PLoS ONE: mikroRNA-410 undertrykker migrasjon og invasjon av målretting MDM2 i Gastric Cancer

Abstract

Magekreft er en av de hyppigste kreftformen hos svulster i østasiatiske land. Identifisering av presise prognostiske markører og effektive terapeutiske mål er viktig ved behandling av magekreft. microRNAs (mirnas) spiller viktige roller i tumorigenesis. Men de mekanismer som mirnas regulerer magekreft metastaser forbli dårlig forstått. I denne studien, har vi funnet at nivåene av MIR-410 i magekreft og cellelinjer som var mye lavere enn i den normale kontroll, henholdsvis, og det lavere nivået av MIR-410 var signifikant assosiert med lymfeknute-metastaser. Transfeksjon av MIR-410 ligner kunne hemme celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i HGC-27 mage kreft cellelinjer. I kontrast, knockdown av MIR-410 hadde motsatt effekt på celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Videre fant vi også at MDM2 er negativt regulert av MIR-410 på post-transkripsjonsnivået, via et bestemt mål område med 3'UTR av luciferase reporter analysen. Ekspresjon av MDM2 er omvendt korrelert med MIR-410-ekspresjon i magekreft vev, og overekspresjon av MDM2 i MIR-410-transfiserte magecancerceller effektivt reddet inhibering av celleproliferasjon og invasjon forårsaket av MIR-410. Dermed våre funn antydet at MIR-410 fungerte som en ny svulst suppressor ved å målrette den MDM2 genet og hemme mage kreftceller spredning, migrasjon og invasjon. Funnene i denne studien har bidratt til dagens forståelse av disse funksjonene MIR-410 i magekreft

Citation. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) mikroRNA-410 undertrykker migrasjon og invasjon av målretting MDM2 i magekreft. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, USA

mottatt: 6 mai 2014; Godkjent: 09.07.2014; Publisert: 19 august 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Anhui Provincial Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Ulike strategier har blitt brukt til å behandle mage kreft (GC), som er den fjerde mest utbredte kreft og andre ledende årsak til kreft dødsfall i verden [1], [2]. De fleste GC pasienter diagnostisert ved stadium III eller IV, og frekvensen av lymfeknutemetastase er høy, [3], [4]. I dag, pasienter med sent stadium GC er med en samlet fem års overlevelse av appoximately 20% [5]. Derfor, er det av stor klinisk verdi for ytterligere å belyse de molekylære mekanismene som er involvert i GC metastaser og for å identifisere nye markører for diagnose, prognose og behandling av pasienter med GC.

microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA-er fra ~22 nukleotider i lengde som regulerer ekspresjonen av sine mål mRNA gjennom translasjonsbevegelse undertrykkelse eller mRNA spalting [6]. De er involvert i viktige biologiske prosesser, inkludert utvikling og differensiering [7], [8]. Den dysregulering av mirnas er korrelert for å spille en viktig rolle i kreftutvikling og progresjon ved å regulere celleproliferering, differensiering, apotosis og carcinogesis [9], [10]. Avvikende ekspresjon av mirnas eller mutasjoner av miRNA gener har blitt godt undersøkt i mange typer av tumorer, inkludert lymfom, lunge, bukspyttkjertel, leukemi, bryst-, tykktarm- og leverkreft [11] - [15]. Men rollene til mirnas i GC fortsatt i stor grad ukjent.

Tidligere studier har undersøkt hvilken rolle MIR-410 i flere kreftformer. Gattolliat et al [16] .demonstrated at ekspresjon av MIR-410 var signifikant assosiert med sykdomsfri overlevelse av den ikke-forsterkede gunstig neuroblastom. Videre, Chen ved el [17] funnet at ekspresjonen av MIR-410 ble redusert i humane gliomer og tvunget ekspresjon av MIR-410 i gliomceller sterkt hemmet celleproliferasjon, invasjon mediert ved å målrette MET. Videre Chien et al [18] fant at MIR-410 negativt regulert pRb /E2F sti ved direkte rettet mot CDK1 som var en onkogen i brystkreft. Men fortsatt gjenstår rollen MIR-410 i GC uklart. I denne studien demonstrerte vi at redusert MIR-410 uttrykk er en karakteristisk molekyl endring i GC og undersøkte effekten av modulerte MIR-410 nivåer på fenotypene av GC-cellelinjer. Vi viste også at MIR-410 kan fungere som et onkogen ved direkte rettet mot MDM2.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Alle disse pasientene ble enige om å delta i studien og ga skriftlig informert samtykke. Både denne studien og samtykke ble godkjent av den etiske styret i Anhui Provincial Hospital og etterleves Helsinkideklarasjonen.

humane prøver

Menneskelig GC og deres tilsvarende ikke-tumormageprøver ble innsamlet på tidspunktet for kirurgisk reseksjon fra Anhui Provincial Hospital fra 2008 til 2009. Skriftlig samtykke ble innhentet før samlingen. En del ble fiksert med 10% formalin for histopatologisk diagnose, og den andre ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -196 ° C i flytende nitrogen inntil RNA ble ekstrahert. Bruk av menneskelig vev ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for Anhui Provincial Hospital.

Cell kultur

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 og HEK293T cellene kjøpt fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences. Gastric epitelial-en celle (GES) ble hentet fra Shanghai Ruijin Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 og GES ble opprettholdt i RPMI1640 og HEK293T ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium medier. Mediet ble supplert med 10% føtalt bovint serum. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i et fuktet kammer som inneholdt 5% karbondioksyd.

Plasmider og celle transfeksjon

MiR-410 etterligne /hemmer og kontrollene ble anskaffet fra RiboBio (Guangzhou, Kina). De HGC-27-celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved 30% konfluens en dag før transfeksjon. Transfeksjon med MIR-410 etterligne /hemmer eller kontrollene ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfeksjon komplekser ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner.

QRT-PCR

For QRT-PCR-analyser, ble totalt RNA ekstrahert fra celler med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transkripsjon ble utført med PrimeScript RT reagent Kit med gDNA viskelær (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. Uttrykket av MIR-410 ble bekreftet av endret stemloop RT-PCR med spesifikke RT og PCR-primere. U6 snRNA ble anvendt som en endogen kontroll. RT reaksjoner ble utført ved hjelp av RNA brøkdel med Promega RT Kit følge produsentens protokoll. PCR-betingelsene ble utført ved denaturering av DNA ved 94 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med amplifikasjon: 94 ° C i 40 s, 52 ° C i 40 s, 72 ° C i 40 s for datainnsamlingen. Kvantitativ PCR ble utført på en ABI 7500 termo (Applied Biosystems) med SYBR Premiks Ex Taq (Perfect Real Time) Kits (Takara, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner.

Cell Proliferation Assay

totalt 10 ^{4 celler pr brønn ble sådd ut i 96-brønners plater før transfeksjon og dyrket i 24 timer i normale forhold. De ble deretter transfektert med Mir-410 etterligne eller anti-MIR-410-hemmer sammen med sammenkoblede negative kontroller. Celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av celletelling Kit 8 (Dojindo, Tokyo, Japan) i henhold til produsentens protokoll.}

Cell migrasjon og invasjon analysen

For migrasjonsanalyser, 5 × 10 ^{4-celler ble tilsatt til det øvre kammer av innsatsen (BD Bioscience, 8-um porestørrelse). For invasjonen analysene, 1 × 10 5 celler ble lagt inn i det øvre kammer av innsatsen-belagt med Matrigel (BD Biovitenskap). I begge analysene ble celler sådd ut i medium uten serum, og medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kjemotiltrekkende. Etter flere timers inkubering ble cellene som ikke migrerer eller invaderer gjennom porene forsiktig tørkes ut med vatt. Så innsatsene ble farget med 20% metanol og 0,2% krystallfiolett, fotografert, og regnet med en IX71 invertert mikroskop (Olympus).}

Western blot analyse

Proteiner ble separert på SDS-polyakrylamid gel elektroforese og overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranen ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk og inkubert med kanin anti-MDM2 monoklonalt antistoff (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og muse anti-b-GAPDH monoklonalt antistoff (1:10000; Sigma). Proteinene ble oppdaget med forbedrede Chemiluminescence reagenser (Pierce, Rockford, IL, USA).

Luciferase reporter analysen

HEK293T celler ble sådd ut i 96-brønners plater. Etter 24-h inkubasjon, en blanding av 100 ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negativ kontroll, MIR-410 ligne ble transfektert med 20 ng.

Renilla inn HEK293T celler ved hjelp Lipofectamine 2000. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ildflue og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt med Dual-luciferaserapportørplasmid System (Promega, Madison, WI, USA). Transfeksjonseffektiviteten ble normalisert ved kotransfeksjon med en Renilla reporter vektor.

Statistisk analyse

Data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik på minst tre eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 15.0. En en-veis analyse av varians (ANOVA) test og Student 's t-test ble anvendt for statistisk analyse. En verdi på p. ≪ 0,05 ble ansett for å indikere en statistisk analyse

Resultat

Uttrykk av MIR-410 var signifikant nedregulert i GC celler og vev

For å vurdere rollen til mir-410 i GC, evaluerte vi ekspresjonen av MIR-410 i GC-cellelinje, vev og deres matchede normale vev ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Vi fant at MIR-410 nivåer var ofte nedregulert i GC-cellelinjer sammenlignet med GES. Figur 1B viser at MIR-410 nivåer ble nedregulert i GC vev sammenlignet med dem i matchet normalt vev. Den gjennomsnittlige Ekspresjonsnivået i carcinoma vev (kombinasjon) var signifikant høyere sammenlignet med deres tilstøtende ikke-neoplastiske vev (figur 1C). Vi har også vist at ekspresjon av MIR-410 i metastasene GC vevet var lavere enn i ikke-metastaser vev (Fig. 1D).

MIR-410 inhiberte GC celle proliferasjon, migrering og invasjon

nivåene av MIR-410 ble betydelig økt i GC celler som ble transfektert med Mir-410 etterligner og Mir-410 nivåer ble redusert som ble behandlet med MIR-410 inhibitor (fig. 2A). Oppregulering av MIR-410 inhiberte GC celleproliferasjon; i motsetning til dette knockdown av MIR-410 hadde motsatt effekt på celleproliferasjon (fig. 2B). Videre er transwell analysen og invasjon analyse viste at den migrerte og invasivitet av celler transfektert med MIR-410 etterligner ble dramatisk redusert sammenlignet med kontrollen og ubehandlede celler. Vi viste også at den overførte og invasivitet av celler transfektert med MIR-410-inhibitor ble dramatisk øket sammenlignet med kontrollen og ubehandlede celler. (Fig. 2C og D).

MIR-410 direkte rettet MDM2 i GC

Som spådd av PicTar, var det komplementaritet mellom har-MIR-410 og MDM2 3'-UTR (Fig . 3A). For å demonstrere at MIR-410 direkte regulerer MDM2, ansatt vi en dual-luciferase reporter system. Vi har funnet at ko-ekspresjon av MIR-410 i betydelig grad undertrykkes den firely luciferase reporter aktivitet av villtype-MDM2 3'UTR, men ikke den mutante 3'UTR (Fig. 3B). Overekspresjon av MIR-410 redusert uttrykk for MDM2 mRNA og protein (Fig. 3 C og D).

Overuttrykte MDM2 inpaired MIR-410-indusert hemming av invasjonen i GC celler

Vi utførte redningsforsøk etter transfeksjon av 3'UTR-negative MDM2 sammen med MIR-410. Som forventet, transfeksjon med den pcDNA3.1-MDM2 lette reduksjon av MDM2 resulterte fra MIR-410 etterligne behandling (Fig. 4A). Etter avtale med uttrykket av target proteiner, transfeksjon med pcDNA3.1-MDM2 dempet hemming av celle forsterkning (Fig. 4B) og økningen av invasive celler (fig. 4C) resulterte fra Mir-410 etterligne behandling.

MDM2 ble omvendt uttrykt med MIR-410 i GC

For ytterligere å belyse forholdet mellom MIR-410 og MDM2 uttrykk i primærprøver, vi først oppdaget MDM2 i GC cellelinjer. Som vist på fig. 5A og 5B, mRNA og protein ekspresjon av MDM2 var mye higer i de fire GC cellelinjer enn det som i GES. Vi fant også at uttrykket av MDM2 i GC vev var betydelig høyere enn i tilsvarende nærliggende normalt vev (Fig. 5C). Den spredningsdiagram og Pearson korrelasjonsanalyse viste videre at MIR-410 ekspresjon var negativt korrelert med target proteinnivåene i GC prøvene (fig. 5D). Disse data antydet at redusert Mir-410 uttrykk var knyttet til den økte MDM2 nivå i de fleste av GC pasientene.

Diskusjoner

mirnas har fungert som viktige regulatorer av genuttrykk på innlegget -transcriptional nivå og regulere et vidt spekter av fysiologiske og utviklingsprosesser [6], [19], [20]. Monterings bevis tyder på at endringer i ekspresjonen av mirnas bidra til patogenesen av de humane kreftformer, som de kan virke som enten onkogener eller tumor-suppressorer [21], [22]. Nylig, samler data indikerer at mirnas er involvert i flere viktige biologiske hendelser som tumorigenesis og kreft metastase [23], [24]. I denne studien undersøkte vi den biologiske rollen MIR-410 i menneskelig GC tumorigenesis. Våre resultater viser at MIR-410 var ofte nedregulert i menneskelig GC og at nedregule var signifikant assosiert med klinisk stadium og lymfeknutemetastase. Tvangs uttrykk for MIR-410 kan øke spredning, migrasjon og invasjon av GC celler linjen in vitro. Vi videre identifisert MDM2, en antatt tumor suppressor genet, som en direkte funksjonell mål av MIR-410. Så vidt vi vet, er dette den første studien som undersøke hvilken rolle MIR-410 i GC, og våre resultater indikerte at MIR-410 fungerte som en ny onkogen i GC.

Deregulering av MIR-410 er en hyppig arrangementet i forskjellige kreftformer, noe som tyder på at MIR-410 kan spille en viktig rolle i tumorigenese og tumorprogresjon. Gattolliat og medarbeidere viser at MIR-410-ekspresjon ble signifikant assosiert med sykdomsfri overlevelse av den ikke-forsterkede gunstig neuroblastom [16]. Videre Chen [17] fant at Mir-410 uttrykk ble redusert i menneskelige hjernesvulst og tvunget Mir-410 uttrykk i glioma celler sterkt hemmet celledeling, invasjon mediert ved å målrette MET. Imidlertid har uttrykket og funksjon av MIR-410 i GC utvikling ikke blitt rapportert. I denne studien, identifiserte vi ekspresjonen av MIR-410 i flere GC cellelinjer og GES ved hjelp QRT-PCR. Uttrykket av MIR-410 ble betydelig økt i alle fire GC cellelinjer sammenlignet med i GES. Videre er de resultater som ble oppnådd fra kliniske GC vev også bekreftet at MIR-410 ble nedregulert i GC vev sammenlignet med de sammenkoblede ikke-kreft tilstøtende vev, noe som indikerer en mulig involvering i både onkogen transformasjon og tumormetastase. Vi har senere bekreftet at hemming av MIR-410 betydelig forfremmet GC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon in vitro.

Vi har utforsket ytterligere molekylære mekanismen bak rollen MIR-410 og identifisert MDM2 som en direkte funksjonell nedstrøms målet MIR-410 i GC celler. Bioinformatikk tilnærminger, som ble brukt til å forutsi mål av mirnas, fremhevet en høy fritt energi frø kamp på godt bevart miRNA-bindende nettstedet og dets mål mRNA, men spesifisiteten forble et problem i å definere mål for mange miRNAs. Således, over-ekspresjon av en miRNA kunne nedregulerer ekspresjon av målproteinet. Komplementære sekvens av MIR-410 er identifisert i 3'UTR av MDM2 mRNA. Videre viste vi at MIR-410 direkte rettet mot 3'UTR av MDM2, som sin overuttrykk var forbundet med undertrykkelse av luciferase aktivitet. I tillegg ble en betydelig nedregulering i nivået av MDM2 protein observert etter MIR-410 overekspresjon, noe som indikerer posttranskripsjonelt regulering av MDM2 via målrette sin 3'UTR. Resultatene indikerte at MIR-410 kan fungere som en tumor suppressor delvis mediert av undertrykke Mir-410 uttrykk i GC utvikling.

MDM2 er et onkogen som ble først oppdaget i et locus forsterket på dobbel minutt kromosomer i tumorigent cellelinje mus (3T3-DM) [25]. Den viktigste funksjonen til MDM2 er å inhibere p53 bioaktivitet ved å blokkere den transkripsjonelle aktivitet av p53 og p53-protein fremmer degradering [26] - [28]. Høye MDM2 nivåer redusert p53 protein nivåer og kan dempe p53-funksjon, som økt kreftrisiko og /eller akselerert tumordannelse og progresjon [29]. Den MDM2 onkogen spilt en viktig rolle i kreft progresjon [30]. Overekspresjon av MDM2 i tumorceller indusert celleproliferasjon, inhiberer celle apoptose [31]. Flere studier har vist at MDM2 overekspresjon var assosiert med dårlig overlevelse og var en nyttig prediktiv faktor for dårlig prognose hos mennesker med leverkreft og brystcarsinomer [32], [33]. Dessuten har den fersk studie fant at MDM2 ble uttrykt på et høyere nivå i GC vev enn i ikke-kreft mageslimhinnen, og MDM2 uttrykk var assosiert med clinicopathologic funksjoner hos pasienter behandlet bare med kirurgi [34], [35]. Videre knockdown av MDM2 eller overekspresjon av JWA har synergistisk effekt på undertrykkelse av magekreft celleproliferasjon og migrasjon [35]. Men mekanismen hvordan MDM2 var overekspresjon er fortsatt ukjent. Disse resultatene indikerer at evnen til MIR-410 for å målrette MDM2 kan tilveiebringe en slik mekanisme av post-transkripsjonen kontroll av MDM2.

Oppsummert har våre resultater viste at MIR-410 var signifikant nedregulert i GC celler og vev. Tvangs uttrykk for MIR-410 økt GC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon gjennom direkte rettet mot MDM2. Disse funnene tyder på at denne romanen MIR-410 /MDM2 akse gir ny innsikt i mekanismene bak tumormetastase, og undertrykkelse av Mir-410 uttrykk kan være en potensiell terapeutisk strategi for behandling av GC i fremtiden.

støtte Informasjon
Tabell S1.
Clinicopathologic charateristics av ​​pasienter med GC
Doi. 10,1371 /journal.pone.0104510.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
Primer sekvens
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002 plakater (docx)

• PLoS ONE: Analyse av lymfeknutemetastase Sammenheng med Prognose hos pasienter med T2 Gastric Cancer
• PLoS ONE: Sammenhengen mellom Dairy Intake og Gastric Cancer: En meta-analyse av observasjonsstudier