PLoS ONE: Klinisk Betydningen av MiR-137 Expression hos pasienter med magekreft etter radikal Gastrectomy

Abstract

Den feilregulering av MIR-137 spiller viktige roller i onkogenese og progresjon av ulike typer kreft, men dens rolle i prognose av magekreftpasienter er ukjent. Denne studien var designet for å undersøke uttrykk og prognostisk betydning av MIR-137 i mage kreftpasienter etter radikal gastrektomi. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført for å behandle uttrykket av MIR-137 i humane mage kreft cellelinjer og vev hos pasienter med adenokarsinom i ventrikkel. Resultatene ble vurdert for tilknytning til kliniske faktorer og total overlevelse ved hjelp av Kaplan-Meier analyse. Prognostiske verdier av Mir-137 uttrykk og kliniske resultater ble evaluert av Cox regresjonsanalyse. Resultatene viste at uttrykket nivået av MIR-137 ble redusert i humane mage kreft cellelinjer og vev, og nedregulert uttrykk for MIR-137 var assosiert med tumor celledifferensiering, N scenen, og TNM stadium. Redusert MIR-137 uttrykk i mage kreft vev var positivt korrelert med dårlig total overlevelse av mage kreftpasienter. Videre multivariat Cox regresjonsanalyse antydet at Mir-137 uttrykk var en uavhengig prognostisk indikator for magekreft med unntak av TNM stadium. Anvendelse av prognostisk verdi av Mir-137 uttrykk for TNM stadium III gruppen viste en bedre risikovurderingen av total overlevelse. Som konklusjon viser resultatene forsterket avgjørende rolle for den nedregulert MIR-137-ekspresjon i magekreft, og foreslo at MIR-137 uttrykket kan være en prognostisk indikator for denne sykdommen. I tillegg kan disse pasientene med TNM stadium III magekreft og lav Mir-137 uttrykk trenger mer aggressiv postoperativ behandling og tettere oppfølging

Citation. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye Shi S, Nian Y (2015) klinisk Betydningen av MiR-137 Expression hos pasienter med magekreft etter radikal gastrektomi. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10,1371 /journal.pone.0142377

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

mottatt: 14. august 2015. Godkjent: 21 oktober 2015; Publisert: 06.11.2015

Copyright: © 2015 Gu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Kina er et av landene med høyest forekomst av magekreft og står for over 40% av alle nye tilfeller på verdensbasis [1,2]. Til tross for aggressiv behandling, tenderer prognose av avansert magekreft i Kina for å være sturen [3,4]. I dag er tumor-node-metastaser (TNM) staging system of the Union for International Cancer Kontroll /amerikanske Joint Committee on Cancer (UICC /AJCC) den viktigste prognostiske faktoren for magekreft [5]. Imidlertid, fordi det er heterogenitet på molekylært nivå av magekreft, er det ikke tilstrekkelig å bare stole på TNM trinn for å forutsi den prognose av magekreft [6]. Derfor er identifiseringen av molekylære markører som er prediktive for magekreft aggressivitet og prognose for pasienten som supplerende til TNM stadium har potensiale til å forbedre evnen til å behandle pasienter og kan gi klinisk relevante innsikt av betydning i sykdomshåndtering. I tillegg velger de pasienter som kan ha nytte størst fra presisjon behandling er tenkt som den beste metoden for å redusere dødelighet av magekreft med unntak for kirurgi.

microRNAs (mirnas) er små endogene 19-25 nukleotider ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon stolpe transkripsjonelt gjennom baseparring med det 3'-ikke-translaterte området (3'-UTR) av mål messenger RNA (mRNA), som resulterer i mRNA degradering eller inhibering av translasjon [7]. I mange humane kreftformer, kan mirnas fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener for å undertrykke oversettelse eller indusere mRNA degradering avhengig av arten av sine mål [8]. Tidligere studier viste at uttrykket av MIR-137 er nedregulert og regnes som en prognostisk markør i ulike typer kreft, inkludert lungekreft [9], tykktarmskreft [10], eggstokkreft [11], multippelt myelom [12] , gastrointestinal stromal tumor [13], glioblastom [14], og plateepitelkarsinom i hode og hals [15]. Det ble nylig vist at MIR-137-ekspresjon ble betydelig redusert i magekreft vev, og det var undertrykkelse samtidig med alvorlighetsgraden av patologiske forandringer, noe som antyder den potensielle tumor suppressor rolle MIR-137 i magekreft [16]. Imidlertid har en omfattende analyse av uttrykket av MIR-137 i korrelert til prognose av magekreftpasienter ikke utført og avventer ytterligere forklaring.

Prinsippet Målet med denne forskningen er å evaluere forholdet mellom uttrykket av MIR -137 og total overlevelse av magekreftpasienter i et forsøk på å identifisere den prognostisk betydning MIR-137 uttrykk. Resultatene av denne studien utstillingen at ekspresjonsnivået av MIR-137 var nedregulering i mage kreft celler og vev, og MIR-137 ekspresjon var et uavhengig prognostisk indikator for magekreft.

Materialer og Metoder

Etikk uttalelse

Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University og The Affiliated Hospital of Yan'an University (Shanxi-provinsen i Kina). Alle deltakerne i studien, eller deres verge, forut informert skriftlig samtykke før studere innmelding.

Cell kultur

udødelig normale menneskelige mage epiteliale cellelinje GES-en og fem menneskelige mage kreft cellelinjer, inkludert MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, og AGS, ble hentet direkte fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle disse cellene ble rutinemessig dyrket og opprettholdt i RPMI-1640 (Gibco) dyrkningsmedium supplementert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktet inkubator celle med en atmosfære av 5% CO _2.

kliniske prøver

Frisk med adenokarsinom i vev og tilstøtende normalt vev ble samlet inn fra to uavhengige sett bestående av 154 pasienter med adenokarsinom i ventrikkel. Alle pasientene som deltok i denne studien var gjennomgikk radikal gastrektomi (R0 reseksjon henhold til UICC /AJCC og D2 lymphadenectomy). Eksemplarer av treningssett (n = 67) ble oppnådd mellom januar 2005 og desember 2009 fra The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (Shanxi-provinsen, Kina), og eksemplarer av valideringssettet (n = 87) ble oppnådd mellom januar 2008 og desember 2010 fra The Affiliated Hospital of Yan'an University (Shanxi-provinsen i Kina). Prøvene ble flash-frosset i flytende nitrogen inntil bruk. Prøvene ble vurdert på nytt av to patologer uavhengig, og scenen av magekreft er klassifisert i henhold til TNM stadium system av UICC /AJCC [5]. Pasienter ble ekskludert dersom de hadde tidligere vært utsatt for noen målrettet terapi, strålebehandling, kjemoterapi og /eller intervensjon terapi for magekreft.

QRT-PCR

Total RNA inneholder miRNA ble ekstrahert fra dyrket celler eller vev ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA ble syntetisert ved hjelp miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) etter produsentens anvisninger. Revers transkripsjon ble gjennomført ved bruk av 50 ng total RNA med en primer spesifikk for MIR-137, sammen med SYBR Grønn mikroRNA revers transkripsjon kit. mirnas ble kvantifisert ved hjelp av SYBR Grønn miRNA QRT-PCR-analyse i henhold til produsentens protokoll (Applied BioSystems). Den QRT-PCR reaksjonen ble utført på en 7500 Fast Real-time System (Applied Biosystems). Alle kvantitative RT-PCR ble utført in triplo. Dataene ble analysert ved anvendelse av en automatisert grunnlinjen. Terskelen syklus (Ct) ble definert som den fraksjonelle syklus nummeret som fluorescensen overskredet en gitt terskelverdi. Resultatene oppnådd fra de QRT-PCR-data ble analysert ved bruk av ΔΔCt metode (2 ^{ΔΔCt). PCR-primere sett som brukes her for MIR-137 ble konstruert som følger: MIR-137 forover primer: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ', og revers primer: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6 ble anvendt som en intern kontroll, og amplifisert med forover-primer: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ', og revers primer: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.}

Statistisk analyse

Statistisk analyse var utføres ved hjelp av GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) og SPSS 19,0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Den total overlevelse ble definert som tiden mellom den første dagen av diagnose og dato for kreft-relaterte dødsfall eller siste oppfølging besøk. Pearsons χ ^{2 eller Fishers eksakte test ble brukt for å analysere forholdet mellom Mir-137 uttrykk og clinicopathological faktorer. Akkumulert overlevelse ble beregnet ved Kaplan-Meier metoden og forskjellene mellom undergruppene ble undersøkt av log-rank test. Tall i fare ble beregnet for begynnelsen av hver periode. Den prognostiske verdien av MIR-137 ble bestemt ved univariat og multivariat analyse. Alle P-verdiene var tosidig, og P < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant}

Resultater

Expression analyse av MIR-137 i menneskelige mage kreftceller

For. å fastslå uttrykk nivået av MIR-137 i menneskelige mage kreftceller, må vi først evalueres Mir-137 uttrykk ved QRT-PCR i udødelig normal menneskelig gastrisk epitelial cellelinje GES-en og fem menneskelige mage kreft cellelinjer, inkludert MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, og AGS. Som vist i figur 1 A, de humane magecancerceller uttrykte betydelig lavere nivåer av MIR-137 enn GES-1. Sammen er disse observasjoner tyder på at MIR-137 uttrykk er redusert i magekreftceller sammenlignet med den udødelig normalt humant gastrisk epitelcelle, og redusert MIR-137 ekspresjon kan være relatert til onkogenesen av magekreft.

Associations mellom MIR-137 uttrykk og clinicopathologic faktorer

uttrykk nivåer av MIR-137 ble videre målt til å analysere forholdet clinicopathologic faktorer. Pasientene ble delt i høy og lav ekspresjon gruppe i henhold til forholdet mellom deres normale vev /cancer median ekspresjonsnivåer av MIR-137 ifølge resultatene av QRT-PCR (cut-off-forhold = 1,5). Og ifølge kriteriet, ca 56,72% (Training sett, 38 av 67) og 49,43% (Validation innstilt, 43 av 87) svulster ble scoret så lavt Mir-137 uttrykk. Som vist i tabell 1, ble ekspresjonen av MIR-137 signifikant assosiert med tumorcelledifferensiering (P = 0,009 og P = 0,002, respektivt), N-trinn (P = 0,019 og P < 0,001, respektivt), og TNM trinn (P = 0,007 og P = 0,007, respektivt) i de to uavhengige sett. I tillegg, i treningssettet, MIR-137-ekspresjon ble også signifikant relatert med T trinn (P = 0,002). Dessuten prosent av pasienter med lav Mir-137 uttrykk økt sammen med sykdomsprogresjon fra TNM stadium I til III i de to uavhengige sett (figur 1B og 1C).

prognostisk verdi av Mir-137 uttrykk hos pasienter med magekreft

for ytterligere å undersøke den prognostiske verdien av Mir-137 uttrykk i magekreftpasienter, sammenlignet vi total overlevelse i henhold til Mir-137 uttrykk, og Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført. Som vist i figur 2, pasienter med lav MIR-137 uttrykk viste signifikant kortere total overlevelse enn de høy seg i de to uavhengige sett (P < 0,001 og P < 0,001, respektivt), noe som indikerte en viktig innvirkning av MIR-137 uttrykk på klinisk utfall i mage kreftpasienter. I tillegg univariate analyser for total overlevelse i denne studien viste at lav Mir-137 uttrykk er en betydelig negativ prognostisk prediktor for pasienter med magekreft i treningssettet (hazard ratio [HR] 6,30 95% KI, 2,17 til 18,27; P = 0,001) og valideringssett (HR 3,74, 95% KI, 1,81 til 7,73; P < 0,001). Dessuten, tumorcelledifferensiering (P = 0,023 og P = 0,048, respektivt), T trinn (P = 0,002 og P = 0,012, respektivt), N-trinn (P = 0,004 og P = 0,001, respektivt), TNM trinn (P < 0,001 og P < 0,001, respektivt) alt også betydelig påvirket overlevelsen av magekreft (tabell 2). Videre ble Cox multivariate regresjonsanalyser utført for å utlede uavhengige risikoestimater knyttet til total overlevelse. Som vist i tabell 3, ble TNM stadium og Mir-137 uttrykk både anerkjent som selvstendige og viktige prognostiske parametre i de to uavhengige sett (Training sett: TNM stadium: HR, 12,83; 95% CI, 3.48 til 47.30, P < 0,001, MIR-137 uttrykk: HR 6,80; 95% KI, 2,06 til 22,48; P = 0,002; Validering satt: TNM stadium: HR 5,21, 95% KI, 2,04 til 13,31; P = 0,001; Mir-137 uttrykk: HR, 2,41; 95% CI, 1.13 til 5.11,. P = 0,023, henholdsvis)

Stratifisert analyse på TNM stadium

For å finne ut om Mir-137 uttrykk kan stratifisere pasienter med forskjellig TNM stadium stratum, vi gjorde lagdelte analyser av magekreftpasienter med TNM stadium i + II og TNM stadium III og evaluert den prognostiske verdien av Mir-137 uttrykk i de to uavhengige sett hhv. Som angitt i tabell 4, bare mage kreftpasienter med TNM stadium III kan bli stratifisert etter Mir-137 uttrykk betydelig, prognosen for TNM stadium III mage kreftpasienter med høy Mir-137 uttrykk var betydelig bedre enn de med lav MIR-137 uttrykk i de to uavhengige sett (Training sett: P = 0,006, Validering satt: P = 0,016, henholdsvis figur 3).

Diskusjoner

Kina er fortsatt et av de landene med høyest forekomst av magekreft selv om det i mange industrialiserte land har gått ned i løpet av de siste tiårene, og avansert stadium sykdommen allerede er tilstede i de aller fleste pasientene [1,2,4]. Foreløpig er TNM staging system for UICC /AJCC den viktigste prognostiske faktoren for magekreft [5]. Imidlertid, fordi det er heterogenitet på molekylært nivå av magekreft, er det ikke tilstrekkelig å bare stole på TNM trinn for å forutsi den prognose av magekreft [6,17]. Derfor identifisering av molekylære markører som er prediktive for magekreft aggressivitet og prognose for pasienten som supplerende til TNM stadium har potensial til å forbedre evnen til å håndtere pasienter, og vil kunne gi viktige klinisk relevante innsikt i sykdomsbehandling. I tillegg velger de pasienter som kan ha nytte størst fra presisjon behandling og målrettet terapi er tenkt som den beste metoden for å redusere dødeligheten av magekreft. Forskning om forholdet mellom mirnas og magekreft har etter hvert fått oppmerksomhet fra forskere i generell kirurgi feltet, og denne forskningen er blitt et viktig forskningstema i de senere år [7]. I denne studien, vurderte vi uttrykket nivået av MIR-137 i humane mage kreft cellelinjer med kvantitativ real-time PCR, resultatene viste at den menneskelige mage kreftceller, inkludert MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803, og AGS, uttrykt signifikant lavere nivåer av MIR-137 enn GES-1, som er en immortalisert normal human gastrisk epitelcellelinje. Dette resultat indikerte at unormale MIR-137 ekspresjon kan være relatert til onkogenesen av magekreft. Men avklare den underliggende mekanismen for feilregulering av MIR-137 i mage kreft celler og vev venter videre etterforskning.

Samme med de andre mirnas, det har blitt rapportert at MIR-137 ble nært forbundet med dannelse og utvikling av kreft hos mennesker [8,18]. Som viktige komponenter av genregulering i mange humane kreftceller, kan MIR-137 regulere forskjellige gener og påvirke deres funksjoner i mange cellulære veier. Celleproliferasjon og migrasjon av brystkreft kan bli undertrykt av MIR-137 ved å undertrykke østrogen relaterte reseptor a (Erra) [19]. Mens i kolorektal kreft celler, svangerskap utenfor Mir-137 uttrykk også kunne arrestere cellesyklus, undertrykke cellevekst, og hemmer celle invasjon gjennom målretting celledeling kontroll protein 42 homolog (Cdc42) [20]. Nylig, Wu et al. indikerte at MIR-137 er handlet som tumor suppressor på mage kreftceller ved å målrette akt2 og videre påvirker Bad og GSK-3β, og potensielt involvert i tumordannelse og metastasering av magekreft [16]. Zheng og hans kolleger vist at ektopisk uttrykk for MIR-137 var tilstrekkelig til å hemme magekreft celleproliferasjon [21]. I tillegg Steponaitiene R et al. utstilt at MIR-137 metylering er en hyppig hendelse i gastrointestinal kreft som oppstår tidlig i trinnvis i løpet av magekreftutvikling og omvendt korrelert med global metylering [22]. De ovennevnte undersøkelser bekreftet at MIR-137 spiller en rolle som er lik tumor suppressor mirnas. Men alle disse forskere hovedsakelig utført i magecancercellelinjer, er ikke fastslått at forholdet mellom ekspresjonsnivået av MIR-137 og de kliniske karakteristiske faktorer for pasienter med magekreft. I den foreliggende forskning, evaluerte vi assosiasjonen mellom ekspresjonen av MIR-137 og prognosen for pasienter med magekreft etter radikal gastrektomi, og fant at MIR-137 ekspresjon var et uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse av disse pasientene i tillegg til TNM stadium , og prognosen for pasienter med lav Mir-137 uttrykk var betydelig dårligere enn de med høy. Så vidt vi vet, er dette den første studien å identifisere Mir-137 uttrykk som en selvstendig dårlig prognostisk faktor for total overlevelse av mage kreftpasienter etter radikal gastrektomi. Basert på denne tilstanden, bruk den prognostiske verdien av Mir-137 uttrykk for TNM stadium III gruppen viste en bedre risikovurderingen av total overlevelse hos pasienter med sent stadium magekreft. Imidlertid bør potensialet endring av klinisk praksis bli validert i en randomisert kontrollert studie i fremtiden.

Til dags dato, siden mirnas representerer en ny hotspot for kreftforskning, det er en økende interesse med hensyn til miRNA svar miljømessige eksponeringer og livsstil, inkludert sosial status, levekår og livsstil atferd, som for eksempel røyking og alkoholforbruk. Stánitz E et al. viste at MIR-21 og MIR-143 var oppregulert, og MIR-34a ble nedregulert i prøver av magekreft i vestlige land [23]. I lys av disse forholdene, enten MIR-137 underexpression er også observert i magekreft prøver av pasienter fra vestlige land må vurderes i fremtiden. I tillegg kan magekreft av den samme histopatologien fra forskjellige geografiske region befolkning viser differensial mirnas og protein uttrykk mønstre, noe som kan resultere fra tilstedeværelsen av ulike risikofaktorer for kreftutvikling.

Det er flere begrensninger i denne studien. For det første er denne studien begrenset av den retrospektive natur analyse og utvalgsskjevheter kan ikke være helt eliminert selv om vi samlet inn data fra en prospektiv opprettholdt database. For det andre, det var heterogenitet i tersklene som brukes til å bestemme cutoff av MIR-137 uttrykk i denne forskningen. ble den mest konsekvent brukt, men en rekke forskjellige terskler er blitt rapportert medianverdier. Tredje, det er ikke inkludert data for sykdomsfri overlevelse i denne studien. Det er mange faktorer, som for eksempel en oppfølgingsundersøkelse og postoperativ behandling, kan ha innflytelse på sykdomsfri overlevelse. Og sykdomsfri overlevelse data skal samles i fremtiden forskere. Til slutt, det antall pasienter inkludert i denne studien er forholdsvis liten. Store prospektive randomiserte kontrollerte kliniske studier er nødvendig for å identifisere prognostiske verdien av Mir-137 uttrykk i pasienter med magekreft.

I sammendraget, resultatene av denne studien viser at MIR-137 er en lovende markør for å forutsi den totale overlevelsen av pasienter med magekreft etter radikal gastrektomi. Dessuten kan disse TNM stadium III mage kreftpasienter med lav Mir-137 uttrykk trenger mer aggressiv postoperativ behandling og tettere oppfølging.

• PLoS ONE: Betydningen av Serum Pepsinogens som en biomarkør for magekreft og atrofisk gastritt resirkulering: en systematisk oversikt og meta-analyse
• PLoS ONE: deregulert Expression of SRC, LYN og CKB kinaser av DNA Metylering og dens potensielle rolle i Gastric Cancer Invasivitet og metastase