PLoS ONE: Galectine-3 Maakt celmotiliteit bij maagkanker door Up-reguleren van Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) en Matrix metalloproteïnase-1 (MMP-1)

De abstracte

Achtergrond

Galectin-3 is bekend om kanker metastase reguleren. Echter, het onderliggende mechanisme niet gedefinieerd. Door de DNA microarray studies na galectine-3 silencing lieten we zien hier dat galectine-3 speelt een sleutelrol bij het up-reguleren van de uitingen van protease geactiveerde receptor-1 (PAR-1) en matrix metalloproteïnase-1 (MMP-1) PAR-1 waardoor bevorderen maagkanker metastase.

Methodologie /voornaamste bevindingen

We onderzochten de expressieniveaus van Galectine-3, PAR-1 en MMP-1 bij maagkanker patiënten weefsels alsmede de effecten van deze eiwitten zwijgen met siRNA's en van hen overexpressie met specifieke lenti-virale constructen. We hebben ook in dienst zebravis embryo model voor de analyse van In vivo
maagkanker cel invasie. Deze studies toonden aan dat: a) galectine-3 silencing verlaagt de expressie van PAR-1. b) galectin-3 overexpressie verhoogt cel migratie en invasie en deze stijging kan worden omgekeerd door PAR-1 silencing, wat aangeeft dat galectine-3 verhoogt de cel migratie en invasie via PAR-1 up-regulering. c) galectine-3 direct met AP-1 transcriptiefactor en complex bindt aan PAR-1 promoter en rijdt PAR-1 transcriptie. d) galectine-3 versterkt ook fosfo-paxillin een PAR-1 stroomafwaarts doelwit, door het verhogen van MMP-1 expressie. MMP-1 zwijgen blokken fosfo-paxillin versterking en cel invasie veroorzaakt door galectin-3 over-expressie. e) Silencing van ofwel galectin-3, PAR-1 of MMP-1 significant verminderde migratie van cellen in de vaten in de zebravis embryo model. f) Galectine-3, PAR-1 en MMP-1 wordt sterk tot expressie en co-gelokaliseerd in maligne weefsels maagkankerpatiënten.

Conclusies /Belang

Galectine-3 speelt de sleutel rol activeren celoppervlak receptor via de productie van protease en verhoogt maagkanker metastase. Galectine-3 heeft de potentie om een ​​nuttig farmacologisch doelwit voor de preventie van maagkanker metastase

Citation:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) Galectine-3 Maakt motiliteit bij maagkanker door opreguleren Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) en matrix-metalloproteïnase-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10.1371 /journal.pone.0025103

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrijk |

Ontvangen: 18 mei 2011; Aanvaard: 23 augustus 2011; Gepubliceerd: 22 september 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door de National Cancer Center (NCC) van de Republiek Korea subsidie ​​(NCC-0910150 en NCC-0810060), Innovative Research Institute for Cell Therapy, de Republiek Korea (A062260) en dit onderzoek door de Basic442 Science Research Program werd gesteund door de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (1031790-1), de Republiek Korea. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

kankers die zich verspreiden (metastaseren) vanaf hun oorspronkelijke locatie naar een ander deel van het lichaam, genoemd metastatische kankers. uitgezaaide kankers hebben een slechte prognose en een hoge mortaliteit [1]. Een volledig begrip van de biologische mechanisme (s) die betrokken zijn bij metastase en rationele aanpak van het voorkomen of beheersen van metastase kunnen leiden tot praktische benaderingen voor de verbetering van de overleving van patiënten die lijden aan uitgezaaide kankers. In eerdere studies, vonden we dat galectine-3 verhoogt maagkanker celmotiliteit door opreguleren fascin-1, een actine bundeling cytoskeleteiwit [2]. Galectine-3 is een 31 kDa koolhydraat herkenning eiwit betrokken bij tumorigenese, groei en metastase van kankercellen [3], [4], [5] en de hoge expressie in verschillende menselijke kankers is gebleken te correleren met een slechte prognose metastatische kankers.

Om de rol van galectine-3 in kanker metastase verduidelijken we aangereden de expressie ervan in maagkanker cellen met behulp van de siRNA onderzocht en de resultaten in genexpressie door DNA microarray analyse [6]. Onder vorige resultaten vonden we significante verlaging van het niveau van protease geactiveerde receptor-1 (PAR-1), een lid van de familie van transmembraan G-eiwit-gekoppelde receptoren [7] en de activator, matrix metalloprotease-1 ( MMP-1) (figuur S1). Gesplitste PAR-1 is auto-gefosforyleerd en getransduceerd door extracellulair signaal (s) via verschillende wegen, en speelt een cruciale rol bij tumormetastase [7], [8], [9]. Over-expressie van PAR-1 is gerapporteerd in een aantal kankers, waaronder melanomen, borstkanker en maagkanker. MMP-1 is ook opwaarts gereguleerd in een grote verscheidenheid van gevorderde kankers, en een significante negatieve correlatie waargenomen tussen de expressie en overleving van patiënten [10], [11], [12], [13]. Ook diverse studies blijkt dat MMP-1 speelt een cruciale rol in metastase van borstkanker [14], lever en colon kanker [15] en gastrische kanker [16], [17], onder anderen. Het blijkt dat wanneer uitgescheiden, MMP-1 bevordert kankercel invasie door de afbraak van de extracellulaire matrix en /of submucosale lagen lymfevaten [10], [14]. Talrijke studies hebben aangetoond dat remming van MMP's leidt tot de remming van invasie [18], [19].

hese bevindingen leidden wij veronderstellen dat galectine-3, PAR-1 en MMP-1 kan worden betrokken verbeteren van de migratie en invasie van maagkanker. Om dit te testen voerden we studies voor hun rol bij maagkanker cellen. In beide In vitro Kopen en In vivo
studies, gebruikten we zebravis embryo model voor het bepalen van hun effecten op de migratie en invasie van kankercellen met levende organellen. Ook bepaalden de expressie van galectine-3, PAR-1 en MMP-1 in kwaadaardig weefsel van maagkanker patiënten klinische correlaties tussen deze eiwitten in menselijke monsters.

Resultaten

zwijgen galectine -3 of PAR-1 reduceert de migratie en invasie van menselijke maagkanker cellen

de expressie van galectine-3 en PAR-1 was hoog in de meeste maagkanker cellijnen. We zwijgen opgelegd galectin-3 en PAR-1 in MKN-28 cellen in dienst van de respectieve siRNA. Behandeling met galectine-3 siRNA verlaagde expressieniveaus van zowel galectine-3 en PAR-1, terwijl PAR-1 siRNA behandeling daalde Alleen PAR-1 expressie terwijl geen verschil in galectine-3 (Figuur 1A) waargenomen. Transfectie van SNU-638-cellen, die oorspronkelijk geen expressie galectine-3 weergegeven met galectine-3 coderende plasmide resulteerde in verhoogde expressie van zowel PAR-1 en galectine-3 (Figuur 1B). Silencing ofwel galectin-3 of PAR-1 verminderde totale aantal migrerende ( p Restaurant < 0,001) (figuur 1C) en binnendringende cellen ( p Restaurant < 0,001) (figuur 1D), bijna de helft. Deze gegevens toonden aan dat galectine-3 verhoogde PAR-1 expressie en beide galectine-3 en PAR-1 gemoduleerd maag migratie kankercel en invasie.

Galectine-3 verbetert maagkanker celmigratie /invasie door het verhogen van PAR-1 expressie

We onderzochten de relatie tussen galectine-3-geïnduceerde toenamen in celmigratie en invasie enerzijds en PAR-1 expressie anderzijds. We SNU638 geïnfecteerde cellen met een lentivirus met de galectine-3 expressiecassette en onderzocht uitingen van galectine-3 en PAR-1 en celmigratie gemeten. We vonden dat overexpressie van galectine-3 werd vergezeld door verhoogde PAR-1 mRNA en eiwit uitdrukkingen (Figuur 2A), en celmigratie ( p
< 0,001) (figuur 2B) en celinvasie ( p Restaurant < 0,001) activiteiten (figuur 2C). Deze verhogingen werden gereduceerd door PAR-1 silencing. Deze resultaten suggereren dat de galectine-3 bevorderde de migratie en invasie van maagkanker cellen door up-regulatie van PAR-1.

Galectine-3 bevordert de PAR-1 transcriptie door interactie met AP-1 complex

vervolgens hebben we geprobeerd om toe te lichten hoe galectin-3 regelt PAR-1 expressie. Omdat gemeld werd dat de AP-1 transcriptionele activiteit wordt gereguleerd door galectine-3 [20], we gericht op de rol van deze transcriptiefactor in dit gebied (Figuur 2D). We voerden immunoprecipitatie studies en bepaald dat galectine-3 direct interactie met zowel Fra-1 en c-Jun in het AP-1 complex, en dat deze interactie geassocieerd met opwaartse regulatie van AP-1 transcriptionele activiteit (figuur 2E). Vervolgens onderzochten we de DNA bindende activiteit van AP-1 met en zonder galectine-3 door ChIP assays (figuur 2F). We vonden dat AP-1 complex gebonden de promotor van PAR-1 in aanwezigheid van galectine-3, maar niet in afwezigheid daarvan. Onderzochten we ook de transcriptionele activiteit van AP-1 door luciferase na transfectie van een reporterplasmide die AP-1 bindende sequentie voor een luciferase rijden minimale promotor in LacZ of galectine-3 overexpressie SNU-638-cellen ( p Restaurant < 0,001) (figuur 2G). De transcriptionele activiteit van AP-1 aanzienlijk toegenomen in galectine-3 tot overexpressie brengende cellen, maar niet in LacZ tot overexpressie brengende cellen. Deze resultaten suggereerden dat galectine-3 de binding van de PAR-1 promoter vergemakkelijkt door interactie met AP-1 complex, teneinde aldus het PAR-1 expressie door transcriptionele regulatie.

Galectine-3 verhoogt de expressie van MMP-1 en de activering van PAR-1 signalering

MMP-1 is gerapporteerd reguleren PAR-1 activatie tot splitsing van PAR-1 gebonden intracellulaire signalering, en celinvasie [21] beïnvloeden. Zoals in figuur S1, toonden we aan dat galectine-3 gereguleerde MMP-1 expressie. Daarom bevestigden we de samenhang van galectine-3, MMP-1 en PAR-1. We analyseerden de mRNA expressie van MMP-9, die een stroomafwaarts doel van PAR-1 [8], na zwijgen galectine-3, MMP-1 en PAR-1 afzonderlijk (figuur 3A). Terwijl galectine-3 silencing de expressie van alle drie moleculen (MMP-1, PAR-1 en MMP-9) verminderd MMP-1 silencing verlaagde alleen MMP-9 expressie en niet die van galectine-3 of PAR-1. Interessant PAR-1 silencing geproduceerd hetzelfde effect als MMP-1 silencing. Detecteerden we ook de fosforylering van het cytoskelet eiwit paxillin (pY181), een kenmerk van PAR-1 activatie [22], [23]. Na silencing galectine-3, MMP-1 en PAR-1 individueel, werd de phosphorylaion van paxillin afgenomen, waarbij galectine-3 eveneens geregeld PAR-1 activiteit voorgesteld. Wij checkten de vermindering van MMP-9 activiteit na het zwijgen van galectin-3, MMP-1 en PAR-1 individueel (figuur 3A).

Galectine-3 over expressie SNU638 cellen vertoonden verhoogde expressie niveaus van MMP -1 en PAR-1 eiwit en hun mRNA's, naast gefosforyleerde paxillin (pY181). In deze cellen, MMP-1 silencing verminderde fosforylering van paxillin zonder de expressie van galectine-3 of PAR-1 (Figuur 3B). Bovendien MMP-1 silencing verminderde celinvasie, die wordt geactiveerd door galectine-3 overexpressie ( p
< 0,001) (figuur 3C), hetgeen betekent dat galectine-3 verhoogde MMP-1 expressie leidt tot activering van PAR-1 signalering.

over-expressie van MMP-1 in kankercellen verhoogt invasie door de activering van PAR-1 signalering

We bevestigden dat opregulatie van MMP-1 door galectine-3 is van belang voor de activering van PAR-1 signalering en verhoogde maagkanker cellen invasie. Een lentivirus (pLECE3 vector) die MMP-1 expressiecassette gereguleerd door CMV promotor werd bereid en geïnfecteerd AGS maagkanker cellen (Figuur 4A-B). Zoals verwacht, MMP-1 overexpressie verhoogde de invasie potentieel van maagkanker cellen, en PAR-1 silencing significant omgekeerd deze toename ( p Restaurant < 0,001) (figuur 4B). Dit werd ook bevestigd door het feit dat overexpressie van MMP-1 verhoogde de fosforylering van paxillin en dat aanvullende silencing van PAR-1 geblokkeerd zoals fosforylering (figuur 4A). In MMP-1 overexpressie cellen galectine-3 silencing verminderde de expressie van PAR-1, maar niet van MMP-1, en ook de fosforylering van paxillin en cellen invasiepotentieel (Figuur 4A-B). Deze waarnemingen suggereerden dat overexpressie van MMP-1 verhoogd kankercel invasiviteit door activering van PAR-1 signalering. Alles bij elkaar geven deze resultaten suggereerden dat galectine-3 verhoogde de expressie van zowel PAR-1 en MMP-1, en dat de verhoogde MMP-1 expressie geactiveerde PAR-1 signalering, wat op zijn beurt vergemakkelijkt kankercel invasie. Deze gebeurtenissen zijn schematisch weergegeven in figuur 4C.

zwijgen van galecin-3, PAR-1 of MMP-1 blokken maagkanker celmigratie In vivo
in een zebravis model

transgene zebravis, Tg (kdrl: EGFP) ^{s843
[24], te drukken EGFP specifiek in hun vaatstelsel. De overeenkomstige zebravis embryo's transparant met groen fluorescerend schepen. We gebruikten deze vissen naar In vivo
studies van menselijke maagkanker celmigratie (Figuur 5A) uit te voeren. Wanneer de fluorescerende gelabelde AGS cellen in de dooierzak van de zebravis embryo's werden geïnjecteerd met 48 HPF (uur na bevruchting), de meeste getransplanteerde AGS cellen bevonden zich in het centrum van de dooierzak van het embryo door 4 uur na transplantatie ( hpt). Na 26 hpt, zowel de normale en scRNA getransfecteerde cellen gemigreerd naar kofferbak regio, en woonde in het vat van de romp en /of de staart van de embryo's op 50 hpt. Het aantal gemigreerde cellen AGS, waarbij elk van galectine-3, PAR-1 of MMP-1 zwijgen, significant af (figuur 5B). We telden ook het aantal zebravisembryo's die migrerende cellen weergeven en de resultaten worden getoond (Figuur S2). Tachtig 4-93 procent van de zebravis embryo's die werden getransplanteerd met controle cellen of scRNA behandelde cellen weergegeven cellen migreren in hun romp en staart schepen op 50 hpt. Echter slechts 7-11% van de embryo's werden getransplanteerd met cellen waarin galectine-3, PAR-1 of MMP-1 werden zwijgen, weergegeven migrerende cellen. Deze bevindingen suggereerden dat enerzijds de zebravis embryo model kan worden gebruikt om de migratie van maagkanker cellen als een levend dier te controleren, en anderzijds dat silencing van elk van galectine-3, PAR-1 en MMP-1 veroorzaakte significante vermindering maagkanker celmigratie in vivo
.}

Uitdrukkingen van galectin-3, PAR-1 en MMP-1 zijn verhoogd, in parallel, in het kwaadaardige weefsel van patiënten met maagkanker

We bepaalden het mRNA en eiwit expressie van galectine-3, PAR-1 en MMP-1 in normale en maligne weefsels 20 maagkankerpatiënten vervolgens toegepast RT-PCR onder toepassing van een beeld J analysator. Zoals getoond in figuur 5C en figuur S3, 73,7% van de kankerpatiënten werden hogere expressieniveaus van galectine-3 en 70% van hen vertoonden hogere PAR-1 en MMP-1 niveaus in het kwaadaardige weefsel dan hun normale tegenhangers. Bovendien, onder galectin-3 positieve patiënten, 71,4% waren ook PAR-1 positief, terwijl 64,3% waren ook MMP-1 positief (figuur 5D). Deze gegevens gaven aan dat er een parallelle toename van de expressie van galectine-3 en PAR-1 en MMP-1, in de maag maligne weefsels. We vonden ook dat deze eiwitten co-gelokaliseerd in het gebied van de kwaadaardige weefsels en niet in niet-maligne gebieden (figuur 5C). Galectine-3 is aanwezig in zowel het cytoplasma en de kern, terwijl PAR-1 en MMP-1 in het algemeen in het cytosol en membraan in hetzelfde gebied (Figuur 5C) waargenomen. Deze bevindingen suggereerden dat zowel de PAR-1 en MMP-1 expressies significant gecorreleerd met galctin-3 expressie bij maagkanker patiënten.

Discussie

Deze studie toonde aan dat galectine-3 verbeterde maagkanker celmigratie en invasie. Mechanistisch deze geschakelde galectine-3 tot opwaartse regulatie van PAR-1 celoppervlak receptor en de activiteit MMP-1 protease. Dit is in overeenstemming met rapporten tonen een correlatie tussen expressie van PAR-1 en tumorinvasie en metastase in maag en diverse andere kankers [25], [26], [27]. Deze studie is de eerste die een directe interactie van galectine-3 en AP-1 complexe componenten, c-Jun en Fra-1, en regulering van PAR-1 expressie door AP-1 transcriptiefactor tonen. Aangezien is reeds door anderen aangetoond dat overexpressie van Fra-1 bevordert kankercel invasie en metastase [28], up-regulatie van PAR-1 door c-Jun en Fra-1 bleek een mogelijk mechanisme uitleggen van de koppeling worden van galectine-3 induceerde opwaartse regulatie van PAR-1 celoppervlak receptor en de activiteit MMP-1 protease. Deze mogelijkheid wordt ondersteund door onze bevinding van parallelle en mede gelokaliseerde uitingen van galectine-3 en PAR-1 in kwaadaardig weefsel van maagkankerpatiënten.

Het is een nieuwe waarneming dat galectine-3 verhoogt MMP-1 expressie . Duidelijk, de over-expressie van MMP-1 kan maagkanker invasie activiteit te verhogen door het blokkeren van cel tot cel en cel-matrix interacties van ECM afbraak. Daarom zou een verhoging van MMP-1 expressie bevorderd door galectine-3 duale effecten, namelijk PAR-1 activatie en ECM degradatie, en beide cruciaal zijn voor maagkanker metastase. Maar hoe galectine-3 regelt MMP-1 expressie is nog onduidelijk, omdat de expressie van MMP-1 wordt geregeld door een reeks complexe gebeurtenissen zoals overspraak tussen verschillende transcriptionele factoren zoals AP-1, signaaltransductor en activator van transcriptie-3, MAP kinase, en hypoxie-induceerbare factor-1 in hypoxie [29], [30], [31].

Vaststelling van de zebravis ( Danio rerio
) embryo model voor het bestuderen van de migratie en invasie van maagkanker cellen een specifieke uitvoering van deze studie, omdat geschikte diermodellen waren niet beschikbaar voor het bestuderen van menselijke maagkanker metastase tot nu. De zebravis model van genetisch gemanipuleerde kankers en /of tumoren xenotransplantaten studie, heeft vele voordelen, waaronder haalbaarheid van voorwaartse en omgekeerde genetische analyses transparantie van de embryo's [32] en geschiktheid voor GFP kenmerken van vaartuigen [32], [33], [34]. Deze studie toonde aan dat RFP gelabelde maagkanker cellen binnengedrongen bloedvaten terwijl galectin-3, MMP-1 of PAR-1 tot zwijgen maagkanker cellen niet kon. Dus de zebravis embryo lijkt een veelbelovend model voor de studie invasie en metastase van kankercellen, hoewel verdere studies duidelijk nodig om dit resultaat te bevestigen.

Concluderend onze studies aangetoond dat galectine-3 versnelde maagkanker celmotiliteit door up-regulering van PAR-1 en MMP-1. Verdere studies zijn duidelijk nodig om de rol van galectine-3 in uitzaaiing en hiervan een geschikt therapeutisch doel vast voor geselecteerde kankers.

Materialen en Werkwijzen

Tissues

Paren van 2 mm grote biopten werden verkregen van adenocarcinoom van de maag weefsel van 20 patiënten diagnostische endoscopie en endoscopische submucosale dissectie, waarvoor op National Cancer center in Korea, na het behalen van hun schriftelijke toestemming geïnformeerd. De weefselmonsters werden ingevroren in vloeibare stikstof bij -70 ° C onmiddellijk na biopsie tot gebruik. Enkele weefselmonsters werden paraffindized voor immunohistochemische studies, indien nodig. Deze studies werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van het National Cancer Center (# NCCNSH 03-024).

Cell Cultuur en siRNA transfecties

Matig gedifferentieerde menselijke adenocarcinoom cellijnen, AGS, MKN- 28 en SNU-638 werden verkregen uit de Korea Cell Line Bank en onderhouden zoals eerder [35] beschreven. siRNAs gebruikt in transfecties werden alle geleverd door Invitrogen (Carlsbad, CA). Hun sequenties zijn galectine-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', en MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfecties werden uitgevoerd met Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Inductie van transiënte overexpressie galectine-3 in SNU-638-cellen werd bereikt met pcDNA3.1 /NT-galectine-3 met pcDNA3.1 /NT-GFP. Voor normalisatie controlebehandeling werden de maagkanker cellijnen behandeld met 1 ug van LTX reagens (Invitrogen).

RNA-isolatie en RT-PCR-analyse

Totaal RNA werd geïsoleerd uit menselijke maagkanker cellen en patiënten weefselmonsters, via TRIzol Reagent (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Reverse transcriptase PCR werd uitgevoerd met een omgekeerde transcriptie systeem (Promega Corp. USA) volgens de instructies van de fabrikant. De primers werden gebruikt: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(sense) en 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (antisense) voor menselijke LGAL3 (galectine-3) gen; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(sense) en 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (antisense) voor menselijke F2R (PAR-1) gen; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(sense) en 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (antisense) voor menselijke MMP-1 gen; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(sense) en 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (antisense) voor menselijke MMP-9 gen; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(sense) en 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (antisense) voor menselijke β-actine gen; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(sense) en 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (antisense) voor humaan glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH). PCR werd uitgevoerd in een 20 ul volume met Ex Taq (Takara). De amplificatie cyclus (denaturatie 95 ° C gedurende 1 min, annealing 60 ° C gedurende 1 minuut en extensie bij 72 ° C gedurende 2 min) werd 32 maal gevolgd door laatste extensie van 10 minuten herhaald bij 72 ° C.

Constructie van galectine-3 tot expressie lenti-virale vector en infectie

de volledige lengte humaan galectine-3 tot expressie construct pcDNA3.1-NT-GFP-gal3 de pcDNA3.1-NT-GFP vector en het lenti-virale vector om overexpressie LacZ, galectine-3 (1-250) in pLL3.7 zijn eerder beschreven [2]. Menselijke F2R werd gekloneerd in pLECE3 in BamH1 en NOT1 restrictie-enzymplaatsen hetgeen het pLECE3-F2R (PAR-1) te construeren. Volledige lengte cDNA van F2R, MMP-1 en controle mRFP werden gebruikt voor PCR-amplificatie met de in Data S1 genoemde primers en resulterende PCR fragmenten werden gekloneerd in de pLECE3 vector behulp PAC1 en Hpa1 restrictie-enzymplaatsen hetgeen het pLECE3 MMP-1 construct. Ook de mRFP site van de pGEM-T-Easy-vector werd overgebracht naar het pLL3.7 vector het vervangen van de GFP regio met behulp van AGE1 en EcoR1 restrictie-enzym sites, om pLL3.7-mRFP te maken. Lenti-virale vector productie is eerder beschreven [2]

Western blotanalyse

cellysaat extracties werden bereid met RIPA buffer (1% NP-40;. 0,1% natriumdodecylsulfaat, 0,5 % desoxycholaat, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5) en protease-remmer cocktail. 20 ug totaal eiwit van elk lysaat werd opgelost in 8-12% SDS-PAGE gels en elektrisch overgebracht op PVDF-membraan, en vervolgens geblokkeerd in 5% magere melk in 0,05% Tween-20 met 1 x PBS (PBST). Polyklonale primaire antilichamen, anti-Galectine-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 en anti-β-actine (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillin en anti-fosfo paxillin (pY181) (Epitomics) werden geïncubeerd met blots op 1:1000 verdunning in minimale hoeveelheden van 5% BSA (runderserumalbumine) in PBST buffer gedurende 1 uur kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Anti-muis of anti-konijn geit-HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (GE Healthcare UK Limited) werden bij 1:5000 verdunning van 5% BSA in PBST buffer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. Eiwitten van belang werden gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA).

Immunoprecipitatie

Cellysaat extracten werden bereid met IP + buffer (20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM natriumorthovanadaat, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml cocktail van proteaseremmers) op ijs gedurende 30 min. Na afvalverwijderingssysteem door centrifugeren (13.200 rpm bij 4 ° C gedurende 20 min), werden de supernatanten onderworpen aan een stap preclearing met proteïne A /G Agarose kralen bij 4 ° C gedurende 30 min in rotator. Supernatanten verkregen na een korte centrifugatie (2000 rpm bij 4 ° C gedurende 4 min) werden onderworpen aan immunoprecipitatie met een anti-galectin3 en normale muis IgG (negatieve controle). Immunoprecipitaten werden tweemaal in IP buffer (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfaat) gewassen. Na 30 pl 2 x SDS-monsterbuffer Bovendien gevolgd koken bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Na verkregen supernatanten na een korte centrifugeren, werden hun eiwit expressie niveaus bepalen, door middel van de western blot analyse uitgevoerd.

Immunohistochemie

Voor galectin-3 en PAR-1 immunohistochemie, paraffine ontdaan maagkankerpatienten weefselcoupes bleven in een magnetron gedurende 15 min in citraatbuffer (Vector Laboratories) en vervolgens geïncubeerd met 3% H _{2O 2 gedurende 15 minuten endogene peroxidase, gevolgd door incubatie met 10% normaal geit serum blokkeren (Vector laboratoria) in 1 x PBS gedurende 10 min. Primaire antilichamen werden een anti-galectine-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) en anti-PAR-1 (1:200) antilichamen (Santa Cruz), en de volgende stap werd uitgevoerd volgens instructies van Vectastain®ABC kit (Vector Laboratories). De producten werden gevisualiseerd door diaminobenzidine (DAB) kits (Vector laboratoria).}

Gelatine zymografie

Geconditioneerde media werden verkregen uit kweken van MKN-28 maagkanker cellijnen en geconcentreerd met behulp van Vivaspin 6 (Sartorius ). De geconcentreerde supernatanten 6 x Foz buffer werden gescheiden op 10% SDS-gels bevattende 1 mg /ml gelatine. Elk werd geïncubeerd in 100 ml zymografie reactiebuffer en gekleurd met Bio-safe ™ coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Na ontkleuren, werden scherpe transparante bands aangeeft gelatinolytische activiteit gevisualiseerd op een blauwe achtergrond.

Transfilter migratie en invasie assays

Voor de transfilter migratie en invasie test gebruikten we MKN-28 en SNU-638 cellen. De cellen werden getransfecteerd met siRNA gedurende 1 dag, geïsoleerd en toegevoegd aan de bovenste kamers van poriën Transwell inzetstukken met collageen type l (BD Bioscience) gecoate filters in migratieanalyse en Matrigel (BD Bioscience) gecoate filters voor invasie assays. RPMI 1640 met 10% FBS en 1% antibiotica (Gibco) toegevoegd aan de onderste kamer, gevolgd door incubatie gedurende 20 uur toegevoegd. Migreren en binnendringende cellen werden gekwantificeerd na H &E kleuring. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd en gegevens weergegeven als gemiddelde waarden.

Chromatine immunoprecipitatie assays

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) werden uitgevoerd onder toepassing van een ChIP assay kit (Millipore). Monsters werden aangebracht op de vaat na galectine-3 siRNA behandeling en assays werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Anti-Galectine-3, anti-c-Jun, anti-Fra-1 en normale muis /konijn-IgG werden gebruikt om DNA complexen immunoprecipitatie. Voorafgaand aan PCR werden primers bereid voor AP-1 met PAR-1 promoter bindingsplaatsen -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') en PAR-1 promotorplaats -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCR werd uitgevoerd met Ex Taq (Takara).

Luciferase assays

Een AP-1 luciferase reporter plasmide werd verkregen van Dr. Sung-Yoon Pil van het National Cancer Center in Korea en studies van de effecten van galectine-3 op AP-1 transcriptionele activiteit in lacZ en galectine-3 tot overexpressie brengende cellen werd uitgevoerd volgens een eerder verslag [2]. Na 48 uur werden de cellen geoogst en luciferaseactiviteit werd gemeten met een luciferase assay systeem (Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd en de gegevens gepresenteerd als gemiddelde waarden

Cell migratie test met behulp van de zebravis model

De transgene zebravis regel Tg (kdrl: EGFP). ^{s843
[24], waarin de EGFP specifiek in het vaatstelsel wordt uitgedrukt, werd in overeenstemming met de geaccepteerde standaard operating procedures gehandhaafd [36] goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite bij National Cancer Center in Korea; nummer van de vergunning: NCC 11-116. We verkregen zebra-vis embryo's uit de nationale kankercentrum zebravis aqua-kamer. kanker cel transplantatie werd uitgevoerd volgens Nicoli et al [37] met geringe modificaties. In het kort werden dechorionated embryo verdoofd met tricaïne (Sigma) en kankercellen werden geïnjecteerd (150 tot 200 per embryo) in de centra van embryonale dooierzakken bij 48 HPF (uur na bevruchting) met een micromanipulator (Narishige) en een pneumatische picopump (WPI ) uitgerust met een borosilicaatglas naald. Embryo's werden na transplantatie hanteert en onderzocht op migrerende kanker cellen door fluorescentie microscopie. Voor de beeldvorming, embryo's en larven werden behandeld met N-fenylthioureum (Sigma) van 12 HPF te voorkomen pigmentatie en onderzocht met een fluorescerende omgekeerde microscoop (Carl Zeiss) onder epifluorescentie optiek. Fluorescerende beelden werden gevangen met een CCD-camera (Carl Zeiss). Stabiele fluorescerende maag cellijnen AGS (mRFP) werden gegenereerd door Lenti-virus infectie met pLL3.7-mRFP gevolgd door FACS sorteren.}

microarray data-analyse

Microarray werd uitgevoerd in AGS, maagkanker cellijn na het zwijgen op te leggen van galectin-3, zoals eerder beschreven [6]. Microarray resultaten werden geüpload op GEO (GSE29630).

Statistieken analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van ten minste 5-10 beelden verkregen uit drie onafhankelijke experimenten met behulp van microscoop (× 100 × 200), tenzij anders aangegeven. Statistische analyse werd uitgevoerd door eenzijdige ANOVA test met Prism software. De gegevens werden significant geacht indien p
. ≪ 0.05

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Silenced galectin-3 met siRNA bij maagkanker cellen geleid tot veranderingen in de cel beweeglijkheid gerelateerde genexpressie. Een, onder DNA microarray analyse, kozen we celmotiliteit gerelateerd gen MMP-1, MMP-3, FSCN1 (fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) en liet veelvoudverandering verhouding . B, Detectie van mRNA expressie van MMP-1, MMP-3, FSCN1 (fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) onder toepassing van PCR. β-actine werd gebruikt als een normalisering controle
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Figuur S2.
Het aantal zebravis embryo's met gemigreerd cellen ratio. Detectie van maagkanker cel AGS (RFP) cijfers achter getransplanteerd van AGS (RFP) in de zebravis embryo vis met de behandeling van specifieke siRNA (galectin-3, MMP-1 en PAR-1) met de negatieve controle scRNA (figuur 5A-B). Het toonde aantal gemigreerde cellen per embyos werd geteld en weergegeven als percentage
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF)
Figuur S3.
RT-PCR analyse van mRNA-niveau van galectine-3, MMP-1 en PAR-1 bij maagkankerpatiënten.

• PLoS ONE: De Tumor-Log Odds positieve lymfeklieren metastase Staging System, een veelbelovende nieuwe Staging System voor maagkanker na D2 resectie in China
• PLoS ONE: Honokiol Veroorzaakt Calpain-Mediated Glucose-Gereglementeerde Protein-94 Splitsing en apoptose in menselijke cellen maagkanker en vermindert Tumor Growth