PLoS ONE: MicroRNA-410 vaimentaa Migration ja Invasion kohdistaminen MDM2 mahasyövän

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten Itä-Aasian maissa. Tunnistaminen tarkka ennustetekijöitä markkereita ja tehokas terapeuttinen tavoitteet on tärkeä hoidossa mahasyövän. MikroRNA (miRNA) tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Kuitenkin mekanismit, joilla miRNA säätelevät mahasyövän etäpesäkkeiden jäävät huonosti. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että tasot miR-410 mahasyövän ja solulinjat olivat paljon alhaisempi kuin normaalissa ohjaus, vastaavasti, ja alemman tason miR-410 oli merkitsevästi yhteydessä imusolmukkeiden etäpesäke. Transfektio miR-410 matkii voisi merkittävästi estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion in HGC-27 mahasyövässä solulinjoissa. Sen sijaan knockdovvn miR-410 oli päinvastainen vaikutus soluproliferaatioon, muuttoliike ja hyökkäystä. Lisäksi olemme myös havainneet, että MDM2 negatiivisesti säännellään miR-410 at transkription jälkeisellä tasolla, kautta erityinen tavoite sivuston 3'UTR lusiferaasin reportterianalyysi. Ilmentyminen MDM2 on korreloi käänteisesti miR-410 ilmentymisen mahasyövässä kudoksissa, ja yli-ilmentyminen MDM2 in miR-410-transfektoitujen mahasyövän soluja tehokkaasti pelasti soluproliferaation inhibointi ja invaasion aiheuttama miR-410. Täten havaintomme ehdotti, että miR-410 toiminut uusi kasvain vaimennin kohdistamalla MDM2-geenin ja estämällä mahalaukun syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota. Havainnot Tämän tutkimuksen vaikuttaneet nykyiseen käsitys näiden toimintojen miR-410 mahasyövän.

Citation: Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 vaimentaa Migration ja Invasion kohdistaminen MDM2 mahasyövän. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 toukokuu 2014; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2014; Julkaistu: 19 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Anhui Provincial Natural Science Foundation (NO. 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Erilaisia ​​strategioita on käytetty hoitoon mahalaukun syöpä (GC), joka on neljäs yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään kuolleiden maailmassa [1], [2]. Useimmat GC potilaat diagnosoidaan vaiheessa III tai IV, ja määrä imusolmuke etäpesäke on korkea [3], [4]. Nykyään potilaat kanssa myöhäisvaiheen GC ovat kokonaispituudeltaan 5 vuoden selviytymisen appoximately 20% [5]. Sentähden, se on suuri kliininen arvo edelleen valaista molekyylitason mekanismeja GC etäpesäke ja tunnistaa uusia merkkiaineita diagnoosi, ennuste, ja hoito potilailla, joilla GC.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavaa RNA: t ~22 nukleotidin pituus, jotka säätelevät ilmentymistä niiden kohde-mRNA: iden kautta translaation tukahduttamisen tai mRNA pilkkominen [6]. Ne ovat mukana ratkaiseva biologisissa prosesseissa, kuten kehitys- ja erilaistuminen [7], [8]. Häiriöstä miRNA korreloi tärkeä rooli syövän kehittymisessä ja etenemisessä säätelemällä solujen lisääntymistä, erilaistumista, apoptoosia ja carcinogesis [9], [10]. Poikkeava ekspressio miRNA tai mutaatioita miRNA geenit on hyvin tutkittu monia kasvaimia, mukaan lukien lymfooma, keuhkojen, haiman, leukemia, rintasyöpä, paksusuolen ja maksan syöpien [11] - [15]. Kuitenkin roolit miRNA GC edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

Aiemmat tutkimukset ovat tutkineet rooli miR-410 useissa syövissä. Gattolliat ym [16] .demonstrated että ilmentyminen miR-410 oli merkitsevästi yhteydessä sairauteen elinaika ei-monistettu suotuisa neuroblastooma. Lisäksi Chen at el [17] totesi, että ilmentyminen miR-410 pienennettiin ihmisen gliooma ja pakotti ilmentyminen miR-410 gliooma soluissa voimakkaasti esti solujen lisääntymistä, invaasiota välittämä kohdistamalla MET. Lisäksi Chien et al [18] mukaan miR-410 säätelee negatiivisesti pRb /E2F-reitin suoraan kohdentamalla CDK1 joka oli onkogeeni rintasyövän. Kuitenkin rooli miR-410 GC edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että pienentynyt miR-410 ilmaisu on tunnusomainen molekyyli muutos GC ja tutkittiin vaikutusta moduloidun miR-410 tasoilla fenotyyppien GC solulinjoissa. Osoitimme myös, että miR-410 voi toimia onkogeenin suoraan kohdentamalla MDM2.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki nämä potilaat suostuivat osallistumaan tutkimukseen ja antoi kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Sekä tämän tutkimuksen ja suostumus oli hyväksynyt eettinen hallituksen Anhuin maakunnan sairaalan ja noudatetaan Helsingin julistuksen.

Human näytteitä

Ihmisen GC ja niiden vastaavat ei-tuumori- mahalaukun kerättiin aikaan kirurgisen resektion päässä Anhuin maakunnan sairaalan vuodesta 2008 vuoteen 2009. Kirjallinen suostumus on saatu ennen keräämistä. Yksi osa kiinnitettiin 10% formaliinilla histopatologista diagnoosia varten, ja toinen välittömästi snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -196 ° C: ssa nestemäisessä typessä, kunnes RNA uutettiin. Käyttö ihmiskudosten hyväksyi Clinical Research eettisen komitean Anhuin maakunnan sairaalan.

Soluviljely

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 ja HEK293T soluja ostettuja Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian at Kiinan Academy of Sciences. Mahalaukun epiteelin-1 solun (GES) saatiin Shanghai Ruijin sairaalan Shanghai Jiaotong yliopiston School of Medicine. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 ja GES pidettiin RPMI1640 ja HEK293T- pidettiin Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaine media. Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, joka sisälsi 5% hiilidioksidia.

Plasmidit ja solujen transfektio

MiR-410 matkivat /inhibiittori ja valvonta ostettiin RiboBio (Guangzhou, Kiina). HGC-27-soluja siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille 30% konfluenssiin yhtä vuorokautta ennen transfektiota. Transfektion miR-410 matkivat /estäjä tai tarkastukset suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfektio kompleksit valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

qRT-PCR

qRT-PCR-määrityksissä, kokonais-RNA uutettiin soluista, joissa TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Käänteinen transkriptio suoritettiin PrimeScript RT reagenssi Kit gDNA pyyhekumi (Takara) mukaan valmistajan ohjeiden. Ekspression miR-410 varmennettiin muuttaa stemloop RT-PCR erityisiä RT ja PCR-alukkeita. U6 snRNA käytettiin endogeenista ohjaus. RT reaktiot suoritettiin käyttäen RNA jaetta, Promega RT Kit valmistajan ohjeiden protokollaa. PCR-olosuhteet suoritettiin denaturoivalla DNA 94 ° C: ssa 4 minuutin ajan, minkä jälkeen 40 monistussykliä: 94 ° C: ssa 40 s, 52 ° C: ssa 40 s, 72 ° C: ssa 40 s tiedonkeruuseen. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin ABI 7500 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems) käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq (Perfect Real Time) Kits (TaKaRa, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden.

proliferaatiomääritystä

yhteensä 10 ^{4 solua per kuoppa maljattiin 96-kuoppaisille levyille ennen transfektiota ja niitä viljeltiin 24 tuntia normaaliolosuhteissa. Sitten ne transfektoidaan miR-410 matkivat tai anti-miR-410-estäjän kanssa pariksi negatiiviset kontrollit. Proliferaatiota arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit 8 (Dojindo, Tokio, Japani) mukaan valmistajan protokollaa.}

Solun maahanmuutto- ja invaasiomääritys

siirtymisen määrityksiä, 5 x 10 ^{4-soluja lisättiin ylempään kammioon insertin (BD Bioscience, 8 um huokoskoko). Sillä invaasio määrityksissä, 1 x 10 5 solua lisättiin ylempään kammioon insertin esipäällystetty matrigeelin (BD Bioscience). Molemmissa määrityksissä, solut maljattiin alustaa ilman seerumia, ja joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa toimi kemoattraktantti. Useita tunteja kestäneen inkuboinnin solujen eivät muuttaneet tai hyökätä huokosten läpi huolellisesti pyyhitty pois vanulla. Sitten insertit värjättiin 20% metanolia ja 0,2% kristalliviolettia, kuvaamisen, ja laskettiin jossa IX71 käännettyä mikroskooppia (Olympus).}

Western blot-analyysi

Proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidi geelielektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja inkuboidaan kanin anti-MDM2 monoklonaalinen vasta-aine (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ja hiiren anti-b-GAPDH monoklonaalinen vasta-aine (1:10000; Sigma). Proteiinit detektoitiin tehostetun kemiluminesenssin reagenssit (Pierce, Rockford, IL, USA).

lusiferaasireporttiterilla määritys

HEK293T-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkuboinnin seos 100 ng pLUC 3'UTR, 5-pmol negatiivinen kontrolli, miR-410 matkivat transfektoitiin 20 ng.

Renilla osaksi HEK293T-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin Dual-lusiferaasireportterisysteemillä (Promega, Madison, WI, USA). Transfektiotehokkuus normalisoitiin keratransfektiolla kanssa Renillaa reportterivektoria.

Tilastollinen

Tulokset esitettiin keskiarvoina ± keskihajonta ainakin kolme koetta. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SPSS 15.0. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja Studentin t-testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin. Arvoa p < 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista analyysiä.

tulos

Expression of miR-410 oli merkittävästi säädellä vähentävästi GC solujen ja kudosten

arvioimiseksi rooli miR-410 GC, arvioimme ilmaus miR-410 GC solulinjassa, kudokset ja niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR. Huomasimme, että miR-410 pitoisuudet olivat usein säädellä vähentävästi GC solulinjoissa verrattuna GES. Kuvio 1B esittää, että miR-410-tasot säädellä vähentävästi GC kudoksissa verrattuna in vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Keskimääräinen ekspressiotaso karsinooma kudoksissa (yhdistelmä) oli merkitsevästi korkeampi verrattuna niiden viereisten ei-neoplastisten kudosten (kuvio 1 C). Osoitimme myös, että ilmaus miR-410 etäpesäkkeet GC kudokset oli pienempi kuin ei-etäpesäkkeitä kudoksissa (Fig. 1 D).

miR-410 esti GC solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion

tasot miR-410 lisättiin merkittävästi GC soluissa, jotka transfektoitiin miR-410 jäljittelee sekä miR-410-tasot laskivat jotka hoidettiin MIR-410 estäjä (Fig. 2A). Up-regulation miR-410 esti GC solujen lisääntymistä; toisin, knockdovvn miR-410 oli päinvastainen vaikutus soluproliferaatioon (Fig. 2B). Lisäksi transwell määritys ja invaasiomääritys osoitti, että siirretyn ja invasiivisuus transfektoitujen solujen miR-410 jäljittelee dramaattisesti väheni kontrolliin verrattuna ja käsittelemättömien solujen. Osoitimme myös, että siirretyn ja invasiivisuus transfektoitujen solujen miR-410-estäjä on kasvanut dramaattisesti verrattuna kontrolliin ja käsittelemättömien solujen. (Fig. 2C ja D).

miR-410 oli suunnattu suoraan MDM2 GC

Kuten ennusti PicTar oli täydentävät toisiaan on-miR-410 ja MDM2 3'-UTR (Fig . 3A). Sen osoittamiseksi, että miR-410 suoraan säätelee MDM2, käytimme dual-lusiferaasireportterisysteemillä. Olemme havainneet, että co-ilmentyminen miR-410 suppressoi merkitsevästi firely lusiferaasireportteri- aktiivisuutta villityypin MDM2 3'UTR, mutta ei mutantti-3'UTR (Fig. 3B). Yli-ilmentyminen miR-410 vähensi ilmaus MDM2 mRNA ja proteiini (Fig. 3C ja D).

yli-ilmentyminen MDM2 inpaired miR-410 inhiboivan vaikutuksen hyökkäyksen GC soluissa

Suoritimme pelastuskokeiden transfektiolla 3'UTR-negatiivisten MDM2 yhdessä miR-410. Kuten odotettua, transfektio pcDNA3.1-MDM2 lievittää vähentäminen MDM2 johtui miR-410 matkivat hoitoa (Fig. 4A). Kanssa ilmentymisen kohdeproteiinien, transfektio pcDNA3.1-MDM2 lieventää inhibitiota solujen monistus (Fig. 4B) ja kasvu invasiivisen soluja (Fig. 4C) johtui miR-410 matkivat hoitoon.

MDM2 oli käänteisesti ilmaistiin miR-410 GC

selventämään lisäksi suhdetta miR-410 ja MDM2 ilmaisun perusnäytteiden, me ensin havaittu MDM2 GC solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A ja 5B, mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä MDM2 oli paljon higer on 4 GC solulinjoja kuin että GES. Huomasimme myös, että ilmaus MDM2 GC kudoksissa oli merkittävä korkeampi kuin vastaavassa viereisten normaalit kudokset (Fig. 5C). Sirontakuvaaja ja Pearsonin korrelaatio analyysi osoitti lisäksi, että miR-410-ilmentyminen korreloi negatiivisesti kohdeproteiinin tasot GC näytteissä (kuvio. 5D). Nämä tiedot osoittivat, että vähentynyt miR-410 ilmentyminen liittyi lisääntynyt MDM2 tasot useimmissa GC potilaista.

Keskustelu

miRNA ovat toimineet tärkeinä sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen asemalla -transcriptional taso ja säädellä erilaisia ​​fysiologisia ja kehitysprosessien [6], [19], [20]. Asennus todisteet viittaavat siihen, että muutokset ilmaus miRNA myötävaikuttaa patogeneesiin eniten ihmisen syöpien, jotka voivat toimia joko onkogeenien tai tuumorisuppressorit [21], [22]. Äskettäin kertyvät tiedot osoittavat, että miRNA ovat mukana monia tärkeitä biologisia tapahtumia, kuten kasvaimen kehittymisen ja syövän etäpesäkkeiden [23], [24]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet biologisen roolin miR-410 ihmisen GC kasvaimien syntyyn. Tuloksemme osoittivat, että miR-410 oli usein alassäädetty ihmisen GC ja että sen alassäätöä oli merkitsevästi yhteydessä kliinisessä vaiheessa ja imusolmuke etäpesäke. Pakotettu ilmentymä miR-410 voisi lisätä jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion GC solujen linja in vitro. Olemme edelleen tunnistettu MDM2, otaksuttu tuumorisuppressorigeeniä, koska välitön toiminnallinen tavoite miR-410. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus tutkia roolia miR-410 GC, ja tuloksemme osoittivat, että miR-410 toimi uutena onkogeenin GC.

vapautuminen miR-410 on usein tapahtuma erilaisissa syövissä, mikä viittaa siihen, että miR-410 voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen. Gattolliat ja kollegat osoittavat miR-410 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä sairauteen elinaika ei-monistettu suotuisa neuroblastooma [16]. Lisäksi Chen [17] mukaan miR-410 ilmentyminen väheni ihmisen gliooma ja pakotti miR-410 ilmentymisen glioomasolujen esti voimakkaasti solujen lisääntymistä, invaasiota välittämä kohdistamalla MET. Kuitenkin ilmentymistä ja toimintaa miR-410 GC kehitys ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet ilmaus miR-410 useissa GC solulinjoissa ja GES käyttäen qRT-PCR. Ilmaisu Mir-410 oli merkittävästi lisääntynyt kaikissa neljässä GC solulinjoissa verrattuna vuonna GES. Lisäksi saadut tulokset kliinisistä GC kudoksesta vahvisti myös, että miR-410 oli alassäädetty GC kudoksissa verrattuna pariksi ei-syöpä viereisten kudosten, mikä osoittaa sen mahdollista osallistumista sekä syövän syntyyn ja kasvainmetastaasit. Me vahvisti myöhemmin, että esto miR-410 merkittävästi edistänyt GC solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion in vitro.

tutkittava lisää molekyylitason mekanismi taustalla rooli miR-410 ja tunnistettu MDM2 välittömänä toiminnallinen alavirtaan kohteena miR-410 GC soluissa. Bioinformatiikka, joita käytettiin ennustamaan tavoitteisiin miRNA, korostettiin korkean vapaan energian siemenet ottelun hyvin säilytetty miRNA-sitoutumiskohdan ja sen kohde-mRNA: iden, mutta spesifisyys on kuitenkin edelleen ongelmallista määriteltäessä tavoitteita monien miRNA. Näin ollen, yli-ilmentyminen miRNA voisi alas-säädellä ilmentymistä kohdeproteiinin. Täydentävät sekvenssi miR-410 on tunnistettu 3'UTR MDM2-mRNA: n. Lisäksi osoitimme, että miR-410 suoraan kohdistuu 3'UTR MDM2, koska sen yliekspressio liittyi tukahduttaminen lusiferaasiaktiivisuuden. Lisäksi merkittävä alassäätöä tason MDM2-proteiinin jälkeen havaittiin miR-410 yliekspressio, mikä osoittaa posttranskriptionaalisella sääntely MDM2 kautta kohdistaminen sen 3'UTR. Nämä tulokset osoittivat, että miR-410 voi toimia tuumorisuppressorina osittain välittyy tukahduta miR-410 ilmaisun GC kehittämiseen.

MDM2 on onkogeeni, joka oli aluksi löydettiin lokus monistettiin kaksinkertainen minuutin kromosomien kasvaimia hiirisolulinjaa (3T3-DM) [25]. Päätehtävä MDM2 on estää p53 bioaktiivisuutta estämällä transkriptionaalista aktiivisuutta p53 ja edistää p53-proteiinin hajoaminen [26] - [28]. Korkea MDM2 laskivat p53-proteiinin tasot ja voi vaimentaa p53-toiminto, mikä lisäsi syöpäriskiä ja /tai nopeutetun kasvaimen muodostumisen ja etenemisen [29]. MDM2 onkogeeni oli tärkeä rooli syövän etenemisessä [30]. Yliekspressio MDM2 kasvainsoluissa indusoi solujen proliferaatiota, inhiboi apoptoosia [31]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että MDM2 yliekspressio liittyi huono selviytyminen ja oli hyödyllinen ennustava tekijä huonon ennusteen ihmisillä maksasyövän ja rintakarsinoomista [32], [33]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa on havaittu, että MDM2 ilmaistiin korkeammilla tasoilla GC kudoksissa kuin ei-syöpä mahan limakalvoa, ja MDM2 ilmentyminen liittyi viittaavia tekijöitä hoidetuilla potilailla vain leikkaus [34], [35]. Lisäksi knockdown MDM2 tai yliekspressio JWA on synergiavaikutusta tukahduttamisesta mahasyövän solujen lisääntymisen ja muuttoliike [35]. Kuitenkin mekanismi, kuinka MDM2 oli yli-ilmentyminen on vielä tuntematon. Nämä tulokset osoittivat, että kyky miR-410 kohdistaa MDM2 voi tarjota yksi tällainen mekanismi transkription jälkeisen valvonnan MDM2.

Yhteenvetona tuloksemme ovat osoittaneet, että miR-410 oli merkittävästi säädellä vähentävästi GC soluja ja kudoksia. Pakotettu ilmentymä miR-410 nousi GC solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion kautta suoraan kohdistaminen MDM2. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tämä uusi miR-410 /MDM2 akseli antaa uutta tietoa olevien mekanismien tuumorimetastaasin, ja tukahduttaminen miR-410 ilmentyminen voi olla potentiaalinen terapeuttinen strategia hoitoon GC tulevaisuudessa.

tukeminen Information
Taulukko S1.
ennusteeseen viittaavia charateristics potilaiden GC.
doi: 10,1371 /journal.pone.0104510.s001
(DOCX) B Taulukko S2.
Primer järjestyksessä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX) B

• PLoS ONE: analyysi imusolmukemääritysmenetelmä Etäpesäke Korrelaatio Ennuste potilailla, joilla T2 mahasyövän
• PLoS ONE: Association between Dairy Imu ja mahasyövän: Meta-analyysi Observational Studies