moleculaire verandering in GC en het effect van gemoduleerde miR-410 verdiepingen op de fenotypen van GC cellijnen. We toonden ook aan dat miR-410 kan functioneren als een oncogen door direct targeting MDM2.

Verklaring Ethiek Materialen en methoden

Al deze patiënten ingestemd met deelname aan de studie en gaven schriftelijk informed consent. Zowel deze studie en toestemming werden goedgekeurd door de ethische raad van bestuur van de Anhui Provinciaal Ziekenhuis en voldeden aan de Verklaring van Helsinki.

Human monsters

Human GC en de bijbehorende niet-tumor maag-monsters werden verzameld op het moment van de chirurgische resectie van de Anhui Provinciaal Ziekenhuis van 2008 tot 2009. Schriftelijke informed consent werd verkregen vóór inzameling. Een deel werd gefixeerd met 10% formaline voor histopathologische diagnostiek, en de andere werd direct snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -196 ° C in vloeibare stikstof tot RNA werd geëxtraheerd. Het gebruik van menselijke weefsels werd goedgekeurd door de Clinical Research Ethics Committee van Anhui Provinciaal Ziekenhuis.

Cell cultuur

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 en HEK293T cellen werden gekocht van het Shanghai Institute of Biochemie en Celbiologie aan de Chinese Academie van Wetenschappen. Gastric epitheliale-1 cel (GES) werd verkregen uit de Shanghai Ruijin ziekenhuis van Shanghai Jiaotong University School of Medicine. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 en GES werden RPMI1640 onderhouden en HEK293T is in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium media gehandhaafd. Medium werd aangevuld met 10% foetaal runderserum. De cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C in een vochtige kamer met 5% kooldioxide.

Plasmiden en celtransfectie

MiR-410 nabootser /remmer en de controles werden gekocht bij RiboBio (Guangzhou, China). De HGC-27 cellen werden gezaaid in zes-well platen bij 30% confluentie één dag voor transfectie. Transfectie met miR-410 nabootser /inhibitor of controles werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfectie complexen werden bereid volgens de instructies van de fabrikant.

qRT-PCR

Voor qRT-PCR assays, werd totaal RNA geëxtraheerd uit cellen met TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverse transcriptie werd uitgevoerd met de PrimeScript RT reagens kit met gDNA gum (Takara) volgens de instructies van de fabrikant. De expressie van miR-410 werd geverifieerd door de gewijzigde stemloop RT-PCR met specifieke RT en PCR-primers. U6 snRNA werd gebruikt als endogene controle. RT reacties werden uitgevoerd met RNA fractie met Promega RT Kit volgens het protocol van de fabrikant uitgevoerd. De PCR-omstandigheden werden uitgevoerd door denatureren van het DNA bij 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 40 amplificatiecycli: 94 ° C gedurende 40 s, 52 ° C gedurende 40 s, 72 ° C gedurende 40 s voor gegevensverzameling. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd op een ABI 7500 thermocycler (Applied Biosystems) onder toepassing van SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) Kits (TaKaRa, Japan) volgens de instructies van de fabrikant.

Cell Proliferation Assay

Een totaal van 10 ^{4 cellen per putje werden uitgeplaat in 96-well platen voor transfectie en gedurende 24 uur onder normale omstandigheden. Zij werden vervolgens getransfecteerd met miR-410 nabootsen of anti-miR-410 remmer samen met gekoppelde negatieve controles. Celproliferatie werd vastgesteld met behulp van Cell Counting Kit 8 (DOJINDO, Tokyo, Japan) volgens het protocol van de fabrikant.}

cel migratie en invasie assay

Voor de migratie assays, 5 x 10 ^{4 cellen werden toegevoegd in de bovenste kamer van het inzetstuk (BD Bioscience, 8-um poriegrootte). Voor de invasie assays, 1 x 10 5-cellen werden toegevoegd in de bovenste kamer van het inzetstuk van tevoren met Matrigel (BD Bioscience). In beide assays, werden cellen uitgeplaat in medium zonder serum en medium met 10% FBS in de onderste kamer diende als chemoattractant. Na verscheidene uren van incubatie werden de cellen die niet migreren en binnendringen door de poriën voorzichtig afgeveegd met watten. Daarna werden de inzetstukken gekleurd met 20% methanol en 0,2% kristalviolet, afgebeeld, en geteld met IX71 omgekeerde microscoop (Olympus).}

Western blotanalyse

De eiwitten werden gescheiden op SDS-polyacrylamide gelelektroforese en overgebracht naar nitrocellulose membraan (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk en geïncubeerd met het konijnen anti-MDM2 monoklonaal antilichaam (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) en de muis-anti-b-GAPDH monoklonaal antilichaam (1:10000; Sigma). De eiwitten werden gedetecteerd met versterkte chemiluminescentie reagens (Pierce, Rockford, IL, USA).

Luciferase reporter assay

HEK293T-cellen werden uitgeplaat in 96-well platen. Na 24 uur incuberen werd een mengsel van 100-ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negatieve controle, miR-410 mimic gecotransfecteerd met 20 ng.

Renilla in HEK293T cellen met behulp van Lipofectamine 2000 Achtenveertig uur na transfectie vuurvlieg en Renilla luciferase activiteiten werden gemeten met Dual-luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). De transfectie-efficiëntie werd genormaliseerd door cotransfectie met een Renilla reporter vector.

Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelden ± standaardafwijking van op zijn minst drie experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 15.0. Een one-way variantie-analyse (ANOVA) test- en Student's t-test werd gebruikt voor statistische analyse. Een waarde van p <. 0,05 werd beschouwd als een statistische analyse blijkt

Resultaat

De expressie van miR-410 was significant down-gereguleerd in GC cellen en weefsels

Om te beoordelen de rol van miR-410 in GC, onderzochten we de expressie van miR-410 in GC cellijn, weefsels en bij elkaar passende normale weefsels met behulp van kwantitatieve RT-PCR. We vonden dat miR-410 niveaus waren vaak down-gereguleerd in GC cellijnen ten opzichte van GES. Figuur 1B toont dat miR-410 niveaus werden neerwaarts gereguleerd GC weefsels vergeleken met die in gelijke normale weefsels. Het gemiddelde expressieniveau in carcinoomweefsel (combinatie) was significant hoger in vergelijking met hun naburige niet-neoplastische weefsels (figuur 1C). We toonden ook aan dat de expressie van miR-410 in de metastasen GC weefsels was lager dan in niet-metastasen weefsels (fig. 1D).

miR-410 remde GC celproliferatie, migratie en invasie

de niveaus van miR-410 waren significant verhoogd GC cellen die waren getransfecteerd met miR-410 bootst en miR-410 niveaus werden verlaagd die werden behandeld met de miR-410 remmer (Fig. 2A). Up-regulatie van miR-410 remde GC celproliferatie; in contrast, knockdown van miR-410 het tegenovergestelde effect op celproliferatie (Fig. 2B). Bovendien, de transwell test en invasie assay toonde dat de gemigreerde en invasiviteit van cellen getransfecteerd met miR-410 bootst dramatisch afgenomen vergeleken met de controle en onbehandelde cellen. We toonden ook aan dat de gemigreerde en invasiviteit van cellen getransfecteerd met miR-410 remmer dramatisch toegenomen in vergelijking met de controle en onbehandelde cellen. (Fig. 2C en D).

miR-410 rechtstreeks gericht MDM2 in GC

Zoals voorspeld door PicTar, was er complementariteit tussen has-miR-410 en MDM2 3'-UTR (Fig . 3A). Aantonen dat miR-410 direct regelt MDM2, gebruikten we een dual-luciferase reporter systeem. We vonden dat co-expressie van miR-410 onderdrukt significant de firely luciferase activiteit van het wild-type MDM2 3'UTR maar niet mutant 3'UTR (fig. 3B). Overexpressie van miR-410 verminderde de expressie van MDM2 mRNA en eiwit (Fig. 3C en D).

overexpressie van MDM2 inpaired miR-410-geïnduceerde remming van de invasie in GC cellen

We voerden rescue experimenten door transfectie van 3'UTR-negatieve MDM2 samen met miR-410. Zoals verwacht, transfectie met pcDNA3.1-MDM2 verminderd vermindering van MDM2 gevolg van miR-410 mimic behandeling (Fig. 4A). In overeenstemming met de expressie van doeleiwitten, transfectie met pcDNA3.1-MDM2 beperkten de remming van cel amplificatie (Fig. 4B) en de toename van invasieve cellen (Fig. 4C) betrof miR-410 nabootser behandeling.

MDM2 werd omgekeerd uitgedrukt miR-410 in GC

Om de relatie tussen miR-410 en MDM2 expressie in primaire monsters verder te ontrafelen, hebben we in de eerste plaats geconstateerd MDM2 in GC cellijnen. Zoals getoond in Fig. 5A en 5B, het mRNA en eiwit expressie van MDM2 was veel higer in de 4 GC cellijnen dan in het GES. We vonden ook dat de expressie van MDM2 in GC weefsels was significant hoger dan in de overeenkomstige aangrenzende normale weefsels (fig. 5C). De scatter plot en de Pearson correlatie analyse toonde verder aan dat miR-410 expressie negatief was gecorreleerd met het doelwit eiwit niveaus in de GC-monsters (Fig. 5D). Deze gegevens suggereerden dat de verminderde miR-410 expressie werd in verband met de verhoogde MDM2 niveaus in het grootste deel van de GC-patiënten.

Discussie

miRNAs hebben gehandeld als belangrijke regulatoren van genexpressie bij de post -transcriptional niveau en reguleren van een breed scala van fysiologische en ontwikkelingsprocessen [6], [19], [20]. Montage bewijzen suggereren dat veranderingen in de expressie van miRNAs bij aan de pathogenese van de meeste menselijke kankers die kunnen werken als zowel oncogenen of tumor suppressors [21], [22]. Recentelijk accumuleren gegevens blijkt dat miRNAs zijn betrokken bij een aantal belangrijke biologische gebeurtenissen zoals tumorvorming en metastase van kanker [23], [24]. In de huidige studie, onderzochten we de biologische rol van miR-410 in de menselijke GC het ontstaan ​​van tumoren. Onze resultaten toonden aan dat miR-410 was vaak down-gereguleerd in menselijke GC en dat de down-regulatie significant geassocieerd was met klinische fase en lymfeklieren metastase. Gedwongen expressie van miR-410 kon de proliferatie, migratie en invasie van de GC cellen lijn in vitro te verhogen. We verder geïdentificeerd MDM2, een mogelijke tumor suppressor gen, als een directe functioneel doel van miR-410. Voor zover wij weten is dit de eerste studie om de rol van miR-410 in GC staand, en onze resultaten gaven aan dat miR-410 fungeerde als een nieuwe oncogen in GC.

Deregulering van miR-410 is een frequente Indien bij verschillende kankersoorten, suggereert dat miR-410 een belangrijke rol spelen bij tumorigenese en tumorprogressie. Gattolliat en collega's tonen aan dat miR-410-expressie geassocieerd is met de ziekte overleving van de niet-versterkte gunstige neuroblastoma [16]. Verder Chen [17] bleek dat miR-410 expressie werd verminderd in menselijke gliomen en gedwongen miR-410 expressie in glioma cellen sterk remde de celproliferatie, invasie gemedieerd door zich te richten BMO. Echter, de expressie en functie van miR-410 in GC ontwikkeling niet gerapporteerd. In deze studie, identificeerden we de expressie van miR-410 in verschillende GC cellijnen en GES behulp qRT-PCR. De expressie van miR-410 was significant verhoogd in alle vier GC cellijnen in vergelijking met de GES. Bovendien is de verkregen uit klinische GC weefsel resultaten bevestigden ook dat miR-410 werd down-gereguleerd in het GC weefsels in vergelijking met de gepaarde niet-kanker aangrenzende weefsels, met vermelding van haar mogelijke betrokkenheid bij zowel oncogene transformatie en tumor metastase. We vervolgens bevestigd dat remming van miR-410 aanzienlijk bevorderd GC cel proliferatie, migratie en invasie in vitro.

We verder onderzocht de moleculaire mechanisme achter de rol van miR-410 en geïdentificeerd MDM2 als een directe functioneel stroomafwaarts doelwit van miR-410 in de GC cellen. Bioinformatica benaderingen, die werden gebruikt om de doelstellingen van miRNAs te voorspellen, benadrukt een hoge vrije-energie-seed match in het goed geconserveerde miRNA-bindingsplaats en zijn doel mRNA, maar specificiteit bleef een probleem bij het bepalen van de doelstellingen van veel miRNAs. Aldus overexpressie van een miRNA kan neerwaarts reguleren van de expressie van het doeleiwit. Complementaire sequentie van miR-410 wordt in de 3'UTR van MDM2 mRNA. Verder hebben we aangetoond dat miR-410 direct gericht op de 3'UTR van MDM2, als overexpressie werd geassocieerd met een onderdrukking van luciferaseactiviteit. Bovendien is een aanzienlijke neerwaartse regulatie van het niveau van MDM2-eiwit werd waargenomen na miR-410 overexpressie, wat aangeeft posttranscriptionele regulering van MDM2 via gericht zijn 3'UTR. Deze resultaten gaven aan dat miR-410 kan functioneren als een tumor suppressor gedeeltelijk gemedieerd door het onderdrukken van miR-410 expressie in GC ontwikkeling.

MDM2 is een oncogen dat eerst werd ontdekt in een locus geamplificeerd van dubbele minuut chromosomen in een tumorigene muis cellijn (3T3-DM) [25]. De belangrijkste functie van MDM2 is p53 bioactiviteit remmen door het blokkeren van de transcriptionele activiteit van p53 en p53 bevorderen eiwitafbraak [26] - [28]. MDM2 hoge niveaus verlaagde p53 eiwitniveaus en kan p53 functie, die het risico op kanker en /of versnelde tumorvorming en progressie [29] toe te verzwakken. De MDM2 oncogen speelde een belangrijke rol in de progressie van kanker [30]. Overexpressie van MDM2 in tumorcellen induceerde celproliferatie remt apoptose [31]. Verschillende studies hebben aangetoond dat MDM2 overexpressie werd geassocieerd met slechte overleving en een bruikbare voorspeller van een slechte prognose bij mensen met hepatocellulair carcinoom en borstkankers [32], [33]. Bovendien, de recente studie gevonden dat MDM2 werd expressie op hogere niveaus in weefsels GC dan bij niet-kankerachtige maagslijmvlies, en MDM2-expressie geassocieerd met clinicopathologic functies in patiënten die alleen met chirurgie [34], [35]. Bovendien knockdown van MDM2 of overexpressie van JWA heeft het synergistische effect op de onderdrukking van de maag proliferatie van kankercellen en migratie [35]. Het mechanisme hoe MDM2 was overexpressie is nog onbekend. Deze resultaten geven aan dat het vermogen van miR-410 targeten MDM2 zo'n mechanisme post-transcriptionele controle van MDM2 kunnen bepalen.

Samenvattend hebben onze resultaten bleek dat miR-410 significant was downgereguleerd in GC cellen en weefsels. Gedwongen expressie van miR-410 verhoogde proliferatie GC cel, migratie en invasie door middel van direct gericht MDM2. Deze bevindingen suggereren dat deze roman miR-410 /MDM2 as geeft nieuw inzicht in de mechanismen van tumor metastase, en de onderdrukking van miR-410 expressie kan een potentiële therapeutische strategie voor de behandeling van GC in de toekomst.

Ondersteunende informatie
Tabel S1.
Clinicopathologische charateristics van de patiënten met GC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s001
(docx)
tabel S2.
primersequentie
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

• PLoS ONE: Analyse van lymfekliermetastasen correlatie met de prognose bij patiënten met T2 Gastric Cancer
• PLoS ONE: associatie tussen Dairy Intake en maagkanker: een meta-analyse van observationele studies