PLOS ONE: Migração Suprime MicroRNA-410 e invasão por Segmentação MDM2 em Câncer Gástrico

Abstract

O câncer gástrico é uma das neoplasias mais frequentes em tumores nos países do Leste Asiático. A identificação de marcadores de prognóstico precisos e alvos terapêuticos eficazes é importante no tratamento de cancro gástrico. microRNAs (miRNAs) desempenham um papel importante na tumorigênese. No entanto, os mecanismos através dos quais miARNs regulam a metástase do cancro gástrico permanecem pouco compreendidos. Neste estudo, verificou-se que os níveis de miR-410 em linhas de câncer e células gástricas foram muito menores do que no controle normal, respectivamente, e o menor nível de miR-410 foi significativamente associada com linfonodo metástases. A transfecção de miR-410 imita poderiam inibir de forma significativa a proliferação celular, migração e invasão em linhas celulares de cancro gástrico HGC-27. Em contraste, knockdown de miR-410 teve um efeito contrário sobre a proliferação celular, migração e invasão. Além disso, também descobrimos que MDM2 foi regulada negativamente por miR-410 no nível pós-transcricional, através de um sítio alvo específico com o 3'UTR pelo ensaio de repórter luciferase. A expressão de MDM2 foi inversamente correlacionada com a expressão de miR-410 em tecidos de cancro gástrico, e a sobre-expressão de MDM2 em células de cancro gástrico miR-410 transfectadas de forma eficaz resgatado a inibição da proliferação celular e invasão causada por miR-410. Assim, os nossos resultados sugerem que o miR-410 actuaram como um supressor de tumor novo por direccionamento do gene MDM2 e inibir as células cancerosas gástricas proliferação, migração e invasão. Os resultados deste estudo contribuiu para a atual compreensão dessas funções de miR-410 no câncer gástrico

Citation:. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 Migração Suprime e invasão por Segmentação MDM2 no câncer gástrico. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de maio de 2014; Aceito: 09 de julho de 2014; Publicação: 19 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Anhui Provincial Natural Science Foundation (. NÃO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

diferentes estratégias têm sido usados ​​para tratar câncer gástrico (GC), que é o quarto câncer mais prevalente e a segunda principal causa de mortes por câncer no mundo [1], [2]. A maioria dos pacientes do GC é diagnosticado em estágio III ou IV, ea taxa de metástase ganglionar é elevada [3], [4]. Hoje em dia, os pacientes com a GC em estágio final é com a sobrevivência de appoximately 20% [5] um conjunto 5 do ano. Para tanto, é de grande valor clínico para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na metástase GC e para identificar novos marcadores para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de pacientes com GC.

microARNs (miARNs) são pequenos não codificante RNAs de ± 22 nucleótidos de comprimento o que regulam a expressão dos seus mRNAs alvo através da repressão de translação ou de clivagem de ARNm [6]. Eles estão envolvidos em processos biológicos essenciais, incluindo o desenvolvimento e diferenciação [7], [8]. A desregulação de miARNs está correlacionada a desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro através da regulação da proliferação celular, diferenciação, e Apotosis carcinogesis [9], [10]. expressão aberrante de miARNs ou mutações de genes de miARN têm sido bem investigadas em diversos tipos de tumores, incluindo o linfoma, pulmão, pâncreas, leucemia, mama, cólon e cancros do fígado [11] - [15]. No entanto, os papéis de miRNAs em GC permanecem largamente desconhecidos.

Estudos anteriores têm investigado o papel de miR-410 em vários tipos de câncer. Gattolliat et al [16] .demonstrated que a expressão de miR-410 foi significativamente associado com a sobrevivência livre de doença do neuroblastoma não amplificado favorável. Além disso, em Chen el [17] verificaram que a expressão de miR-410 foi reduzida em gliomas humanos e expressão de miR-410 em células de glioma forçado inibiu fortemente a proliferação celular, invasão mediada por segmentação TEM. Além disso, Chien et al [18] descobriram que miR-410 regulado negativamente pRb /via E2F diretamente pela segmentação CDK1 que era um oncogene no cancro da mama. No entanto, o papel de miR-410 em GC ainda permanece incerto. Neste estudo, foi demonstrado que a diminuição da expressão de miR-410 é uma alteração molecular característico no GC e investigou o efeito de níveis modulados miR-410 sobre os fenótipos das linhas de células de GC. Nós também mostraram que miR-410 pode funcionar como um oncogene diretamente pela segmentação MDM2.

Declaração de Materiais e Métodos
Ética

Todos os pacientes concordaram em participar do estudo e deu consentimento informado por escrito. Tanto este estudo e consentimento foram aprovados pelo conselho de ética do Hospital Provincial de Anhui e cumpriu com a Declaração de Helsinki.

amostras Humanos

GC Humana e suas amostras gástricas não-tumorais correspondentes foram recolhidas no momento da ressecção cirúrgica do Hospital Provincial de Anhui, de 2008 a 2009. consentimento informado escrito foi obtido antes da coleta. Uma parte foi fixada com formalina a 10% para diagnóstico histopatológico, e o outro foi imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -196 ° C em azoto líquido até que o ARN foi extraído. Utilização de tecidos humanos foi aprovado pela Comissão de Anhui Hospital Provincial de Ética em Pesquisa Clínica.

cultura celular

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 e células HEK293T foram comprados do Instituto Xangai de Bioquímica e Biologia celular da Academia chinesa de Ciências. Epiteliais gástricas-1 de células (GES) foi obtido a partir da Shanghai Ruijin Hospital de Xangai Jiaotong University School of Medicine. O SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 e GES foram mantidas em RPMI 1640 e HEK293T foi mantida em meio meio de Eagle modificado por Dulbecco. O meio foi suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células foram incubadas a 37 ° C numa câmara humidif içada contendo 5% de dióxido de carbono.

Os plasmídeos de células e transfecção

miR-410 mímico /inibidor e os controlos foram adquiridos a RiboBio (Cantão, China). As células HGC-27 foram semeadas em placas de seis poços a 30% de confluência, um dia antes da transfecção. A transfecção com o miR-410 mímico /inibidor ou os controlos foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). complexos de transfecção foram preparados de acordo com as instruções do fabricante.

qRT-PCR

Para os ensaios de qRT-PCR, o ARN total foi extraído a partir de células com o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A transcrição reversa foi realizada com o kit de reagentes PrimeScript RT com ADNg borracha (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. A expressão de miR-410 foi verificada por meio da stemloop alterada de RT-PCR com iniciadores específicos e PCR RT. U6 snRNA foi usado como um controle endógeno. reacções RT foram realizadas utilizando ARN fracção com o kit Promega RT seguindo o protocolo do fabricante. As condições de PCR foram realizadas por desnaturação do ADN a 94 ° C durante 4 min, seguido por 40 ciclos de amplificação: 94 ° C durante 40 s, 52 ° C durante 40 s, 72 ° C durante 40 s para a recolha de dados. Quantitative PCR foi realizada em um termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems) utilizando SYBR Premix Ex Taq (perfeito Tempo Real) Kits (Takara, Japão) de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaio de Proliferação Celular

Um total de 10 ^{4 células por poço foram plaqueadas em placas de 96 poços antes da transfecção e foram cultivadas durante 24 horas em condições normais. Eles foram, em seguida, transfectadas com miR-410 mímica ou inibidor de anti-miR-410, juntamente com os controlos negativos associados a este. A proliferação celular foi avaliada utilizando o Kit celular Contagem 8 (Dojindo, Tóquio, Japão), de acordo com o protocolo do fabricante.}

A migração celular e invasão ensaio

Para os ensaios de migração, 5 × 10 ^{4 células foram adicionadas para dentro da câmara superior da peça inserta (BD Bioscience, 8 mícrons de tamanho de poro). Para os ensaios de invasão, 1 × 10 5 células foram adicionadas para dentro da câmara superior do inserto pré-revestidas com Matrigel (BD Bioscience). Em ambos os ensaios, as células foram plaqueadas em meio sem soro, e meio contendo FBS a 10% na câmara inferior serviu como quimioatractor. Após várias horas de incubação, as células que não migraram ou invadem através dos poros foram cuidadosamente eliminada com lã de algodão. Em seguida, as pastilhas foram coradas com 20% de metanol e 0,2% de violeta cristal, fotografadas e contadas com um microscópio invertido IX71 (Olympus).}

Western blot análise

As proteínas foram separadas em SDS-poliacrilamida electroforese em gel e transferidos para a membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A membrana foi bloqueada com leite não gordo a 5% e incubadas com o anticorpo de coelho anti-MDM2 monoclonal (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) e o anticorpo monoclonal anti-b-GAPDH do rato (1:10000; Sigma). As proteínas foram detectadas com reagentes de quimioluminescência aumentada (Pierce, Rockford, IL, EUA).

repórter luciferase ensaio

células HEK293T foram plaqueadas em placas de 96 poços. Após 24 horas de incubação, uma mistura de 100 ng pLUC 3'UTR, controle negativo 5 pmol, miR-410 mímico foi co-transfectado com 20 ng.

Renilla em células HEK293T usando Lipofectamine 2000. Quarenta e oito horas após a transfecção, as actividades da luciferase Renilla pirilampo e foram medidos com a luciferase dupla Reporter System (Promega, Madison, WI, EUA). A eficiência de transfecção foi normalizada por co-transfecção com um repórter vector Renilla.

A análise estatística

Os dados foram apresentados como médias ± desvio padrão de pelo menos três experiências. A análise estatística foi realizada usando SPSS 15.0. Uma análise de uma via da variância (ANOVA) e teste t de Student foram utilizados para análise estatística. Um valor de p <. 0,05 foi considerado para indicar uma análise estatística

Resultado

A expressão de miR-410 foi significativamente regulada em células e tecidos GC

Para avaliar o papel de miR-410 em GC, foi avaliada a expressão de miR-410 na linha celular de GC, tecidos e seus tecidos normais correspondentes usando RT-PCR quantitativo. Descobrimos que miR-410 níveis eram freqüentemente regulada para baixo em linhas de células de GC em comparação com GES. A Figura 1B mostra que os níveis de miR-410 foram regulados negativamente nos tecidos GC em comparação com aqueles nos tecidos normais correspondentes. O nível de expressão em tecidos de carcinoma média (combinação) foi significativamente mais elevada em comparação com os tecidos não neoplásicos adjacentes (Figura 1C). Também mostramos que a expressão de miR-410 nos tecidos metástases GC era mais baixa do que em tecidos não-metástases (Fig. 1D).

miR-410 inibiu a proliferação de células de GC, migração e invasão

os níveis de miR-410 foram significativamente aumentados em células GC que foram transfectadas com o miR-410 e imita os níveis de miR-410 foram reduzidos que foram tratadas com o inibidor de miR-410 (Fig. 2A). A regulação da proliferação de células de miR-410 inibiu GC; Em contraste, o knockdown de miR-410 teve um efeito contrário sobre a proliferação celular (Fig. 2B). Além disso, o ensaio de invasão de ensaio Transwell e mostrou que a migrado e invasividade de células transfectadas com o miR-410 imita foi drasticamente diminuída em comparação com as células não tratadas e de controlo. Também mostrou que o migrado e invasividade de células transfectadas com o miR-410 inibidor foi aumentado dramaticamente em comparação com o controlo de células não tratadas e. (Fig. 2C e D).

miR-410 directamente visados ​​MDM2 em GC

Como previsto por PicTar, houve complementaridade entre has-miR-410 e MDM2 3'-UTR (Fig . 3A). Para demonstrar que o miR-410 regula directamente a MDM2, que empregou um sistema repórter de luciferase dupla. Descobrimos que a co-expressão de miR-410 suprimiu significativamente a actividade de luciferase repórter firely do tipo selvagem, mas não MDM2 3'UTR 3 'UTR o mutante (Fig. 3B). A sobre-expressão de miR-410 reduziu a expressão de ARNm e proteína MDM2 (Fig. 3C e D).

A sobre-expressão de MDM2 inpaired inibição da invasão de miR-410-induzida em células GC

realizadas experimentos de resgate por transfecção de MDM2 3'UTR-negativas juntamente com miR-410. Como esperado, a transfecção com pcDNA3.1-MDM2 aliviada a redução de MDM2 resultou de miR-410 mímico tratamento (Fig. 4A). De acordo com a expressão de proteínas alvo, a transfecção com pcDNA3.1-MDM2 atenuado a inibição da amplificação de células (Fig. 4B) e o aumento de células invasoras (Fig. 4C) resultaram de miR-410 tratamento mímica.

MDM2 foi inversamente expressa com miR-410 em GC
MDM2

Para melhor elucidar a relação entre o miR-410 e expressão de MDM2 em amostras primárias, temos primeiro detectado em linhas de células de GC. Como mostrado na Fig. 5A e 5B, o ARNm e a expressão da proteína de MDM2 era muito Higer nas linhas de células de 4 GC do que no GES. Nós também descobrimos que a expressão de MDM2 em tecidos GC foi significativamente maior do que nos correspondentes tecidos normais adjacentes (Fig. 5C). O gráfico de dispersão e análise de correlação de Pearson mostrou ainda que a expressão de miR-410 foi negativamente correlacionada com os níveis de proteína alvo nas amostras de GC (Fig. 5D). Estes dados sugerem que a diminuição da expressão de miR-410 foi relacionado ao aumento dos níveis de MDM2 na maioria dos pacientes do GC.

Discussão

miRNAs têm agido como importantes reguladores da expressão gênica no posto nível -transcriptional e regulam uma grande variedade de processos fisiológicos e de desenvolvimento [6], [19], [20]. evidências de montagem sugerem que alterações na expressão dos miRNAs contribuir para a patogênese dos cancros mais humanos, que podem actuar tanto como oncogenes ou supressores de tumor [21], [22]. Recentemente, os dados que se acumulam indicam que miRNAs estão envolvidos em diversos eventos biológicos importantes, como tumorigênese e câncer metástase [23], [24]. No presente estudo, investigamos o papel biológico de miR-410 na tumorigênese GC humano. Nossos resultados demonstraram que o miR-410 foi frequentemente regulada para baixo em GC humana e que a sua infra-regulação foi significativamente associada com o estágio clínico e metástases em linfonodos. expressão forçada de miR-410 pode aumentar a proliferação, migração e invasão da linha de células in vitro GC. Nós ainda identificados MDM2, um gene supressor tumoral putativo, como um alvo funcional directa de miR-410. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a explorar o papel do miR-410 em GC, e os nossos resultados indicaram que miR-410 agiu como um novo oncogene em GC.

A desregulamentação do miR-410 é uma freqüente caso em vários cancros, o que sugere que o miR-410 pode desempenhar um importante papel na tumorigénese e na progressão tumoral. Gattolliat e colegas mostram que a expressão de miR-410 foi significativamente associada com sobrevida livre de doença do neuroblastoma favorável não amplificado [16]. Além disso, Chen [17] verificaram que o miR-410 de expressão foi reduzido em gliomas humanos e forçou o miR-410 a expressão em células de glioma inibidas fortemente a proliferação celular, invasão mediada por segmentação TEM. No entanto, a expressão e função de miR-410 em desenvolvimento GC não foi relatada. Neste estudo, foi identificada a expressão de miR-410 em várias linhas celulares de GC e a GES utilizando qRT-PCR. A expressão de miR-410 foi significativamente aumentada em todas as quatro linhas celulares em comparação com GC na GES. Além disso, os resultados obtidos a partir de tecido GC clínica também confirmou que o miR-410 foi regulada negativamente nos tecidos GC em comparação com os tecidos adjacentes não emparelhados cancerosas, indicando o seu possível envolvimento em ambos transformação oncogénica e tumoral metástase. A seguir, foi confirmado que a inibição de miR-410 promoveu significativamente GC célula proliferação, migração e invasão in vitro.

Nós exploramos ainda mais o mecanismo molecular subjacente ao papel de miR-410 e MDM2 identificado como um alvo a jusante funcional directa de miR-410 em células de GC. abordagens de bioinformática, que foram utilizados para prever alvos de miRNAs, destacou um alto jogo semente livre de energia no local miRNA-vinculativo bem conservada e seus mRNAs alvo, mas a especificidade manteve-se um problema na definição de metas de muitos miRNAs. Assim, a sobre-expressão de um miARN pode regular negativamente a expressão da proteína alvo. sequência complementar de miR-410 é identificada na 3'UTR do ARNm de MDM2. Além disso, foi demonstrado que o miR-410 tem como alvo directamente o 3 'UTR de MDM2, como a sua sobre-expressão foi associada à supressão da actividade da luciferase. Além disso, observou-se uma significativa diminuição da regulação do nível de proteína MDM2 depois de miR-410 superexpressão, indicando regulação pós-transcricional de MDM2 via visando a sua 3'UTR. Estes resultados indicaram que o miR-410 pode funcionar como um supressor do tumor, em parte, mediada por reprimindo a expressão de miR-410 em desenvolvimento GC.

MDM2 é um oncogene que foi primeiramente descoberto no locus amplificada em cromossomas duplos minuto num tumorigénico rato linha de células (3T3-MS) [25]. A principal função de MDM2 a p53 é inibir a bioactividade, bloqueando a actividade transcricional de p53 e promovendo a degradação da proteína p53 [26] - [28]. Os níveis elevados de MDM2 diminuiu os níveis de proteína p53 e pode atenuar a função de p53, o que aumentou o risco de cancro e /ou a formação de tumores e progressão acelerada [29]. O oncogene MDM2 desempenhou um papel importante na progressão do cancro [30]. A sobre-expressão de MDM2 em células tumorais induzida a proliferação de células, inibe a apoptose de células [31]. Vários estudos mostraram que MDM2 superexpressão foi associada com a sobrevivência pobre e foi um fator preditivo útil para mau prognóstico em seres humanos com carcinoma hepatocelular e da mama carcinomas, [33] [32]. Além disso, o estudo recente descobriram que a MDM2 foi expresso em níveis mais elevados em tecidos de GC do que na mucosa gástrica não-cancerosas, e a expressão de MDM2 foi associada com características clinicopatológicas em doentes tratados apenas com cirurgia [34], [35]. Além disso, knockdown de MDM2 ou sobre-expressão de JWA tem o efeito sinérgico sobre a supressão da proliferação de células de cancro gástrico e migração [35]. No entanto, o mecanismo de como a sobre-expressão de MDM2 foi ainda é desconhecido. Estes resultados indicaram que a capacidade de miR-410 para atingir a MDM2 pode proporcionar um tal mecanismo de controlo pós-transcricional de MDM2.

Em resumo, os nossos resultados mostraram que o miR-410 foi significativamente regulada para baixo em GC células e tecidos. Forçada expressão de miR-410 aumentou a proliferação de células GC, migração e invasão através visam directamente MDM2. Estes resultados sugerem que este romance miR-410 eixo /MDM2 fornece uma nova visão sobre a mecanismos de metástase de tumor subjacente, ea repressão de miR-410 expressão pode ser uma estratégia terapêutica potencial para o tratamento de GC no futuro.

Informações de Apoio
Tabela S1. charateristics
clinicopatológico de pacientes com GC
DOI: 10.1371. /journal.pone.0104510.s001
(DOCX)
Tabela S2.
Primer sequência
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

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