PLoS ONE: mikrornk-410 potiskuje migracije i Najezda ciljanje MDM2 u želučanom Cancer

Sažetak pregled

Rak želuca je jedan od najčešćih malignih bolesti u tumorima na istoku azijskim zemljama. Identificiranje precizne prognostičke markera i učinkovite terapeutske ciljeve je važno u liječenju raka želuca. mikroRNA (miRNAs) igraju važnu ulogu u nastanku tumora. Međutim, mehanizmi kojima miRNAs reguliraju želučanu metastaza raka i dalje slabo razumije. U ovom istraživanju, otkrili smo da su razine Mir-410 u rak želuca i stanične linije bile su znatno niže nego u normalnoj kontroli, odnosno, a niža razina Mir-410 je značajno povezana s limfnih čvorova metastaze. Transfekcija miR-410 oponaša može značajno inhibirati proliferaciju stanica, migraciju i invaziju u HGC-27 želučane staničnim linijama raka. Za razliku od toga, obaranje Mir-410 imao suprotan učinak na staničnu proliferaciju, migraciju i invaziju. Osim toga, mi također utvrdio da MDM2 negativno regulirano Mir-410 na post-razini transkripcije, preko određene ciljne stranice s 3'UTR strane reporterskog testu. Izraz MDM2 obrnuto povezana sa miR-410 ekspresije u želučanom tkivu raka, te prekomjerne ekspresije MDM2 u miR-410-transficiranim stanicama raka želuca učinkovito spasio inhibiciju proliferacije stanice i invaziju uzrokovanih Mir-410. Dakle, naši rezultati predložio da Mir-410 djelovao kao novi tumor supresor ciljajući gen MDM2 i inhibicija želučane stanice raka proliferaciju, migraciju i invaziju. Rezultati ove studije su pridonijeli trenutnom razumijevanju tih funkcija Mir-410 kod raka želuca pregled

Izvor:. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) mikrornk-410 potiskuje migracije i Najezda ciljanje MDM2 u rak želuca. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510 pregled

Urednik: Jin P Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Sjedinjene Američke Države

Primljeno: 6. svibnja 2014; Prihvaćeno: 9. srpnja 2014; Objavljeno: 19. kolovoz 2014 pregled

Copyright: © 2014 Shen et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Data Dostupnost:. The autori potvrđuju da su svi podaci na kojima se temelji nalaze u potpunosti na raspolaganju bez ograničenja. Svi relevantni podaci u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Anhui Pokrajinski Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Različite strategije su korišteni za liječenje želučanog karcinoma (GC), što je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok smrtnih slučajeva raka u svijetu [1], [2]. Većina GC bolesnika dijagnosticiran je stadiju III ili IV, a stopa limfnih čvorova metastaza je visoka [3], [4]. Danas, bolesnici s kasnim stadijem GC su s ukupnim 5 godine opstanka appoximately 20% [5]. Za njih, to je od velike kliničke vrijednosti za daljnje tumačenje molekularne mehanizme koji su uključeni u GC metastaza, te za identifikaciju novih markera za dijagnozu, prognozu i liječenje bolesnika s GC. Pregled

mikroRNA (miRNAs) su male nekodirajuće RNA iz ~22 nukleotida u dužini koji reguliraju ekspresiju svojih ciljnih mRNA kroz translacijske represije ili mRNA cijepanjem [6]. Oni su uključeni u ključnim biološkim procesima, uključujući razvoj i diferencijaciji [7], [8]. Deregulacija miRNAs korelaciji igrati važnu ulogu u razvoju i progresiji karcinoma regulirajući stanična proliferacija, diferencijacija, apotosis i carcinogesis [9], [10]. Aberantna ekspresija miRNAs ili mutacijama gena Mirni je istražena u mnogim tipovima tumora, uključujući, limfoma, pluća, gušterače, leukemija, dojke, debelog crijeva i rak jetre [11] - [15]. Međutim, uloge miRNAs u GC i dalje u velikoj mjeri nepoznanica. Pregled

Prethodne studije su istraživali ulogu Mir-410 u nekoliko vrsta raka. Gattolliat sur [16] .demonstrated da izraz Mir-410 je značajno povezana s bolesti slobodnog opstanak ne-pojačan povoljnim neuroblastoma. Nadalje, Chen na el [17] je utvrdio da je izraz Mir-410 je smanjen u ljudskim glioma i prisiljeni izraz Mir-410 u glioma stanica snažno inhibira proliferaciju stanica, invaziju posredovan ciljajući MET. Štoviše, Chien i suradnici [18] su otkrili da Mir-410 negativno regulirana pRb /E2F put izravno ciljanje CDK1 koji je onkogena kod raka dojke. Međutim, uloga Mir-410 u GC i dalje ostaje nejasno. U ovom istraživanju, pokazali smo da je smanjen Mir-410 izraz je karakterističan molekularni promjena u GC i istraživali učinak moduliranih razinama Mir-410 na fenotipova GC staničnim linijama. Također smo pokazali da Mir-410 može funkcionirati kao onkogena izravno ciljanje MDM2. pregled

materijali i postupci

Izjava Etika pregled

Sve ove pacijente pristali sudjelovati u istraživanju i dao pisani pristanak. Oba ova studija i suglasnost su odobreni od strane etičkog odbora Anhui Pokrajinski bolnici i poštuje Deklaracije Helsinkija. Pregled

Ljudska uzorci

Ljudski GC i njihove odgovarajuće ne-tumorskih želučani Uzorci su prikupljeni u vrijeme kirurške resekcije iz Anhui Pokrajinski bolnice od 2008. do 2009. godine pismeni informirani pristanak dobiven prije kolekciju. Jedan dio fiksirane s 10% formalinu za patohistološku dijagnozu, a drugi je odmah momentalno smrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -196 ° C u tekućem dušiku sve do RNA je ekstrahirana. Korištenje ljudskih tkiva je odobren od strane kliničkih istraživanja etičkog povjerenstva Anhui Pokrajinski bolnice. Pregled

stanična kultura pregled

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 i HEK293T stanice kupljen od Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology pri kineskoj akademiji znanosti. Želučani epitela-1 stanica (GES) dobiven je iz Šangaja Ruijin bolnici Šangaj Jiaotong University School of Medicine. SGC-7901, HGC-27 MGC-803, MKN-45 i GES održavane su u RPMI1640 i HEK293T održavana u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle mediju medija. Medij nadopunjen s 10% fetalnog goveđeg seruma. Stanice su inkubirane na 37 ° C u vlažnoj komori s 5% ugljičnog dioksida. Pregled

plazmidi i stanična transfekcija pregled

Mir-410 oponašaju /inhibitor, a kontrole su kupljeni od RiboBio (Guangzhou, Kina). U HGC-27 stanice su posađene u šest jažica na 30% spajanja jedan dan prije transfekcije. Transfekcija sa Mir-410 imitira /inhibitor ili kontrola je provedena primjenom LipofectAMINE 2000 reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfekcije kompleksi su pripremljeni u skladu s uputama proizvođača. Pregled

QRT-PCR pregled

Za QRT-PCR testova, ukupna RNA je ekstrahirana iz stanica s Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverzna transkripcija izvršena je pomoću RT PrimeScript Kit reagensa s gDNA brisač (Takara) prema uputama proizvođača. Izraz Mir-410 je potvrđena od strane izmijenjeni stemloop RT-PCR sa specifičnim RT i PCR početnice. U6 snRNA se koristi kao endogenoj kontroli. RT reakcije su provedene upotrebom dio RNA s Promega RT Kit slijedeći protokol proizvođača. PCR uvjeti su provedeni pomoću denaturacija DNA na 94 ° C tijekom 4 minute, nakon čega slijedi 40 ciklusa pojačanja: 94 ° C za 40 s, 52 ° C za 40 s, 72 ° C tijekom 40 sekundi za prikupljanje podataka. Kvantitativni PCR je na ABI 7500 termocikleru (Applied Biosystems) koristeći SYBR premiks Ex Taq (Perfect realnom vremenu) kitovi (Takara, Japan) u skladu s uputama proizvođača. Pregled

proliferacije stanica pregled

ukupno 10 ^{4 stanica po jažici je stavljeno u 96 jažica prije transfekcije i uzgajani 24 sata u normalnim uvjetima. Oni su zatim transficirane sa Mir-410 imitira ili anti-Mir-410 inhibitora zajedno s uparenim negativne kontrole. stanična proliferacija je procijenjena pomoću brojanja Kit 8 (Dojindo, Tokyo, Japan) prema protokolu proizvođača. pregled}

migracije stanice i invaziju Test pregled

Za migracija testovima, 5 × 10 ^{4 stanica je dodano u gornju komoru umetka (BD Bioscience, 8 um veličina pora). Za pokusima invazije, 1 × 10 5 stanica dodano u gornju komoru umetka naneseno Matrigel (BD Bioscience). U oba pokusa, stanice su stavljene u medij bez seruma, a medij koji sadrži 10% FBS u donjoj komori je služio kao kemotakskijsko sredstvo. Nakon nekoliko sati inkubacije, stanice koje nisu migrirale ili napadaju kroz pore oprezno se izbrisao vatom. Zatim su umeci su obojene s 20% metanola i 0,2% kristalno ljubičastog, opažen i broje s IX71 invertiranog mikroskopa (Olympus). Pregled}

Western blot analiza pregled

Proteini su odvojeni na SDS poliakrilamidnom gel elektroforezom i transferirana na nitroceluloznu membranu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membrana je bila blokirana s 5% bezmasnim mlijekom i inkubirane s anti-zečjim MDM2 monoklonsko protutijelo (1:1000 Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) i mišjim anti-b-GAPDH monoklonsko protutijelo (1:10000; Sigma). Proteini detektirani su s poboljšanim reagensima kemiluminiscencije (Pierce, Rockford, IL, USA). Pregled

luciferaze Test pregled

HEK293T stanice su stavljene u pločice s 96 jažica. Nakon 24 sati inkubacije, smjesa 100 ng pLUC 3'UTR, negativna kontrola 5 pmol, miR-410 mimic je transfektirano s 20 ng, pregled

Renilla u HEK293T stanice pomoću Lipofectamine 2000. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, krijesnice i aktivnosti Renilla luciferaze su izmjerene sa Dual-luciferaze System (Promega, Madison, WI, USA). Učinkovitost transfekcije se normalizira kotransfekcijom s Renilla reporter vektor. Pregled

Statistička analiza pregled

Podaci su prikazani kao prosjek ± standardna devijacija od najmanje tri eksperimenta. Statistička analiza izvedena je pomoću SPSS 15.0. Jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) i Student-ovog testa su korišteni za statističke analize. Vrijednost od p. ≪ 0,05 smatra da ukazuju na statističku analizu pregled

Rezultat pregled

Izražavanje Mir-410 bio je znatno dolje regulirana u GC stanica i tkiva pregled

Za procjenu uloga Mir-410 u GC, procijenili smo ekspresiju Mir-410 u GC stanične linije, tkiva i njihovih podudarnih normalnih tkiva pomoću kvantitativne RT-PCR. Otkrili smo da je Mir-410 bile su često dolje regulirano staničnim linijama GC usporedbi s GES. Slika 1B prikazuje da je razina Mir-410 podregulirani u GC tkiva u usporedbi s onima u podudarnih normalnih tkiva. Prosječna razina ekspresije u tkivima karcinoma (kombinacija) bio je značajno viši u usporedbi s njihovim susjednim ne-maligne tkivima (Slika 1C). Također smo pokazali da izraz Mir-410 u metastaze GC tkiva bila je niža nego u ne-metastaze tkiva (sl. 1d). pregled

Mir-410 inhibirana proliferacija GC stanica, migraciju i invaziju pregled

razine Mir-410 je značajno povećana u GC stanicama koje su transfektirane s miR-410 oponaša i razine miR-410 su smanjeni tretiranih inhibitorom miR-410 (sl. 2). Up-regulaciji proliferacije Mir-410 inhibiran GC stanica; Nasuprot tome, obaranje Mir-410 imao suprotan učinak na proliferaciju stanica (sl. 2b). Štoviše, transjažice test i invaziju test pokazao da je premješten i invazivnost stanica transficiranih miR-410 oponaša dramatično smanjen u usporedbi s kontrolom i netretiranim stanicama. Također smo pokazali da su premješten i invazivnost stanica transficiranih miR-410 inhibitor je dramatično povećana u usporedbi s kontrolom i netretiranim stanicama. (Sl. 2C i D). Pregled

Mir-410 direktno ciljane MDM2 u GC pregled

Kao što je predvidio PicTar, bilo je komplementarnost između mora-Mir-410 i MDM2 3'-UTR (Sl . 3A). Kako bi se dokazalo da je Mir-410 izravno regulira MDM2, zaposleni smo reporterski sustav dual-luciferaze. našli smo da istovremena ekspresija Mir-410 je značajno potisnut firely luciferaze reporterski aktivnost divljeg tipa MDM2 3'UTR, ali ne i mutant 3'UTR (Sl. 3B). Prekomjerna ekspresija Mir-410 smanjuje ekspresiju MDM2 mRNA i proteina (Sl. 3c i D). Pregled

Prekomjerna MDM2 inpaired Mir-410-inducirana inhibicija invazije u GC stanicama pregled

Izvršili smo eksperimenti spašavanja transfekcijom 3'UTR-negativne MDM2 zajedno sa Mir-410. Kao što se očekivalo, transfekcija s pcDNA3.1-MDM2 ublažiti smanjenje MDM2 rezultat Mir-410 oponašaju liječenja (Sl. 4a). U dogovoru s izrazom ciljnih proteina, transfekcija s pcDNA3.1-MDM2 ublažiti inhibiciju stanične pojačanjem (Sl. 4B) i povećanjem invazivnih stanica (Sl. 4C) rezultat Mir-410 imitira liječenja. Pregled

MDM2 obrnuto je izražena sa Mir-410 u GC pregled

Kako bi se dodatno rasvijetliti odnos između Mir-410 i MDM2 ekspresije u primarnih uzoraka, mi prvo otkriven MDM2 u staničnim linijama GC. Kao što je prikazano na slici. Slike 5A i 5B, mRNA i proteina MDM2 bio znatno higer u staničnim linijama 4 GC nego u Ges. Također smo otkrili da je izraz MDM2 u GC tkiva bila je značajno viša nego u istom susjedstvu normalnog tkiva (sl. 5c). Scatter plot i analiza Pearson korelacija dalje pokazuju da Mir-410 ekspresija negativno koreliraju s razinama ciljnog proteina u uzorcima GC (Sl. 5D). Ovi podaci sugerirali da je smanjen Mir-410 ekspresija bila povezana s povećanim razinama MDM2 u većini pacijenata GC. Pregled

Rasprava pregled

miRNAs djelovao kao važni regulatori ekspresije gena na post -transcriptional razini i regulira širok spektar fizioloških i razvojnih procesa [6], [19], [20]. Montažne dokazi upućuju na to da promjene u ekspresiji miRNAs doprinijeti patogenezi od najvažnijih ljudskih tumora, koji mogu djelovati kao bilo onkogena ili tumorske smetnji [21], [22]. Nedavno, gomilaju podaci pokazuju da su miRNAs uključen u nekoliko važnih bioloških događaja, kao što su nastanku tumora i metastaze raka [23], [24]. U ovom istraživanju, istražili smo biološke uloge Mir-410 u ljudskoj GC nastanku tumora. Naši rezultati su pokazali da je Mir-410 bio je često dolje regulirano u ljudskom GC i da je njegova Smanjivanje se značajno je povezana s kliničkim fazi i limfnih čvorova metastaze. Prisilni izraz Mir-410 može povećati proliferaciju, migraciju i invaziju na GC stanica linije in vitro. Mi i dalje identificirati MDM2, urođeni tumor supresorski gen, što je izravna funkcionalne cilj MIR-410. Prema našim saznanjima, ovo je prvo istraživanje istražiti ulogu Mir-410 u GC, a naši rezultati pokazuju da Mir-410 djelovao kao novi onkogena u GC. Pregled

Deregulacija Mir-410 jedan je od čestih događaj u različitim oblicima raka, što ukazuje da miR-410 može igrati važnu ulogu u nastanku tumora i kod napredovanja tumora. Gattolliat i kolege pokazuju da je Mir-410 izražavanje bilo značajno povezana s bolesti slobodnog opstanak ne-pojačan povoljnim neuroblastoma [16]. Nadalje, Chen [17] je utvrdio da Mir-410 ekspresija je smanjen u ljudskim glioma i prisiljeni Mir-410 izraz u glioma stanica snažno inhibira proliferaciju stanica, invaziju posredovan ciljajući MET. Međutim, izraz i funkcija Mir-410 u razvoju GC nije prijavio. U ovom istraživanju, identificirali smo ekspresiju Mir-410 u nekoliko GC staničnim linijama i GES koriste QRT-PCR. Izraz Mir-410 značajno je povećan u svim staničnim linijama četiri GC odnosu na GES. Nadalje, rezultati dobiveni iz kliničke GC tkiva također potvrdio da je Mir-410 je dolje regulirano u GC tkiva u usporedbi s uparenim non-kancerogen susjedna tkiva, što ukazuje na njegovu moguću umiješanost u oba onkogena transformacija i metastaze tumora. Mi naknadno potvrdio da inhibicija Mir-410 je značajno unaprijeđen GC staničnu proliferaciju, migraciju i invaziju in vitro. Pregled

dodatno istražiti molekularni mehanizam u podlozi ulogu Mir-410 i identificirati MDM2 kao izravna funkcionalne nizvodno cilj mir-410 u GC stanicama. Bioinformatika pristupi, koji su korišteni za predviđanje ciljeva miRNAs, istaknuo visoku sjeme utakmicu slobodne energije u dobro očuvan Mirna vezanja i njegovih ciljnih mRNA, no specifičnost i dalje predstavlja problem u definiranju ciljeva mnogih miRNAs. Tako, prekomjerna ekspresija Mirni može se regulirati ekspresiju ciljnog proteina. Komplementarna slijed Mir-410 je identificiran u 3'UTR MDM2 mRNA. Nadalje, pokazali smo da miR-410 izravno usmjeren 3'UTR MDM2, jer njegova prekomjerna ekspresija povezana je sa supresijom aktivnost luciferaze. Osim toga, značajni Smanjivanje se u razini proteina MDM2 uočeno je nakon miR-410 prekomjernom ekspresijom, što ukazuje posttranskripcijsko regulaciju MDM2 preko usmjerava svoju 3'UTR. Ovi rezultati ukazuju da miR-410 može funkcionirati kao tumor-supresor djelomično posredovano potiskujući miR-410 ekspresiju u razvoju GC. Pregled

MDM2 je onkogena koji je prvo otkriveni u lokusu pojačan na dvostrukim minuta kromosoma u tumore miš stanične linije (3T3-DM) [25]. Glavna funkcija MDM2 je inhibicija p53 bioaktivnost blokiranjem transkripcijsku aktivnost p53 i promicanja degradacije p53 proteina [26] - [28]. Visoka razina MDM2 smanjena razina proteina p53 i može prigušiti funkciju p53, koji je povećan rizik od karcinoma i /ili ubrzanog stvaranja tumora i napredovanje [29]. MDM2 onkogena odigrao važnu ulogu u progresiji karcinoma [30]. Prekomjerna ekspresija MDM2 u stanicama tumora induciranog proliferacije stanica, inhibira staničnu apoptozu [31]. Nekoliko studija je pokazalo da MDM2 pojačana ekspresija je povezana s lošim opstanak i bio koristan prediktivni čimbenik za lošom prognozom kod ljudi s hepatocelularnog karcinoma i karcinoma dojke [32], [33]. Osim toga, nedavna studija su otkrili da MDM2 je izražena na višim razinama u GC tkivima nego u ne-kancerozne želučane sluznice, a MDM2 ekspresija je povezana s kliničko značajke u bolesnika liječenih samo s operacijom [34], [35]. Osim toga, obaranje MDM2 ili pojačanom ekspresijom JWA ima sinergistički učinak na suzbijanje proliferacije želučanog karcinoma i migraciju stanica [35]. Međutim, mehanizam kako MDM2 je pojačana ekspresija je još uvijek nepoznat. Ovi rezultati pokazuju da je sposobnost Mir-410 ciljati MDM2 može dati jedan takav mehanizam post-kontrole transkripcije MDM2. Pregled

Ukratko, naši rezultati su pokazali da je Mir-410 bio je znatno dolje regulirana GC stanice i tkiva. Prisilni izraz Mir-410 povećane proliferacije GC stanica, migracije i invazije kroz izravno ciljanje MDM2. Ovi rezultati ukazuju na to da je ovaj roman Mir-410 /MDM2 os pruža novi uvid u mehanizme metastaza tumora, i represiju Mir-410 izražavanja može biti potencijalna terapijska strategija za liječenje GC u budućnosti. Pregled

popratne podatke
Tablica S1. pregled kliničko charateristics pacijenata s GC pregled DOI:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s001 pregled (docx) pregled Tablica S2. pregled Primer slijed pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002 pregled (docx) pregled

• PLoS ONE: Analiza limfnog čvora metastaza odnos s prognozom u bolesnika sa T2 rak želuca
• PLoS ONE: Udruga između Dairy usisa i rak želuca: meta-analiza opservacijske Studies