PLoS One: a mikro-RNS-410 elnyomja migrációs és behatolás által célzott MDM2 gyomorrákban

absztrakt katalógusa

A gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú daganatok, a kelet-ázsiai országban. Azonosítása pontos prognosztikai markerek és hatékony terápiás célpontok fontos a kezelés a gyomorrák. mikroRNS (miRNS-ek) fontos szerepet játszanak a tumorigenezisben. Azonban azok a mechanizmusok, amelyek miRNS szabályozzák gyomorrák metasztázis marad kevéssé ismert. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a szintek a miR-410 a gyomorrák és sejtvonalak sokkal alacsonyabb volt, mint a szokásos kontroll, illetve, és az alsó szinten a miR-410 szignifikánsan összefüggött a nyirokcsomó-metasztázis. Transzfekciója miR-410 utánozza jelentősen gátolja a sejtburjánzást, a migráció és invázió a HGC-27 gyomorrák sejtvonalakon. Ezzel szemben, a kiütése miR-410 volt az ellenkező hatást a sejtproliferáció, a migráció és invázió. Sőt, azt is megállapította, hogy az MDM2 negatívan szabályozza a miR-410, a poszt-transzkripciós szinten keresztül egy adott célterületre a 3'UTR luciferáz riporter vizsgálat. Az expressziós MDM2 fordítottan korrelált a miR-410 expresszió gyomorrák szövetekben, és túlzott mértékű expressziója az MDM2 a miR-410-transzfektált gyomorrák-sejtek hatékonyan mentettek gátlását sejtproliferáció és invázió okozta miR-410. Így eredményeink azt javasolta, hogy a miR-410 járt, mint egy új tumor szupresszor célzott MDM2 gén, és gátolja a gyomor rákos sejtek szaporodása, migrációja és invázió. A tanulmány megállapításai hozzájárult a tudomány jelenlegi ezeket a funkciókat a miR-410 gyomorrákban. Katalógusa

Citation: Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L. et al. (2014) a mikro-RNS-410 elnyomja migrációs és behatolás által célzott MDM2 gyomorrákban. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510 katalógusa

Szerkesztő: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Amerikai Egyesült Államok

Beérkezett: május 6, 2014; Elfogadva: július 9, 2014; Megjelent: augusztus 19, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Shen és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papír és az azt támogató információs fájlokat. Katalógusa

Forrás: Anhui tartományi Természettudományi Alapítvány (NO. 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Különböző stratégiákat kezelésére használják gyomorrák (GC), ami a negyedik legelterjedtebb rák és a második vezető oka a rák halálesetek a világon [1], [2]. A legtöbb GC betegek diagnosztizáltak szakaszban a III vagy a IV, és az arány a nyirokcsomó-metasztázis magas [3], [4]. Manapság a betegek, akiknek a késői stádiumú GC ami összességében 5 év túlélése appoximately 20% [5]. Ezekhez, ez nagy klinikai érték további megvilágítása a molekuláris mechanizmusok részt vevő GC metasztázis és azonosítani újszerű markerek a diagnózis, prognózis, és a kezelés a betegek GC.

mikroRNS (miRNS-ek) kis nemkódoló RNS ~22 ​​nukleotid hosszúsága, hogy expresszióját szabályozzák a cél mRNS-ek révén transzlációs elnyomás vagy mRNS hasítás [6]. Részt vesznek döntő biológiai folyamatokat, beleértve a fejlesztési és differenciálódását [7], [8]. A szabályozási zavarának miRNS korrelál fontos szerepet játszanak a rák kialakulásában és progressziójában szabályozása révén a sejt proliferáció, a differenciálódás apotosis és carcinogesis [9], [10]. Namika miRNS vagy mutációk miRNS gének már jól vizsgálták számos típusú tumorok, beleértve a limfóma, tüdő, hasnyálmirigy, leukémia, emlő-, vastagbél- és a máj rák [11] - [15]. Ugyanakkor a szerepe miRNS GC nagyrészt ismeretlen. Katalógusa

A korábbi vizsgálatok azt betöltött szerepét vizsgáltuk a miR-410 daganatos megbetegedések. Gattolliat munkatársai [16] .demonstrated hogy a kifejezés a miR-410 szignifikáns összefüggést betegségmentes túlélés a nem erősített kedvező neuroblasztóma. Továbbá, Chen at el [17] megállapította, hogy a kifejezés a miR-410-ra csökkent a humán gliomák, és kénytelen kifejezése miR-410 glioma sejtek erősen gátolja a sejtburjánzást, inváziója által közvetített célba MET. Sőt, Chien és munkatársai [18] megállapította, hogy a miR-410 negatívan szabályozott pRb /E2F útvonal által közvetlenül megcélzó CDK1 amely egy onkogén emlőrákban. Azonban a szerepe a miR-410 GC továbbra is tisztázatlan. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy csökkent miR-410 expressziós jellemző molekuláris változást GC és hatását vizsgálták modulált miR-410 szint a fenotípusok GC sejtvonalak. Azt is kimutatták, hogy a miR-410 működhet egy onkogén által közvetlenül megcélzó MDM2. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Minden betegnek beleegyezett, hogy részt a vizsgálatban és írásos beleegyező nyilatkozatban. Mind ez a tanulmány és engedélyezési hagyta jóvá az etikai bizottság a Anhui tartományi kórház, és megfelelt a Helsinki Nyilatkozatban. Katalógusa

Az emberi mintákban

Az emberi GC és a megfelelő nem-daganatos gyomor gyűjtöttünk idején a sebészi eltávolítás az Anhui tartományi kórház 2008 és 2009 írásbeli beleegyezését adta összegyűjtés előtt. Egy részét rögzítettük 10% formaiinban a kórszövettani diagnózis, a másik azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és tároljuk -196 ° C-on folyékony nitrogénben, míg RNS-t extraháltuk. Emberi szövetek hagyta jóvá a Klinikai Kutatási Etikai Bizottsága Anhui tartományi kórház. Katalógusa

Sejtkultúra katalógusa

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 és HEK293T sejteket vásárolt a Shanghai Intézet Biokémiai és sejtbiológia a kínai Tudományos Akadémia. Gyomornyálkahártya-1 sejtek (GES) kapunk a Shanghai Ruijin Kórház Shanghai Jiaotong Orvostudományi Egyetem. Az SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 és GES tartottuk RPMI1640 és HEK293T tartottuk fenn Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközegben média. A táptalajt 10% marha magzati szérumot. A sejteket 37 ° C hőmérsékleten nedvesített kamrában, amely 5% szén-dioxidban.

Plazmidok és sejt transzfekciós

miR-410 utánozzák /inhibitor és az ellenőrzések cégtől vásároltuk RiboBio (Guangzhou, Kína). A HGC-27 sejteket szélesztettünk hat lyukú lemezekre 30% összefolyás egy nappal a transzfekció előtt. Transzfekció a miR-410 utánozzák /inhibitor vagy a kontrollok alkalmazásával végeztük Lipofectamine 2000 reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transzfekciós komplexeket állítottuk elő, a gyártó utasításai szerint.

QRT-PCR

QRT-PCR vizsgálati eljárások, a teljes RNS-t extraháltunk ki a sejtekből Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A reverz transzkripciót végeztünk a PrimeScript RT reagens készlet gDNS radír (Takara), a gyártó utasításai szerint. A kifejezés a miR-410 ellenőrizték a megváltozott stemloop RT-PCR specifikus RT PCR primereket. U6 snRNS használtunk egy endogén kontroll. RT reakciót végeztünk alkalmazásával RNS-frakció Promega RT Kit, a gyártó utasításai szerint. A PCR-körülmények végeztük denaturáló DNS 94 ° C-on 4 percig, majd 40 amplifikációs ciklus: 94 ° C-on 40 s, 52 ° C-on 40 s, 72 ° C-on 40 s az adatgyűjtés. Kvantitatív PCR-t végeztünk egy ABI 7500 thermocycler (Applied Biosystems) alkalmazásával SYBR Premix Ex Taq (tökéletes valós idejű) Kits (TaKaRa, Japán) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.

Cell Proliferation Assay

összesen 10 ^{4 sejt per lyuk vittük 96 lyukú lemezekre a transzfekció előtt és tenyésztettük 24 órán normál körülmények között. Ők aztán transzfektált miR-410 utánozzák vagy anti-miR-410 inhibitor együtt párosított negatív kontrollok. Sejtburjánzás kiértékelését a sejtszámláiás Kit 8 (Dojindo, Tokió, Japán) a gyártó utasításai szerint. Katalógusa}

Cell migráció és inváziós vizsgálati katalógusa

A migrációs vizsgálatokhoz, 5 × 10 ^{4 sejtet adtunk be a felső kamrába a betét (BD Bioscience, 8 jim pórusméretű). Az inváziós vizsgálati, 1 × 10 5 sejtet adtunk a felső kamrába a betét előre bevont Matrigel (BD Bioscience). Mindkét esszében, a sejteket táptalajban szélesztjük szérum nélküli, és tápközegben, amely 10% FBS-t az alsó kamrában szolgált kemoattraktáns. Miután több órás inkubálás után a sejteket, amelyek nem vándorolnak, vagy behatolnak a pórusokon keresztül óvatosan kiirtotta vattával. Ezután a lapkák megfestettük 20% metanol és 0,2% kristályibolya, leképezett, és megszámoltuk egy IX71 inverz mikroszkóp (Olympus).}

Western-blot-analízis

A fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és át a nitrocellulóz membránra (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). A membránt blokkoltuk 5% zsírmentes tej és inkubáljuk a nyúl anti-MDM2 monoklonális antitest (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), és az egér anti-B-GAPDH monoklonális antitesttel (1:10000 , Sigma). A fehérjéket detektáltuk erősített kemilumineszcenciás reagens (Pierce, Rockford, IL, USA).

luciferáz riporter assay

HEK293T-sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken. Miután 24-órás inkubálás, a keverék 100 ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negatív kontroll, miR-410 utánzó kotranszfektáltuk a 20 ng.

Renilla figyelembe HEK293T sejtekbe Lipofectamine 2000 Negyvennyolc órával a transzfekció után, a szentjánosbogár és Renilla luciferáz tevékenységek mértük a Dual-Luciferase riporter rendszert (Promega, Madison, WI, USA). A transzfekciós hatékonyságot normalizáltuk együttes transzfekció egy Renilla riporter vektort.

Statisztikai analízis

Adat mutatták, mint az átlag ± szórás, a legalább három kísérletek. Statisztikai analízist végeztünk SPSS 15.0. Az egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) Teszt és Student-féle t tesztet alkalmaztuk a statisztikai elemzéshez. A p < 0,05 volt, hogy jelezze a statisztikai elemzést. Katalógusa

Eredmény katalógusa

Expression miR-410 szignifikánsan lefelé szabályozni a GC sejtek és szövetek katalógusa

Annak felmérése a szerepe a miR-410 GC, értékeltük a kifejezés a miR-410 GC sejtvonalban, a szövetek és a párosított normál szövetekben kvantitatív RT-PCR-rel. Azt találtuk, hogy a miR-410-szint gyakran lefelé szabályozni a GC sejtvonalak képest GES. Az 1B ábra, hogy a miR-410 szinteket alulszabályozott GC szövetekben hasonlítani a párosított normál szövetekben. Az átlagos expressziós szintje a carcinoma szövetekben (kombináció) szignifikánsan magasabb volt, mint azok a szomszédos nem neoplasztikus szövetekben (1C). Azt is kimutatták, hogy a kifejezés a miR-410 a metasztázisok GC szövetek alacsonyabb volt, mint a nem-áttétek szövetekben (ábra. 1D). Katalógusa

miR-410 gátolja GC sejtburjánzást, migrációs és behatolás katalógusa

a szinteket a miR-410 szignifikánsan megnövekedett GC sejteket transzfektáltunk miR-410 utánozza és a mIR-410 szintek csökkentek, hogy kezeltük a miR-410 inhibitor (2A.). Up-szabályozás a miR-410 gátolja GC sejtburjánzás; Ezzel szemben, a kiütése miR-410 volt az ellenkező hatást a sejtproliferáció (ábra. 2b). Sőt, a transwell vizsgálat és inváziós vizsgálati eljárás kimutatta, hogy az átállított és invazivitását transzfektált sejtek miR-410 utánozza drámaian csökkent a kontrollhoz képest és a kezeletlen sejtekben. Azt is kimutatta, hogy az átállított és invazivitását transzfektált sejtek miR-410 gátló drámaian növekedett a kontrollhoz képest és a kezeletlen sejtekben. (Ábra. 2C és D). Katalógusa

miR-410 közvetlenül a célzott MDM2 GC katalógusa

Ahogy várható PicTar volt közötti komplementaritás van-miR-410 és MDM2 3'-UTR (ábra . 3A). Annak igazolására, hogy a miR-410 közvetlenül szabályozza MDM2, mi foglalkoztatott kettős luciferáz riporter rendszert. Azt találtuk, hogy ko-expressziója miR-410 jelentősen elnyomja a firely luciferáz riporter aktivitása a vad típusú MDM2 3'UTR de nem a mutáns 3'UTR (ábra. 3B). Túltermelése miR-410 csökkentett kifejezése MDM2 mRNS és fehérje (3C. És D). Katalógusa

túltermelése MDM2 inpaired miR-410-indukált gátlásának invázió GC sejtek katalógusa

végeztünk mentési kísérletek transzfekciójával 3'UTR-negatív MDM2 együtt miR-410. Ahogy az várható volt, transzfekciót a pcDNA3.1-MDM2 enyhíteni csökkentése MDM2 eredt miR-410 utánozzák kezelés (4A.). Egyetértésben a kifejezése célfehérjék transzfekciót a pcDNA3.1-MDM2 mérsékelte a gátlása a sejt erősítés (ábra. 4B), és a növekedés az invazív sejtek (ábra. 4C) származik miR-410 utánozzák kezelést. Katalógusa

MDM2 fordítottan kifejezni miR-410 GC katalógusa

a további megvilágítása kapcsolatát miR-410 és MDM2 expressziója primer mintákat, először észlelt MDM2 GC sejtvonalak. Ábrán látható. 5A és 5B, az mRNS és fehérje expressziója MDM2 sokkal Higer a 4 gC sejtvonalak, mint az GES. Azt is megállapították, hogy a kifejezés a MDM2 GC szövetekben jelentős volt magasabb, mint a megfelelő szomszédos normális szövetekben (ábra. 5C). A szórásdiagramon és a Pearson korrelációs elemzés kimutatta továbbá, hogy a miR-410 expresszió negatívan korrelált a megcélzott fehérje szint GC minta (ábra. 5D). Ezek az adatok azt javasolta, hogy a csökkent miR-410 expressziója összefügg a megnövekedett MDM2 szintje a legtöbb GC betegek. Katalógusa

Vita katalógusa

miRNS jártak el fontos szabályozói génexpresszió a postán -transcriptional szint és szabályozza egy sor élettani és fejlődési folyamatok [6], [19], [20]. Szerelés bizonyítékok arra utalnak, hogy a változtatások az expresszióját miRNS hozzájárulnak a patogenezisében a legtöbb emberi rákos, amelyet működhet akár onkogének vagy tumorszupresszorok [21], [22]. Nemrégiben, felhalmozódó adatok azt jelzik, hogy a miRNS-ek részt vesznek számos fontos biológiai események, mint például a tumorigenezis és rák metasztázis [23], [24]. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk biológiai szerepének miR-410 humán GC tumorogenezisben. Eredményeink igazolták, hogy a miR-410 volt gyakran lefelé szabályozni az emberi GC és hogy leszabályozza szignifikánsan összefüggött a klinikai stádium és a nyirokcsomó áttétek. Erőltetett expressziója a miR-410 növelhetné a proliferáció, migráció és invázió a GC sejtvonal in vitro. Mi tovább azonosítjuk MDM2, egy feltételezett tumor szuppresszor gén, mint a közvetlen funkcionális cél miR-410. Tudomásunk szerint ez az első tanulmány, hogy vizsgálja meg a szerepét a miR-410 GC, és az eredmények azt mutatták, hogy a miR-410 járt, mint egy új onkogén GC. Katalógusa

deregulációja miR-410 gyakori esemény különböző rákokban, ami arra utal, hogy a miR-410 is fontos szerepet játszanak a tumorigenezisben és a tumor progresszióját. Gattolliat és kollégái azt mutatják, hogy a miR-410 expressziója szignifikánsan összefüggött a betegségmentes túlélés a nem erősített kedvező neuroblasztóma [16]. Továbbá, Chen [17] megállapította, hogy a miR-410 expressziója csökkent humán gliomák kénytelen miR-410 expresszió glioma sejtek erősen gátolja a sejtburjánzást, inváziója által közvetített célba MET. Azonban a kifejezés és funkciója miR-410 GC fejlődést nem számoltak be. Ebben a vizsgálatban, azonosítottuk a expresszióját miR-410 számos GC sejtvonalak és az GES segítségével QRT-PCR. A kifejezés a miR-410 szignifikánsan nagyobb volt mind a négy GC sejtvonal képest a GES. Továbbá, a kapott eredményeket a klinikai GC szövet is megerősítette, hogy a miR-410-ben alulszabályozott a GC szövetekben, mint a páros nem rákos szomszédos szövetekben, jelezve, hogy lehetséges részvétele egyaránt onkogén transzformáció és a tumor metasztázist. Azt követően megerősítette, hogy gátolja a miR-410 jelentősen elősegítette GC sejtburjánzást, migrációs és behatolás in vitro. Katalógusa

További vizsgálatot molekuláris mechanizmusának szerepét a miR-410 és az azonosított MDM2 közvetlen funkcionális downstream célpontja miR-410 a GC sejtekben. Bioinformatikai módszerek, amelyek alapján megjósolni célok miRNS kiemelte a nagy szabad energiájú vetőmag mérkőzés a jól konzervált miRNS-kötőhely és a komplementer mRNS, de specificitása probléma maradt a meghatározó célok sok miRNS. Így túlzott kifejezése egy miRNS lehetne le-expresszióját szabályozzák a target fehérje. Komplementer szekvenciát miR-410 azonosított 3'UTR MDM2 mRNS. Továbbá kimutattuk, hogy a miR-410 közvetlenül célozza a 3'UTR az MDM2, mint a túlzott expressziója összefüggésbe hozták elnyomása luciferáz aktivitást. Ezen kívül, egy jelentős down-szabályozás szintjének MDM2 fehérje volt megfigyelhető után miR-410 fokozott expressziója, jelezve poszttranszkripciós szabályozása MDM2 keresztül célzási annak 3'UTR. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-410 működhet, mint egy tumorszuppresszor részben által közvetített represszáló miR-410 expresszió GC fejlődését.

MDM2 olyan onkogén, hogy először is felfedezett egy lókusz amplifikált kettős perces kromoszómák egy tumorogén egér sejtvonalat (3T3-DM) [25]. A fő funkciója az MDM2, hogy gátolja a p53 bioaktivitást gátolja a transzkripciós aktivitását p53 és előmozdítása p53 fehérje lebomlását [26] - [28]. Nagy MDM2 csökkentek a p53 fehérje szint, és gyengítik a p53 funkció, ami növelte a rák kockázatát és /vagy gyorsított tumor kialakulását és progresszióját [29]. Az MDM2 onkogén fontos szerepet játszott a rák progressziójának [30]. Túlexpressziója MDM2 tumorsejtekben indukált sejtproliferációt, gátolja a sejtek apoptózisát [31]. Számos tanulmány kimutatta, hogy az MDM2 túlexpressziót járó szegény túlélési és hasznos volt prediktív tényezője rossz prognózist emberben hepatocelluláris karcinóma és emlőrákok [32], [33]. Sőt, a friss tanulmány úgy találta, hogy az MDM2 fejeztük magasabb szinten GC szövetekben, mint a nem-rákos gyomor nyálkahártya, és MDM2 kifejezés társult klinikai és patológiai jellemzői kezelt betegeknél csak műtéttel [34], [35]. Sőt, kiütése MDM2 vagy overexpressziója JWA van a szinergetikus hatást elnyomása gyomorrák sejtek proliferációját és migrációját [35]. Azonban a mechanizmus, ahogy MDM2 volt overexpresszió még mindig ismeretlen. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a képesség, a miR-410 a cél MDM2 nyújthat egy ilyen mechanizmus a poszt-transzkripciós szabályozása MDM2. Katalógusa

Összefoglalva, eredményeink azt mutatták, hogy a miR-410 szignifikánsan lefelé szabályozni a GC sejteket és szöveteket. Erőltetett expressziója a miR-410 fokozott GC sejtburjánzást, migrációs és behatolás révén közvetlenül megcélzó MDM2. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy ez az új miR-410 /MDM2 tengely olyan új betekintést alapját képező mechanizmusok tumor metasztázis, és az elnyomás miR-410 expressziós lehet egy potenciális terápiás stratégia kezelésére GC a jövőben.

alátámasztó információk
táblázat S1.
klinikai és charateristics betegek GC. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0104510.s001 katalógusa (DOCX) hotelben táblázat S2.
Primer szekvencia. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0104510.s002 katalógusa (DOCX) hotelben

• PLoS One: Elemzés a nyirokcsomó-metasztázis korreláció kórjóslatát T2 Gyomor Cancer
• PLoS One: egyrészről a tejtermékek és a gyomorrák: meta-analízise megfigyeléses Studies