Plos ONE: MicroRNA-410 zavira migracije in invazije, ki jih Ciljanje Mdm2 želodčnega raka

Povzetek

Rak želodca je ena izmed najpogostejših malignih obolenj v tumorjih v vzhodnoazijskih državah. Prepoznavanje natančnih prognostičnih označevalcev in učinkovitih terapevtskih ciljev je pomembno pri zdravljenju raka želodca. microRNAs (miRNAs) igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze. Vendar pa so mehanizmi, s katerimi miRNAs urejajo želodca metastaze raka še vedno slabo razumljen. V tej študiji smo ugotovili, da so bile ravni miR-410 v želodcu raka in celičnih linij precej nižja kot v običajnem nadzoru, v tem zaporedju, in nižja stopnja miR-410 je bila značilno povezana z limfna vozlišča metastaz. Transfekcija miR-410 posnema lahko pomembno zaviranje proliferacije celic, migracije in invazijo v HGC-27 želodčnega raka celičnih linij. V nasprotju s tem je imelo rasklapanje miR-410 nasproten učinek na celično proliferacijo, migracijo in invazije. Poleg tega smo tudi ugotovili, da je Mdm2 negativno ureja miR-410 na post-transkripcijski ravni, s posebno ciljnem mestu z 3'UTR ga luciferazni reporterskega testa. Izraz Mdm2 bilo obratno povezana z miR-410 ekspresijo v želodcu tkivih rakom in prekomerno Mdm2 v miR-410-transfektiranih želodčnih rakaste celice učinkovito rešil inhibicijo celične proliferacije in invazije z miR-410 povzročil. Tako, naše ugotovitve kažejo, da miR-410 je deloval kot nov zaviralnih z usmerjanjem gen Mdm2 in zaviranjem želodca rakave celice proliferacijo, migracijo in invazijo. Ugotovitve te študije prispevali k sedanji razumevanje teh funkcij miR-410 v raka želodca

Navedba. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 zavira migracije in invazije, ki jih Ciljanje Mdm2 želodčnega raka. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510

Urednik: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Združene države Amerike

Prejeto: 6. maj 2014; Sprejeto: 9. julij 2014; Objavljeno: 19. avgust 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga:. avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. Anhui province Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Različne strategije se uporabljajo za zdravljenje raka želodca (GC), ki je četrta rak najbolj razširjena in drugi najpogostejši vzrok smrtnih primerov raka na svetu [1], [2]. Večina bolnikov GC je diagnosticirana v fazi III ali IV, ter stopnjo bezgavkah metastaze je visoka [3], [4]. Danes, bolniki z pozni fazi GC so s preživetjem celovito 5 leta od appoximately 20% [5]. Zanje je veliko klinično vrednost za nadaljnjo pojasnitev molekularne mehanizme, ki sodelujejo pri GC metastaz in opredeliti nove oznake za diagnozo, prognozo in zdravljenje bolnikov z GC.

microRNAs (miRNAs) so majhne nekodirano RNA iz ~22 nukleotidov v dolžini, ki uravnavajo izražanje svojih ciljnih mRNA preko translacijskih represijo ali mRNA cepitev [6]. Vključeni so v ključnih bioloških procesov, vključno z razvojem in diferenciacijo [7], [8]. Disregulacijo miRNAs je v korelaciji, da igrajo pomembno vlogo pri razvoju in napredovanju raka z regulacijo celične proliferacije, diferenciacije, apotosis in carcinogesis [9], [10]. Abnormalnih od miRNAs ali mutacijami miRNA genov so dobro raziskana v številnih vrstah tumorjev, vključno z limfomom, pljuč, trebušne slinavke, levkemije, raka dojke, debelega črevesa in jeter, raka [11] - [15]. Vendar pa vloge miRNAs v GC še vedno v veliki meri neznan.

Prejšnje študije so raziskovali vlogo miR-410 na več vrst raka. Gattolliat et al [16] .demonstrated, da je bil izraz miR-410 bistveno povezana z boleznijo preživetje brez tega ne-ojačan ugodno nevroblastoma. Poleg tega Chen na el [17] je pokazala, da je bil izraz miR-410 zmanjša človeških gliomov in prisilno izraz miR-410 v gliomom celic močno zaviral razmnoževanje celic, invazijo posredovano z usmerjanjem MET. Poleg tega Chien et al [18] ugotovljeno, da miR-410 negativno regulirano pRb /E2F pot z neposrednim ciljanjem CDK1 ki je bilo onkogena pri raku dojk. Vendar pa je vloga miR-410 v PK še vedno ostaja nejasna. V tej študiji smo dokazali, da je zmanjšala miR-410 ekspresijo je značilno molekulsko sprememba v GC in raziskali vpliv moduliranih ravni miR-410 na fenotipe GC celičnih linij. Prav tako smo pokazali, da lahko miR-410 deluje kot onkogen neposredno ciljanje Mdm2.

Etika Statement

Materiali in metode

Vsi ti bolniki se dogovorili za sodelovanje v raziskavi in dal pisno privolitev. Oba ta študija in soglasje je odobril etičnega odbora bolnišnici Anhui deželnega in v skladu z Helsinški deklaraciji.

Človekove vzorci

Human GC in njihovih ustreznih non-tumorskih želodca Vzorci so bili zbrani ob kirurški odstranitvi iz bolnišnice Anhui deželnega od leta 2008 do 2009. Pisni zavestne privolitve je bilo pridobljeno pred zbiranjem. En del je bil določen z 10% formalinom za histopatološko diagnozo in drugi je takoj snap-zamrznemo v tekočem dušiku in shranili pri -196 ° C v tekočem dušiku, dokler je bila vzeta RNA. Uporaba človeških tkiv je bil odobren s kliničnimi raziskavami Odbor za etiko za bolnišnice Pokrajinskega Anhui.

celični kulturi

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 in HEK293T celice so bile kupili od Shanghai Institute za biokemijo in biologijo celice na kitajske akademije znanosti. Želodca epitelnih-1 celica (GES) dobimo Ruijin bolnišnici Shanghai Shanghai Jiaotong University School of Medicine. GSS-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 in GES so bile ohranjene v RPMI1640 in HEK293T se je ohranilo v Dulbeccovem spremenjene Eagle je srednje medijih. Medij dopolnimo z 10% fetalnega govejega seruma. Celice inkubiramo pri 37 ° C v navlaženi komori, ki vsebuje 5% ogljikovega dioksida.

Plazmide in celična transfekcija

MIR-410 posnemajo /zaviralec in kontrole smo nabavili pri RiboBio (Guangzhou Kitajska). Celice HGC-27 smo zasejali v šestih vdolbinami pri 30% konfluence en dan pred transfekcijo. Transfekciji z miR-410 posnemajo /zaviralca ali kontrol je bila narejena z Lipofectamine 2000 reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Transfekcijske kompleksi so bili pripravljeni v skladu z navodili proizvajalca.

QRT-PCR

Za QRT-PCR testih, je skupno RNA, pridobljen iz celic z TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Reverzno transkripcijo smo izvedli z PrimeScript RT reagenta Kit z gDNA radirko (Takara) v skladu z navodili proizvajalca. Izraz miR-410 je preveril spremenjeni stemloop RT-PCR s specifičnimi RT in PCR primerji. U6 snRNA bil uporabljen kot endogeni kontrolo. RT reakcije so bile izvedene s pomočjo RNA frakcije z Promega RT Kit po protokolu proizvajalca. Pogojev PCR smo izvedli z denaturacijo DNA pri 94 ° C za 4 min, čemur sledi 40 ciklov pomnoževanja: 94 ° C za 40 sekund, 52 ° C za 40 sekund, 72 ° C za 40 sekund za zbiranje podatkov. Kvantitativni PCR smo izvedli na ABI 7500 termostat (Applied Biosystems) z SYBR premiks Ex Taq (Popolna Real Time) Kompleti (Takara, Japonska), v skladu z navodili proizvajalca.

Cell orožja Vsebnost

skupno 10 ^{4 celic na jamico smo nanesli na plošče s 96 vdolbinami pred transfekcijo in kultiviramo 24 ur v normalnih pogojih. Nato so transfekciji s miR-410 posnemajo ali anti-miR-410 inhibitor skupaj s seznanjenimi negativne kontrole. Cell orožja je bila ocenjena s pomočjo mobilnega Counting Kit 8 (Dojindo, Tokio, Japonska) v skladu s protokolom proizvajalca.}

migracija celic ter invazija test

Za migracijskih testih, 5 x 10 ^{4. celice smo dodali v zgornjo komoro vložka (BD Bioscience, 8-im velikost por). Za invazijo teste, 1 x 10 5 celicah, smo dodali v zgornjo komoro vložka predhodno prevlečenega z Matrigel (BD Bioscience). V obeh testih smo celice prevlečeni v mediju brez seruma, in medij, ki vsebuje 10% FBS v spodnji komori služil kot chemoattractant. Po nekaj urah inkubacije, so bile celice, ki niso prehajajo ali napadejo skozi pore skrbno izničil z vato. Nato so bili vložki obarvamo z 20% metanola in 0,2% kristal vijolično, posnel in prešteti z IX71 obrnjenem mikroskopom (Olympus).}

Western blot analiza

Proteini ločimo na SDS-poliakrilamidnem gelsko elektroforezo in prenesli na nitrocelulozno membrano (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membrana je bila blokirana s 5% nemastnega mleka in inkubirali z zajec anti-Mdm2 monoklonsko protitelo (1:1000; Cell signalizacije tehnologija, Danvers, MA, ZDA) in miško anti-b-GAPDH monoklonsko protitelo (1:10000 , Sigma). Proteine ​​smo zaznali z izboljšanimi kemiluminescence reagenti (Pierce, Rockford, IL, ZDA).

luciferaza reporterski vsebnosti

HEK293T celice zasadimo v 96-vdolbinami. Po 24 h inkubacije, mešanica 100-ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negativna kontrola, miR-410 posnemajo bil kotransfektiramo s 20 ng.

Renilla v HEK293T celice s pomočjo Lipofectamine 2000. oseminštirideset ur po transfekciji firefly in luciferazne aktivnosti Renilla so bile izmerjene z Dual-luciferazni Reporter System (Promega, Madison, WI, ZDA). Učinkovitost transfekciji je normaliziralo do kotransfekcijo z Renilla novinar vektor.

Statistična analiza

Podatki so bili predstavljeni kot sredstvo ± standardni odklon pri najmanj treh poskusih. Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS 15.0. Enosmerna analiza variance (ANOVA), testa in Studentov t test smo uporabili za statistično analizo. Vrednost p <. 0,05 je zdelo, da kažejo na statistično analizo

Rezultat

Izražanje miR-410 je bila precej navzdol urejeno v GC celice in tkiva

Da bi ocenili vloga miR-410 v GC, smo ocenili izražanje miR-410 v GC celične linije, tkiv in njihove izravnanih normalnih tkivih, ki uporabljajo kvantitativne RT-PCR. Ugotovili smo, da so bile vrednosti miR-410 pogosto navzdol urejeno v celičnih linijah GC primerjavi z GES. Slika 1B je razvidno, da so bile stopnje miR-410 navzdol urejeno v GC tkiva v primerjavi s tistimi, ki se ujemajo normalnih tkivih. Povprečna stopnja izraz v karcinomom tkivih (kombinacija) je bila bistveno višja v primerjavi z njihovimi sosednjimi ne-neoplastične tkiva (slika 1C). tudi pokazala smo, da je bil izraz miR-410 v metastaze GC tkivih na nižja kot v ne-metastaz tkivih (sl. 1D).

miR-410 proliferacijo zaviral GC celic, migracije in invazije

so ravni miR-410 v GC celic, ki so transfekciji z miR-410 posnema in so se znižale ravni miR-410, ki so bili zdravljeni z miR-410 inhibitor (sl. 2A) bistveno povečala. Up-regulacijo proliferacije miR-410 zaviral GC celic; V nasprotju s tem je imelo rasklapanje miR-410 nasproten učinek na celično proliferacijo (sl. 2B). Poleg tega transwell test in vdor testa so pokazali, da je premaknjen in invazivnost celic transficiranih z miR-410 posnema je dramatično zmanjšala v primerjavi s kontrolo in nezdravljenimi celicami. Prav tako so pokazali smo, da je bil premaknjen in invazivnost celic transficiranih z miR-410 inhibitor močno povečana v primerjavi s kontrolo in nezdravljenimi celicami. (Sl. 2C in D).

miR-410 neposredno usmerjene Mdm2 v GC

Kot napovedujejo PicTar, je bilo dopolnjevanje med ima-miR-410 in Mdm2 3'-UTR (sl . 3A). Dokazati, da miR-410 neposredno ureja Mdm2, smo uporabili reporterski sistem dual-luciferazno. Ugotovili smo, da je sočasno izraz miR-410 bistveno zatrl firely luciferazno reporterski aktivnost divjega tipa Mdm2 3'UTR vendar ne mutant 3'UTR (sl. 3B). Čezmernim miR-410 zmanjša ekspresijo Mdm2 mRNA in beljakovin (sl. 3C in D).

čezmernim Mdm2 inpaired miR-410-inducirane inhibicije invazije v GC celicah

opravljenih smo reševalni poskusi po transfekciji 3'UTR-negativne Mdm2 skupaj z miR-410. Kot je bilo pričakovati, transfekciji s pcDNA3.1-Mdm2 ublažila zmanjšanje Mdm2 posledica miR-410 posnemajo zdravljenja (sl. 4A). V dogovoru z izražanje tarčnih proteinov, transfekciji s pcDNA3.1-Mdm2 ublažilo inhibicijo celične ojačanja (sl. 4b) in povečanje invazivnih celic (sl. 4C) posledica miR-410 posnemajo zdravljenja.

Mdm2 je obratno izražena z miR-410 v GC

Za dodatno pojasnitev odnosa med miR-410 in Mdm2 izražanja v primarnih vzorcev, smo najprej odkrita Mdm2 v celičnih linijah GC. Kot je prikazano na sliki. 5A in 5B, mRNA in proteina izraz Mdm2 bilo veliko Višje v vrstah mobilnih 4 GC, kot da je v GES. Prav Ugotovili smo, da je bila ekspresija Mdm2 v GC tkivih znatno višja kot v ustreznih sosednjih normalnih tkivih (sl. 5C). Raztros plot in analiza Pearson korelacija tudi pokazala, da je bila miR-410 izraz negativno povezana s stopnjami ciljno beljakovin v vzorcih GC (sl. 5d). Ti podatki kažejo, da se je zmanjšala miR-410 izraz, povezan s povečano koncentracijo Mdm2 v večini bolnikov GC.

Pogovor

miRNAs so delovale kot pomembni regulatorji izražanja genov na delovno mesto -transcriptional raven in ureja širok spekter fizioloških in razvojnih procesov [6], [19] [20]. Montažne dokazi kažejo, da spremembe v izražanju miRNAs prispevajo k patogenezi najbolj človeških raka, ki jih lahko delujejo bodisi kot onkogeni ali tumorskih razbijal [21], [22]. V zadnjem času, kopičenje podatki kažejo, da so miRNAs vključeni v več pomembnih bioloških dogodkov, kot so tumorigeneze in raka, metastaze [23], [24]. V tej študiji smo raziskovali biološko vlogo miR-410 v človeški GC tumorigeneze. Naši rezultati pokazali, da je bila miR-410 pogosto navzdol urejeno v človeški GC in da je bil njen navzdol ureditev bistveno povezana s klinično fazo in bezgavkah metastaze. Prisilna izraz miR-410 lahko poveča proliferacijo, migracijo in invazijo linije GC celic in vitro. nadalje smo identificirali Mdm2, domnevnega tumor dušenje gen, kot neposredno funkcionalno cilj miR-410. Kolikor nam je znano, da je to prva študija raziskati vlogo miR-410 v PK, in naši rezultati so pokazali, da miR-410 je deloval kot nov onkogena v PK.

Deregulacija miR-410 je pogost dogodek v različnih vrst raka, kar kaže, da lahko miR-410 igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze in napredovanje tumorja. Gattolliat in kolegi kažejo, da je miR-410 izraz bistveno povezana z boleznijo preživetje brez ugodnega nevroblastoma non-ojačan [16]. Nadalje, Chen [17] je pokazala, da je bila miR-410 izraz zmanjša človeških gliomov in prisilno miR-410 izraza v gliomom celic močno zaviral razmnoževanje celic, invazijo posredovano z usmerjanjem MET. Vendar pa niso poročali izraz in funkcija miR-410 za razvoj GC. V tej študiji smo ugotovili izražanje miR-410 v nekaterih GC celičnih linijah in GES uporabo QRT-PCR. Izraz miR-410 je na vseh progah štirih GC celic v primerjavi z na GES znatno povečala. Poleg tega so pridobljeni iz kliničnega GC tkiva Rezultati so tudi potrdili, da je bila miR-410 navzdol urejeno v tkivih GC primerjavi s seznanjenimi ne-rakavih sosednjih tkiv, kar kaže na morebitno sodelovanje v obeh onkogenih transformacije in tumorja metastaz. Smo nato potrdili, da zaviranje miR-410 pomembno spodbujati GC celično proliferacijo, migracijo in invazijo in vitro.

dodatno raziskati molekularne mehanizem, ki je podlaga za vlogo miR-410 in opredeljene Mdm2 kot neposredno podrejeno cilju funkcionalno za miR-410 v GC celicah. Bioinformatika pristopi, ki so bile uporabljene za napovedovanje ciljev miRNAs, izpostavil visoko semena tekmo proste energije pri ohranjenem miRNA vezave mestu in ciljne mRNA, vendar specifičnost ostal težave pri določanju ciljev mnogih miRNAs. Tako, prekomerno ekspresijo miRNA lahko navzdol uravnavajo ekspresijo tarčnega proteina. Dopolnilna zaporedje miR-410 je opredeljena v 3'UTR Mdm2 mRNA. Poleg tega smo dokazali, da miR-410 neposredno namenjen 3'UTR Mdm2, saj je njegovo prekomerno povezana z zatiranje luciferazne aktivnosti. Poleg tega, so opazili bistveno navzdol ureditev v ravni proteina Mdm2 po miR-410 prekomerno, kar kaže posttranscriptional ureditev Mdm2 preko ciljanje svojo 3'UTR. Ti rezultati so pokazali, da lahko miR-410 deluje kot zaviralnih deloma posredovane s zatiranje miR-410 ekspresijo v razvoju GC.

Mdm2 je onkogena, ki je bila prvič odkrita v locus pomnožili na dvojnih minuto kromosomih je z tumorogen celična linija mišjih (3T3-DM) [25]. Glavna funkcija Mdm2 je, da inhibira p53 bioaktivnost z blokiranjem transkripcijsko aktivnostjo p53 in pospeševanje degradacije p53 protein [26] - [28]. Visoka raven Mdm2 znižane ravni p53 beljakovin in lahko zmanjšajo funkcijo p53, ki je povečano tveganje za nastanek raka in /ali pospešen nastanek tumorjev in napredovanje [29]. Mdm2 onkogena igral pomembno vlogo pri napredovanju raka [30]. Čezmerno Mdm2 v tumorskih celicah inducirane, zavira apoptozo celic [31]. Številne študije so pokazale, da je bila Mdm2 prekomerno povezana s slabim preživetja in je koristen napovedni dejavnik za slabo prognozo pri ljudeh s karcinomom jetrnih celic in dojk karcinomov [32], [33]. Poleg tega je nedavna študija je pokazala, da je bila Mdm2 izražena na višjih ravneh v GC tkivih kot pri ne-rakasto želodčne sluznice in Mdm2 izraz je bila povezana z clinicopathologic funkcij pri bolnikih, zdravljenih samo z operacijo [34], [35]. Poleg tega je rasklapanje od Mdm2 ali čezmernim JWA ima sinergijski učinek na zaviranje proliferacije želodca rakave celice in priseljevanja [35]. Vendar pa mehanizem, kako je bilo Mdm2 čezmernim še ni znan. Ti rezultati so pokazali, da se lahko sposobnost miR-410 ciljati Mdm2 zagotoviti en tak mehanizem po prepisovalno kontrolo Mdm2.

Če povzamemo, so naši rezultati pokazali, da je miR-410 občutno navzdol urejena v GC celice in tkiva. Prisilna izražanje miR-410 povečano proliferacijo GC celic, migracije in invazije skozi neposredno ciljanje Mdm2. Te ugotovitve kažejo, da je ta novi miR-410 /Mdm2 os omogoča nov vpogled v mehanizme, ki podpirajo tumorja metastaz, in zatiranje miR-410 izražanja je lahko potencialna terapevtska strategija za zdravljenje GC v prihodnosti.

Podpora Informacije
Tabela S1.
Clinicopathologic charateristics bolnikov z GC
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s001
(DOCX)
Tabela S2.
Primer zaporedja
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

• Plos ONE: analiza limfnih vozlov metastaz Korelacija s prognozo pri bolnikih z T2 želodca Cancer
• Plos ONE: Zveza med Dairy s hrano in želodca raku: Meta-analiza opazovalne študije