PLoS ONE: MicroRNA-410 Unterdrückt Migration und Invasion von MDM2 in Gastric Cancer

Abstrakt

Magenkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen bei Tumoren in den ostasiatischen Ländern. Die Identifizierung genaue prognostische Marker und effektive therapeutische Ziele ist wichtig bei der Behandlung von Magenkrebs. microRNAs (miRNAs) spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung. Jedoch, durch die Magenkrebsmetastasen regulieren bleiben schlecht verstanden die Mechanismen miRNAs. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Konzentrationen von miR-410 in Magenkrebs und Zellinien waren viel geringer als die in der normalen Steuerung, bzw., und der unteren Ebene der miR-410 war signifikant mit Lymphknotenmetastasen assoziiert. Die Transfektion von miR-410 imitiert konnte signifikant die Zellproliferation, Migration und Invasion in den HGC-27 Magenkrebs-Zelllinien zu hemmen. Im Gegensatz dazu Zuschlags von miR-410 hatte die entgegengesetzte Wirkung auf die Zellproliferation, Migration und Invasion. Darüber hinaus haben wir auch festgestellt, dass MDM2 negativ von miR-410 in der post-transkriptioneller Ebene, mit der 3'UTR über eine spezifische Zielstelle durch Luciferase-Reporterassay geregelt wurde. Die Expression von MDM2 war invers mit miR-410 Expression in Magenkrebs Gewebe, und die Überexpression von MDM2 in miR-410-transfizierten Magenkrebszellen korreliert effektiv die Hemmung der Zellproliferation und Invasion von miR-410 verursacht gerettet. So sind unsere Erkenntnisse vorgeschlagen, dass miR-410 als ein neuer Tumor-Suppressor agierte durch das MDM2-Gen-Targeting und Magenkrebszellen Proliferation, Migration und Invasion zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Studie beigetragen zum aktuellen Verständnis dieser Funktionen von miR-410 in Magenkrebs

Citation:. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 Unterdrückt Migration und Invasion von MDM2 in Magenkrebs-Targeting. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 6. Mai 2014; Akzeptiert: 9. Juli 2014; Veröffentlicht am: 19. August 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Anhui Provincial Natural Science Foundation (Nr. 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Verschiedene Strategien wurden verwendet, um Magenkrebs (GC) zu behandeln, die die vierte am weitesten verbreitete Krebs ist und die zweithäufigste Ursache der Krebstoten in der Welt [1], [2]. Die meisten GC-Patienten wird in der Stufe III oder IV diagnostiziert, und die Rate von Lymphknotenmetastasen hoch ist [3], [4]. Heutzutage Patienten mit der GC im Spätstadium werden mit einer insgesamt 5-Jahres Überleben von appoximately 20% [5]. Daher ist es von großer klinischer Wert weiter die molekularen Mechanismen in GC Metastasierung beteiligt aufzuklären und neue Marker für die Diagnose, Prognose und die Behandlung von Patienten mit GC zu identifizieren.

microRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs von ~ 22 Nukleotiden in der Länge, die die Expression der Ziel-mRNAs durch translationale Repression oder mRNA-Spaltung [6] regulieren. Sie sind in den entscheidenden biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der Entwicklung und Differenzierung [7], [8]. Die Dysregulation der miRNAs korreliert durch Regulierung der Zellproliferation, Differenzierung und apotosis carcinogesis [9], [10] eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Krebs und Progression zu spielen. [15] - aberrante Expression von miRNAs oder Mutationen von miRNA-Gene wurden in vielen Arten von Tumoren, einschließlich Lymphom, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Leukämie, Brust-, Dickdarm- und Leberkrebs [11] gut untersucht. Allerdings bleiben die Rollen von miRNAs in GC weitgehend unbekannt.

Frühere Studien die Rolle der miR-410 in verschiedenen Krebsarten untersucht. Gattolliat et al [16] .demonstrated dass die Expression von miR-410 signifikant mit krankheitsfreie Überleben der nicht-verstärkten günstige Neuroblastom assoziiert war. Weiter fand Chen bei el [17], dass die Expression von miR-410 in der menschlichen Gliomen und die Expression von miR-410, um die Zellproliferation, die Invasion durch gezielte MET vermittelte stark gehemmt in Gliom-Zellen gezwungen reduziert wurde. Außerdem Chien et al [18] festgestellt, dass miR-410 negativ pRb /E2F Weg reguliert durch direkt CDK1 Targeting, die ein Onkogen bei Brustkrebs war. Allerdings bleibt die Rolle von miR-410 in GC noch unklar. In dieser Studie zeigten wir, dass miR-410 Expression vermindert ist eine charakteristische molekulare Veränderung in GC und untersuchten die Wirkung von modulierten miR-410 Pegel auf den Phänotypen von GC-Zelllinien. Wir zeigten auch, dass miR-410 als Onkogen durch direktes Targeting MDM2 funktionieren.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle diese Patienten vereinbart, an der Studie teilzunehmen und gab informierte Zustimmung geschrieben. Sowohl diese Studie und die Zustimmung wurden von der Ethikausschuss der Provinz Anhui Hospital und Einhaltung der Deklaration von Helsinki genehmigt.

Humanproben

Human GC und ihre entsprechenden nicht-tumorösen Magenproben wurden gesammelt zum Zeitpunkt der chirurgischen Resektion von der Anhui Provincial Hospital von 2008 bis 2009. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde vor Sammlung erhalten. Ein Teil wurde mit 10% Formalin für histopathologische Diagnose fixiert, und das andere wurde sofort schockgefroren in flüssigem Stickstoff gelagert und bei -196 ° C in flüssigem Stickstoff bis zur RNA extrahiert wurde. Die Verwendung von menschlichen Geweben durch die Clinical Research Ethics Committee der Provinz Anhui Krankenhaus genehmigt wurde.

Zellkultur

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 und HEK293T-Zellen wurden von der Shanghai-Institut für Biochemie und Zellbiologie an der chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben. Magenepithelzellen-1-Zellen (GES) wurde von der Shanghai Ruijin Krankenhaus von Shanghai Jiaotong University School of Medicine erhalten. Die SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 und GES wurden in RPMI1640 gehalten und HEK293T wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium Medien gehalten. Die Medien wurden mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt. Die Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer mit 5% Kohlendioxid inkubiert.

Plasmiden und Zelltransfektion

miR-410 mimic /Inhibitor und die Kontrollen wurden aus RiboBio (Guangzhou erworben, China). Die HGC-27-Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen bei 30% Konfluenz einen Tag vor der Transfektion ausgesät. Die Transfektion mit miR-410 mimischen /Inhibitor oder die Kontrollen durchgeführt wurde unter Verwendung von Lipofectamin 2000 Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfection Komplexe wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet.

qRT-PCR

Für qRT-PCR-Assays, Gesamt-RNA aus Zellen mit Trizolreagenz extrahiert wurde (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverse Transkription wurde mit gDNA Radiergummi (Takara) mit dem PrimeScript RT Reagenzienkit erfolgt nach den Anweisungen des Herstellers. Die Expression von miR-410 wurde durch die veränderte stemloop RT-PCR mit spezifischen RT-Primern und PCR verifiziert. U6 snRNA wurde als endogene Kontrolle verwendet. RT-Reaktionen wurden unter Verwendung von RNA-Fraktion mit Promega RT Kit des Protokolls des Herstellers folgende ausgeführt. Die PCR-Bedingungen wurden für 4 min durch Denaturieren der DNA bei 94 ° C durchgeführt, gefolgt von 40 Zyklen der Amplifikation: 94 ° C für 40 s, 52 ° C für 40 s, 72 ° C für 40 s für die Datenerfassung. Quantitative PCR wurde auf einem ABI 7500 Thermocycler (Applied Biosystems) unter Verwendung von SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) Kits durchgeführt (Takara, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Cell Proliferation Assay

insgesamt 10 ^{4 Zellen pro Napf wurden in 96-Well-Platten vor der Transfektion und für 24 h unter normalen Bedingungen plattiert. Sie wurden dann mit miR-410 Mimik oder anti-miR-410-Inhibitor transfiziert zusammen mit gekoppelten negativen Kontrollen. Die Zellproliferation wurde die Zellzählung Kit bewertet unter Verwendung von 8 (Dojindo, Tokyo, Japan) nach dem Protokoll des Herstellers.}

Die Zellmigration und Invasion Assay

Für die Migrationsassays, 5 x 10 ^{4-Zellen wurden in die obere Kammer des Einsatzes hinzugefügt (BD Bioscience, 8-um Porengröße). Für die Invasionsassays, 1 x 10 5 Zellen wurden in die obere Kammer des mit Matrigel (BD Bioscience) vorbeschichtet Einsatz hinzugefügt. In beiden Tests wurden die Zellen in Medium ohne Serum plattiert und Medium, das 10% FBS in der unteren Kammer diente als Chemoattraktant enthält. Nach mehreren Stunden Inkubation, dass die Zellen durch die Poren nicht sorgfältig mit Watte abgewischt wandern oder eindringen. Dann wurden die Einsätze mit 20% Methanol und 0,2% Kristallviolett, abgebildet gefärbt und mit einem IX71 inverses Mikroskop (Olympus) gezählt.}

Western blot analysis

Die Proteine ​​wurden auf SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und an das Nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Die Membran wurde mit 5% fettfreier Milch blockiert und mit dem Kaninchen-anti-MDM2 monoklonalen Antikörper inkubiert (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) und die Maus-anti-b-GAPDH monoklonaler Antikörper (1:10000; Sigma). Die Proteine ​​wurden mit verstärkter Chemilumineszenz-Reagenzien (Pierce, Rockford, IL, USA) nachgewiesen.

Luciferase Reporter Assay

HEK293T-Zellen in 96-well-Platten ausplattiert wurden. Nach 24 h Inkubation wurde ein Gemisch aus 100 ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negative Kontrolle, miR-410 mimic mit 20 ng cotransfiziert.

Renilla in HEK293T-Zellen Lipofectamine 2000 Achtundvierzig Verwendung Stunden nach der Transfektion firefly und Renilla-Luciferase-Aktivitäten wurden mit dem Dual-Luciferase-Reporter-System (Promega, Madison, WI, USA) gemessen. Die Transfektionseffizienz wurde durch Co-Transfektion mit einem Renilla-Reportervektor normalisiert.

Die statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittel ± Standardabweichung von zumindest drei Experimenten dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit SPSS 15.0 durchgeführt. Ein Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) Test und Student t-Test wurden für die statistische Analyse verwendet. Ein Wert von p <. 0,05 wurde als eine statistische Analyse, um anzuzeigen,

Ergebnis

Die Expression von miR-410 war signifikant herunterreguliert in GC Zell- und Gewebe

Zur Beurteilung die Rolle der miR-410 in GC werteten wir die Expression von miR-410 in GC-Zelllinie, Gewebe und ihre ausgeglichenen normalen Geweben mittels quantitativer RT-PCR. Wir fanden, dass miR-410 Stufen in GC-Zelllinien im Vergleich zu GES häufig herunterreguliert waren. 1B zeigt, dass die miR-410-Spiegel wurden herunterreguliert in GC Gewebe im Vergleich zu denen in abgestimmten normalen Geweben. Die durchschnittliche Expressionsniveau in Karzinomgewebe (Kombination) war signifikant höher im Vergleich zu ihren benachbarten nicht-neoplastischen Gewebe (1C). Wir zeigten auch, dass die Expression von miR-410 in den Metastasen GC Gewebe war geringer als in nicht-Metastasen Geweben (Fig. 1D).

miR-410 inhibierte GC Zellproliferation, Migration und Invasion

die Pegel von miR-410 wurden in GC-Zellen signifikant erhöht, die mit miR-410 imitiert transfiziert wurden und die miR-410-Spiegel wurden verringert, die mit der miR-410-Inhibitor behandelt wurden (Abb. 2A). Hochregulation von miR-410 gehemmt GC Zellproliferation; Im Gegensatz dazu Zuschlags von miR-410 hatte die entgegengesetzte Wirkung auf die Zellproliferation (Fig. 2B). Darüber hinaus zeigten die Transwell-Assay und Invasionstest, daß die umgelagerte und Invasivität von mit miR-410 ahmt transfizierten Zellen dramatisch mit der Kontrolle und unbehandelten Zellen verglichen verringert wurde. Wir zeigten auch, dass die migrierten und Invasivität von mit miR-410-Inhibitor transfizierten Zellen dramatisch erhöht wurde, verglichen mit der Kontrolle und unbehandelten Zellen. (Abb. 2C und D).

miR-410 direkt gezielte MDM2 in GC

Wie PicTar vorhergesagt, gab es die Komplementarität zwischen has-miR-410 und MDM2 3'-UTR (Abb 3A.). Um zu zeigen, dass miR-410 MDM2 direkt reguliert beschäftigten wir ein Dual-Luciferase-Reportersystem. Wir fanden, dass die Co-Expression von miR-410 signifikant die firely Luciferase-Reporter-Aktivität des Wildtyp-MDM2 3'UTR aber nicht die Mutante 3'UTR (Abb. 3B) unterdrückt. Die Überexpression von miR-410 reduziert die Expression von MDM2-mRNA und Protein (Abb. 3C und D).

Die Überexpression von MDM2 inpaired miR-410-induzierte Hemmung der Invasion in GC-Zellen

Wir führten Rettungsversuche durch Transfektion von 3'UTR-negativen MDM2 zusammen mit miR-410. Wie erwartet, Transfektion mit dem pcDNA3.1-MDM2 gelindert die Reduktion von MDM2 resultierte aus miR-410 mimischen Behandlung (Abb. 4A). Im Einvernehmen mit der Expression von Zielproteinen, Transfektion mit dem pcDNA3.1-MDM2 die Hemmung der Zell Verstärkung abgeschwächt (Abb. 4B) und die Zunahme von invasiven Zellen (Abb. 4C) resultiert aus miR-410 mimischen Behandlung.

wurde MDM2 invers mit miR-410 in GC

ausgedrückt weiter Um die Beziehung zwischen miR-410 und MDM2-Expression in Primärproben erläutern wir zunächst erkannt MDM2 in GC-Zelllinien. Wie in gezeigt. 5A und 5B, die mRNA und Proteinexpression von MDM2 war viel higer in den 4 GC-Zelllinien als die im GES. Wir fanden auch, dass die Expression von MDM2 in GC Geweben war signifikant höher als in den entsprechenden benachbarten normalen Geweben (Fig. 5C). Das Streudiagramm und die Pearson-Korrelationsanalyse zeigte ferner, dass miR-410 Expression negativ mit den Zielproteinspiegel in den GC-Proben (Abb. 5D) korreliert. Diese Daten legen nahe, dass die verringerte miR-410 Expression auf die erhöhten MDM2 Ebenen in der die meisten der GC-Patienten verwandt war.

Diskussion

miRNAs als wichtige Regulatoren der Genexpression bei der Post handelte -transcriptional Ebene und regulieren eine Vielzahl von physiologischen und Entwicklungsprozesse [6], [19], [20]. Befestigungs Beweise legen nahe, daß Veränderungen in der Expression von miRNAs zur Pathogenese der meisten menschlichen Krebserkrankungen beitragen, die sie entweder als Onkogene oder Tumorsuppressoren wirken kann [21], [22]. Vor kurzem zeigen Ansammeln Daten, dass miRNAs in mehrere wichtige biologische Ereignisse wie Tumorigenese und Krebsmetastasierung beteiligt sind [23], [24]. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die biologische Rolle von miR-410 in der menschlichen GC tumorigenesis. Unsere Ergebnisse zeigten, dass miR-410 häufig herunterreguliert war in der menschlichen GC und seine Herabregulierung war signifikant mit der klinischen Phase und Lymphknotenmetastasen assoziiert. Erzwungene Expression von miR-410 konnte die Proliferation, Migration und Invasion der GC-Zellen Linie in vitro zu erhöhen. Wir weiter identifiziert MDM2, ein mutmaßliches Tumorsuppressor-Gen, als direkte funktionelle Ziel von miR-410. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die Rolle der miR-410 in GC, und unsere Ergebnisse zeigen, zu erkunden, dass miR-410 als neues Onkogen in GC gehandelt.

Deregulation von miR-410 häufig ist Ereignis in verschiedenen Krebsarten, was nahe legt, dass miR-410 eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Tumorprogression spielt. Gattolliat und Kollegen zeigen, dass miR-410 Expression signifikant mit krankheitsfreie Überleben der nicht-verstärkten günstige Neuroblastom [16] verbunden war. Ferner Chen [17] festgestellt, dass miR-410 Expression in menschlichen Gliomen reduziert und gezwungen wurde, stark miR-410 Expression in Gliom-Zellen die Zellproliferation, die Invasion durch gezielte MET vermittelte gehemmt. Allerdings hat die Expression und Funktion von miR-410 in GC Entwicklung nicht berichtet. In dieser Studie identifizierten wir die Expression von miR-410 in mehrere GC-Zelllinien und der GES Verwendung qRT-PCR. Die Expression von miR-410 wurde in allen vier GC-Zelllinien im Vergleich mit der GES deutlich erhöht. Darüber hinaus bestätigte die Ergebnisse aus klinischen GC Gewebe erhalten auch, dass miR-410 wurde herunterreguliert in den GC-Gewebe im Vergleich zu den paarigen nicht kanzerösen benachbarte Gewebe, seine mögliche Beteiligung an den onkogene Transformation und Tumormetastasierung anzeigt. Wir bestätigten anschließend, dass die Hemmung der miR-410 signifikant GC Zell-Proliferation, Migration und Invasion in vitro gefördert.

Wir untersuchten weiter die molekularen Mechanismen, die Rolle der miR-410 und identifiziert MDM2 als direkte funktionelle Downstream-Ziel zugrunde liegenden miR-410 in den GC-Zellen. Bioinformatik Ansätze, die verwendet wurden, Ziele von miRNAs vorherzusagen, markiert einen hohen freien Energie Saatgut Spiel an der gut konservierte miRNA-Bindungsstelle und seine Ziel-mRNAs, sondern Spezifität blieb ein Problem in Ziele vieler miRNAs definieren. Somit Überexpression eines miRNA könnte herunterregulieren, die Expression des Zielproteins. Komplementäre Sequenz von miR-410 ist in der 3'-UTR von MDM2-mRNA identifiziert. Ferner haben wir gezeigt, dass miR-410 direkt die 3'UTR von MDM2 zielt, da ihre Überexpression mit der Unterdrückung der Luciferase-Aktivität assoziiert war. Darüber hinaus ist eine deutliche Herunterregulierung in der Höhe der MDM2-Protein wurde nach miR-410-Überexpression beobachtet, über Targeting seine 3'UTR posttranskritionelle Regulierung von MDM2 anzeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-410 als Tumorsuppressor wirken kann teilweise vermittelt durch reprimierenden miR-410 Expression in GC-Entwicklung.

MDM2 ist ein Onkogen, das zunächst in einem Locus auf double minute Chromosomen in einer tumorigenen amplifiziert wurde entdeckt Maus-Zelllinie (3T3-DM) [25]. Die Hauptfunktion von MDM2 ist p53-Bioaktivität zu inhibieren, indem die Transkriptionsaktivität von p53 blockiert und die Förderung der p53 Proteinabbau [26] - [28]. Hohe MDM2 Ebenen verringert p53-Proteinspiegel und kann die Funktion von p53 zu dämpfen, das Krebsrisiko erhöht und /oder beschleunigte Tumorbildung und Progression [29]. Die MDM2 Onkogen spielte eine wichtige Rolle bei der Krebsprogression [30]. Überexpression von MDM2 in Tumorzellen die Zellproliferation induziert, hemmt die Zellapoptose [31]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass MDM2-Überexpression mit einer schlechten Überleben und war ein nützliches prädiktiver Faktor für die schlechte Prognose bei Menschen mit hepatozellulärem Karzinom und Brustkarzinomen [32] verbunden war, [33]. Darüber hinaus haben die jüngste Studie ergab, dass MDM2 auf höheren Ebenen in GC Geweben exprimiert wurde als in Nicht-Krebs-Magenschleimhaut und MDM2-Expression wurde mit klinisch-pathologische Merkmale bei Patienten nur mit einer Operation behandelt assoziiert [34], [35]. Außerdem Zuschlags von MDM2 oder Überexpression von JWA hat den synergistischen Effekt auf die Unterdrückung der Magenkrebs-Zellproliferation und Migration [35]. Jedoch ist der Mechanismus, wie MDM2 war die Überexpression noch unbekannt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fähigkeit von miR-410 MDM2 Ziel bereitstellen kann ein solcher Mechanismus der posttranskriptionellen Kontrolle von MDM2.

Zusammenfassend Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass miR-410 war signifikant herunterreguliert in GC Zellen und Gewebe. Erzwungene Expression von miR-410 erhöhte GC Zell-Proliferation, Migration und Invasion durch MDM2 direkt Targeting. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese neuartige miR-410 /MDM2 Achse bietet neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Tumormetastasierung und Unterdrückung von miR-410 Expression kann in Zukunft eine mögliche therapeutische Strategie für die Behandlung von GC sein.

Grundinformationen
Tabelle S1.
Clinicopathologic charateristics von Patienten mit GC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s001
(DOCX)
Tabelle S2.
Primer-Sequenz
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

• PLoS ONE: Analyse der Lymphknotenmetastase Korrelation mit der Prognose bei Patienten mit T2 Magenkrebs
• PLoS ONE: Assoziation zwischen Milch Ansaug- und Magenkrebs: Eine Meta-Analyse von Beobachtungsstudien