PLoS ONE: микроРНК-410 Подавляет Миграция и Вторжение Ориентация MDM2 в рака желудка

Абстрактный
<р> Рак желудка является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей в опухолях в странах Восточной Азии. Определение точных прогностических маркеров и эффективных терапевтических целей имеет важное значение при лечении рака желудка. микроРНК (микроРНК) играют важную роль в онкогенеза. Однако механизмы, с помощью которых микроРНК регулируют желудочную метастазирования рака остаются плохо изучены. В этом исследовании мы обнаружили, что уровни микроРНК-410 в рака желудка и клеточных линий были намного ниже, чем в обычном контроле, соответственно, и более низкий уровень микроРНК-410 был в значительной степени связано с лимфатического узла метастазов. Трансфекция микроРНК-410 имитаторов может значительно ингибировать клеточную пролиферацию, миграцию и вторжение в желудочном линиях раковых клеток ТЖК-27. В противоположность этому, нокдаун микроРНК-410 имели противоположный эффект на клеточную пролиферацию, миграцию и инвазии. Кроме того, мы также обнаружили, что MDM2 отрицательно регулируется микроРНК-410 на пост-транскрипционном уровне, с помощью конкретного целевого сайта с помощью 3'UTR люциферазы репортера. Выражение MDM2 обратно коррелирует с экспрессией микроРНК-410 в желудочном раковых тканей, а избыточная экспрессия MDM2 в микроРНК-410-трансфецированных клеток рака желудка эффективно спасло ингибирование пролиферации клеток и инвазии, вызванной MIR-410. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-410 действовал в качестве нового опухолевого супрессора путем воздействия на ген MDM2 и ингибирования клеток рака желудка пролиферацию, миграцию и инвазию. Результаты этого исследования способствовали современному пониманию этих функций микроРНК-410 при раке желудка
<р> Образец цитирования:. Shen J, Ню W, Чжоу М, Чжан H, J Ма, Ван L, и др. (2014) микроРНК-410 Подавляет Миграция и Вторжение Ориентация MDM2 в рака желудка. PLoS ONE 9 (8): e104510. DOI: 10.1371 /journal.pone.0104510
<р> Редактор: Джин Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center &Amp; Научно-исследовательский институт, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 6 мая 2014 года; Принято 9 июля, 2014 года; Опубликовано: 19 августа 2014
<р> Copyright: © 2014 Shen и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Аньхой Провинциальный фонд естественных наук (. НЕТ 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Различные стратегии были использованы для лечения рака желудка (GC), который является четвертым самым распространенным раком и второй ведущей причиной смертельных случаев рака в [1] мира, [2]. Большинство пациентов GC диагностируется на стадии III или IV, и скорость метастазов в лимфатических узлах высока [3], [4]. В настоящее время, у пациентов с поздней стадией GC являются выживанием общей 5-летней о appoximately 20% [5]. Для этого, он имеет большое клиническое значение для дальнейшего выяснения молекулярных механизмов, участвующих в GC метастазирования и идентифицировать новые маркеры для диагностики, прогнозирования и лечения больных с GC.

микроРНК (миРНК) являются небольшими некодирующей РНК из ~22 нуклеотидов в длину, которые регулируют экспрессию их мРНК мишеней через трансляционной репрессии или мРНК расщепления [6]. Они участвуют в важных биологических процессах, в том числе развития и дифференциации [7], [8]. Дисрегуляция микроРНК коррелируется играть важную роль в развитии рака и прогрессии путем регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза carcinogesis [9], [10]. Аномальная экспрессия микроРНК или мутации генов микроРНК были хорошо изучены во многих типах опухолей, включая лимфомы, легких, поджелудочной железы, лейкемии, рака молочной железы, толстой кишки и рака печени [11] - [15]. Тем не менее, роль микроРНК в GC остаются неизвестными.
<Р> Предыдущие исследования исследовали роль микроРНК-410 в нескольких видов рака. Gattolliat и др [16] .demonstrated, что экспрессия микроРНК-410 был в значительной степени связано с заболеванием свободного выживания без амплификации благоприятной нейробластомы. Кроме того, Чэнь в эль [17] обнаружили, что экспрессия микроРНК-410 была снижена в человеческих глиом и заставил экспрессию микроРНК-410 в клетках глиомы сильно тормозил пролиферацию клеток, инвазию, опосредованной ориентации MET. Кроме того, Chien и др [18] обнаружили, что микроРНК-410 негативно регулируется PRB /E2F путь непосредственно ориентации CDK1 который был онкоген при раке молочной железы. Тем не менее, роль микроРНК-410 в GC до сих пор остается неясным. В этом исследовании мы показали, что снижение экспрессии микроРНК-410 является характеристикой молекулярного изменения в GC и исследовали влияние модулированных уровней микроРНК-410 на фенотип GC клеточных линий. Мы также показали, что микроРНК-410 может работать как онкоген путем непосредственного таргетинга MDM2.

Материалы и методы

Заявление по этике
<р> Все эти пациенты дали согласие на участие в исследовании и дали письменное информированное согласие. И это исследование и согласие были одобрены этическим советом больнице провинции Аньхой и выполнил Хельсинской декларацией.

Человеческие образцы
<р> Человеческие GC и соответствующие им неопухолевой желудка образцы были собраны во время хирургической резекции из провинциальной больницы Аньхой с 2008 по 2009 г. Письменное информированное согласие было получено до сбора. Одна часть фиксировали 10% -ным формалином для гистопатологического диагноза, а другой был немедленно мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -196 ° С в жидком азоте до тех пор, пока РНК экстрагировали. Использование тканей человека был утвержден клинический исследовательский комитет по этике Аньхой провинциальной больницы путем.

клеточной культуре
<р> SGC-7901, ГГК-27, MGC-803, MKN-45 и HEK293T клетки приобретены у Шанхайского института биохимии и клеточной биологии при китайской академии наук. Желудочный эпителиально-1 клеток (GES) была получена из Шанхая Жуйцзинь больницы Шанхайский школы медицины университета. SGC-7901, ГГК-27, MGC-803, MKN-45 и ГЭС поддерживали в RPMI1640 и HEK293T поддерживали в модифицированной среде Игла СМИ Дульбекко. Носитель информации с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки инкубировали при 37 ° С в увлажненной камере, содержащей 5% двуокиси углерода.

плазмид и трансфекции клеток
<р> MIR-410 мимических /ингибитор и контроль были приобретены у RiboBio (Гуанчжоу, Китай). Клетки ТЖК-27 высевали в шесть-луночные планшеты в количестве 30% монослоя за один день до трансфекции. Трансфекция с микроРНК-410 мимической /или ингибитора управления проводили с использованием Липофектамин 2000 реагента (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Трансфекция комплексы были получены в соответствии с инструкциями изготовителя.

QRT-PCR
<р> Для анализов QRT-PCR, суммарную РНК экстрагировали из клеток с TRIzol реагента (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Обратную транскрипцию проводили с помощью набора реагентов PrimeScript RT с гДНК ластика (Takara) в соответствии с инструкциями изготовителя. Экспрессия микроРНК-410 был проверен измененном stemloop RT-PCR с конкретными RT и ПЦР-праймеров. U6 мяРНК был использован в качестве эндогенного контроля. Реакции RT проводили с помощью РНК-фракции с Kit Promega RT в соответствии с протоколом производителя. Условия ПЦР проводили с помощью денатурации ДНК при 94 ° С в течение 4 мин, затем 40 циклов амплификации: 94 ° С в течение 40 сек, 52 ° С в течение 40 сек, 72 ° С в течение 40 с для сбора данных. Количественная ПЦР проводили на ABI 7500 амплификатор (Applied Biosystems) с использованием SYBR премикса Ex Taq (Perfect реального времени) Комплекты (Takara, Japan) в соответствии с инструкциями изготовителя.

пролиферации клеток Анализ
<р> в общей сложности 10 4 клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты перед трансфекцией и культивировали в течение 24 ч в нормальных условиях. Затем они были трансфицированы микроРНК-410 имитируют или анти-микроРНК-410 ингибитора наряду с парными отрицательных контролей. пролиферации клеток оценивали с использованием набора клеток счетная 8 (Dojindo, Токио, Япония) в соответствии с протоколом производителя.

Миграция клеток и инвазию анализ
<р> Для миграции анализов, 5 × 10 ^{4 клеток добавляли в верхнюю камеру вставки (BD Bioscience, 8 мкм, размер пор). Для вторжения анализов, 1 × 10 5 клеток добавляли в верхнюю камеру вставки с Матригель предварительно покрытой (BD Bioscience). В обоих анализах, клетки высевали в среде без сыворотки, и среды, содержащей 10% FBS, в нижней камере служил хемоаттрактанту. После нескольких часов инкубации клетки, которые не мигрируют или вторгаться через поры были тщательно уничтожены ватой. Затем вставки окрашивали 20% метанола и 0,2% кристаллическим фиолетовым, в образ, и подсчитывают с IX71 инвертированный микроскоп (Olympus).}

Вестерн-блот-анализ
<р> Белки разделяли на SDS-полиакриламидном геле гель-электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA, США). Мембрану блокировали 5% молока обезжиренного и инкубировали с кроличьим антителом против MDM2 моноклональное антитело (1:1000; Cell Signaling Technology, Дэнверз, Массачусетс, США) и мышиное анти-B-GAPDH-моноклональное антитело (1:10000; Сигма). Белки были обнаружены с усиленной хемилюминесценции реагентов (Pierce, Rockford, IL, США).

люциферазы анализ
<р> HEK293T клетки высевали в 96-луночные планшеты. После 24-часовой инкубации, смесь 100-нг pLUC 3'UTR, 5-пмоль отрицательный контроль, микроРНК-410 имитируют был котрансфицируют с 20 нг.
<Р> Renilla в HEK293T клеток с использованием Липофектамина 2000. Сорок восемь часов после трансфекции, светлячка и люциферазные деятельность Renilla были измерены с помощью двойного люциферазы системы репортер (Promega, Madison, WI, USA). Эффективность трансфекции была нормирована котрансфекции с репортером вектором Renilla.

Статистический анализ
<р> Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение при наименьших трех экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS 15.0. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) испытания и критерия Стьюдента использовались для статистического анализа. Значение р &ЛТ;. 0,05 рассматривалось как указать статистический анализ

Результат

Выражение микроРНК-410 был значительно понижающей регуляции в GC клетки и ткани
<р> Для оценки роль микроРНК-410 в GC, мы оценивали экспрессию микроРНК-410 в GC-клеточной линии, ткани и их соответствием нормальных тканей с использованием количественной оТ-ПЦР. Мы обнаружили, что уровни микроРНК-410 были часто вниз регулируется в линиях GC клеток по сравнению с GES. Фигура 1В показывает, что уровни микроРНК-410 были вниз регулируется в GC тканях по сравнению с теми, в согласованных нормальных тканях. Средний уровень экспрессии в тканях карциномы (комбинация) была значительно выше по сравнению с прилегающими к ним неопухолевых тканей (рис 1C). Мы также показали, что экспрессия микроРНК-410 в тканях Метастазы GC была ниже, чем в не метастазах тканях (рис. 1D).

микроРНК-410 ингибирует пролиферацию клеток GC, миграция и вторжение
<р> уровни MIR-410 были значительно увеличены в GC клетки, которые были трансфицированных микроРНК-410 мимике и уровни микроРНК-410 были снижены, обработанных ингибитором микроРНК-410 (рис. 2А). Повышающей регуляции пролиферации микроРНК-410 тормозится GC клеток; в противоположность этому, нокдаун микроРНК-410 имели противоположный эффект на пролиферацию клеток (рис. 2В). Кроме того, анализ Transwell и инвазия анализ показал, что перенесенный и инвазивности клеток, трансфецированных с микроРНК-410 мимике резко снизилась по сравнению с контролем и необработанными клетками. Мы также показали, что перенесенный и инвазивность клеток, трансфецированных с ингибитором микроРНК-410 резко возросла по сравнению с контролем и необработанными клетками. (Рис. 2С и D).

микроРНК-410 непосредственно целевой MDM2 в GC
<р> Как и предсказывали PicTar, существует взаимодополняемость HAS-MIR-410 и MDM2 3'-UTR (рис . 3А). Для того, чтобы продемонстрировать, что микроРНК-410 непосредственно регулирует MDM2, мы использовали систему репортер двойного люциферазы. Мы обнаружили, что совместная экспрессия микроРНК-410 значительно подавляли firely люциферазы активности дикого типа MDM2 3'UTR, но не мутант 3'-UTR (рис. 3б). Избыточная экспрессия микроРНК-410 снижала экспрессию мРНК и белка MDM2 (рис. 3C и D).

Сверхэкспрессия MDM2 inpaired микроРНК-410-индуцированное ингибирование вторжения в GC клетки
<р> Мы выполнили спасательные эксперименты по трансфекции 3'UTR-отрицательной MDM2 вместе с микроРНК-410. Как и ожидалось, трансфекция с pcDNA3.1-MDM2 облегчены снижение MDM2 в результате микроРНК-410 имитируют обработки (рис. 4А). В соответствии с выражением белков-мишеней, трансфекцию с pcDNA3.1-MDM2 смягчены ингибирование амплификации клеток (рис. 4, б) и увеличение инвазивных клеток (рис. 4C) в результате микроРНК-410 мимической лечения.

MDM2 была обратно выражена MIR-410 в GC

Для дальнейшего выяснения отношений между микроРНК-410 и экспрессии MDM2 в первичных образцах, мы, во-первых обнаруженных MDM2 в линиях GC клеток. Как показано на рис. 5А и 5В, мРНК и экспрессии белка MDM2 было много Higer в клеточных линиях 4 GC, чем в GES. Мы также обнаружили, что экспрессия MDM2 в дс тканей была значительной выше, чем в соответствующих соседних нормальных тканей (рис. 5в). График рассеяния и корреляционный анализ Пирсона далее показали, что экспрессия микроРНК-410 отрицательно коррелировал с уровнями белка-мишени в образцах GC (рис. 5D). Эти данные свидетельствуют о том, что снижение экспрессии микроРНК-410 было связано с повышением уровня MDM2 в большинстве больных ГЦ.

Обсуждение
<р> микроРНК выступали в качестве важных регуляторов экспрессии генов на пост -transcriptional уровень и регулируют широкий спектр физиологических процессов и развития [6], [19], [20]. Монтажные доказательства позволяют предположить, что изменения в экспрессии микроРНК внести свой вклад в патогенезе наиболее злокачественных опухолей человека, которые они могут выступать в роли онкогенов или супрессоров опухолей [21], [22]. В последнее время, накапливающиеся данные указывают на то, что микроРНК участвуют в ряде важных биологических событий, таких как онкогенеза и метастазирования рака [23], [24]. В настоящем исследовании мы исследовали биологическую роль микроРНК-410 в GC онкогенеза человека. Наши результаты показали, что микроРНК-410 был часто вниз регулируется в человеческом GC и что его понижающая регуляция была в значительной степени связано с клинической стадией и метастазов в лимфатических узлах. Принудительная экспрессия микроРНК-410 может привести к увеличению пролиферации, миграции и инвазии линии GC клеток в пробирке. Кроме того, мы определили MDM2, предполагаемый ген-супрессор опухолей, как прямой функциональной мишени микроРНК-410. Насколько нам известно, это первое исследование с целью изучения роли микроРНК-410 в GC, и наши результаты показали, что микроРНК-410 действовал как новый онкоген в GC.
<Р> Дерегуляция MIR-410 является частым событие в различных видов рака, предполагая, что микроРНК-410 может играть важную роль в онкогенеза и опухолевой прогрессии. Gattolliat и его коллеги показали, что экспрессия микроРНК-410 был в значительной степени связано с заболеванием свободного выживания без амплификации благоприятной нейробластомы [16]. Кроме того, Чен [17] обнаружили, что экспрессия микроРНК-410 была снижена в человеческих глиом и заставил экспрессию микроРНК-410 в клетках глиомы сильно тормозил пролиферацию клеток, инвазию, опосредованной ориентации MET. Тем не менее, не было сообщено выражение и функции микроРНК-410 в развитии GC. В данном исследовании мы определили экспрессию микроРНК-410 в нескольких GC клеточных линий и GES с использованием QRT-PCR. Экспрессия микроРНК-410 была значительно увеличена во всех линиях четырех GC клеток по сравнению с в GES. Кроме того, результаты, полученные из клинической ГХ ткани также подтвердили, что микроРНК-410 подавлялась в ГЦ тканях по сравнению с парными незлокачественных прилегающих тканей, что указывает на его возможное участие в обоих опухолевой трансформации и метастазирования опухолей. Впоследствии мы подтвердили, что ингибирование микроРНК-410 значительно способствовало GC пролиферации клеток, миграцию и инвазию в лабораторных условиях.
<р> Кроме того, мы исследовали молекулярный механизм, лежащий в основе роли микроРНК-410 и определил MDM2 как прямой функциональной вниз по течению цели микроРНК-410 в GC клетки. Биоинформатика подходы, которые были использованы для прогнозирования целей микроРНК, выделены высокий матч семян свободной энергии в хорошо сохранившемся микроРНК-связывающего сайта и его мРНК мишеней, но специфичность оставалась проблемой при определении целей многих микроРНК. Таким образом, избыточная экспрессия микроРНК может вниз регулировать экспрессию белка-мишени. Дополнительной последовательность микроРНК-410 идентифицируется в 3'UTR мРНК MDM2. Кроме того, мы показали, что микроРНК-410 непосредственно нацелен на 3'UTR из MDM2, а его избыточная экспрессия была связана с подавлением активности люциферазы. Кроме того, наблюдалось значительное понижающая регуляция на уровне белка MDM2 после микроРНК-410 избыточной экспрессии, что указывает на посттранскрипционная регулирование MDM2 через нацеливание его 3'UTR. Эти результаты показали, что микроРНК-410 может функционировать как опухолевый супрессор частично опосредованы подавляя экспрессию микроРНК-410 в развитии GC.
<Р> MDM2 является онкоген, который был впервые обнаружен в локусе усиливается на двойных минутными хромосом в опухолеобразования клеточная линия мыши (3Т3-DM) [25]. Основной функцией MDM2 является ингибирование р53 биоактивности путем блокирования транскрипционной активности р53 и способствовать дальнейшей деградации белка p53 [26] - [28]. Высокие уровни MDM2 пониженные уровни белка р53 и может ослабить функцию p53, что повышенный риск развития рака и /или образование ускоренную и прогрессии опухоли [29]. Онкоген MDM2 играет важную роль в прогрессировании рака [30]. Сверхэкспрессия MDM2 в опухолевых клетках, индуцированных пролиферации клеток, ингибирует апоптоз клеток [31]. Несколько исследований показали, что избыточная экспрессия MDM2 была связана с плохой выживаемостью и является полезным прогностическим фактором для неблагоприятного прогноза у людей с гепатоцеллюлярной карциномой и карциномы молочной железы [32], [33]. Кроме того, недавнее исследование, обнаружили, что было выражено MDM2 на более высоких уровнях в GC тканях, чем в нераковая слизистую оболочку желудка, и экспрессия MDM2 была связана с особенностями клиникопатологическими у пациентов, получавших только хирургическим путем [34], [35]. Более того, нокдаун MDM2 или избыточная экспрессия JWA имеет синергетический эффект на подавление желудочной пролиферации раковых клеток и миграции [35]. Тем не менее, механизм, как MDM2 была избыточная экспрессия до сих пор неизвестна. Эти результаты показали, что способность MIR-410 целевой MDM2 может обеспечить один такой механизм пост-транскрипционным контролем MDM2.
<Р> Таким образом, полученные нами результаты показали, что микроРНК-410 был значительно понижающей регуляции в GC клеток и тканей. Принудительная экспрессия микроРНК-410 повышенной пролиферации клеток GC, миграции и вторжения через направленные непосредственно против MDM2. Эти данные позволяют предположить, что этот роман микроРНК-410 Ось /MDM2 обеспечивает новое понимание механизмов, лежащих метастазирования опухоли, и подавление экспрессии микроРНК-410 может быть потенциальной терапевтической стратегией для лечения GC в будущем.

поддержка Информация
Таблица S1.
клиникопатологическими Charateristics больных с GC
DOI: 10.1371. /journal.pone.0104510.s001
(DOCX)
Таблица S2.
праймерПоследовательность
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

• PLoS ONE: Анализ метастазов в лимфатических узлах Корреляция с прогнозом у пациентов с Т2 рака желудка
• PLoS ONE: Ассоциация между Dairy Впускной и рака желудка: Мета-анализ обсервационных Studies