A desregulação do miR-137 desempenha um papel vital na oncogênese e progressão de vários tipos de câncer, mas seu papel no prognóstico dos pacientes com câncer gástrico permanece desconhecida. Este estudo foi desenhado para investigar a expressão e significado prognóstico de miR-137 em pacientes com câncer gástrico após gastrectomia radical. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada para avaliar a expressão de miR-137 em linhas celulares de cancro gástrico humano e tecidos em pacientes com adenocarcinoma gástrico. Os resultados foram avaliados para associação com fatores clínicos e sobrevida global por meio de análise de Kaplan-Meier. Os valores prognósticos de miR-137 de expressão e os resultados clínicos foram avaliados por análise de regressão de Cox. Os resultados apresentaram que o nível de expressão de miR-137 foi diminuída em linhas celulares de cancro gástrico humano e tecidos, e regulados negativamente a expressão de miR-137 foi associada com a diferenciação de células de tumor, estádio N, e fase TNM. Diminuição da expressão de miR-137 em tecidos de câncer gástrico foi positivamente correlacionada com pior sobrevida global de pacientes com câncer gástrico. Outras análises de regressão Cox multivariada sugeriu que a expressão de miR-137 era um indicador prognóstico independente para câncer gástrico, exceto para estágio TNM. Aplicando o valor prognóstico da expressão de miR-137 para o estágio TNM III grupo mostrou uma melhor estratificação de risco para a sobrevida global. Em conclusão, os resultados reforçaram o papel crítico para o miR-137-expressão regulada para baixo no cancro gástrico e sugeriu que a expressão de miR-137 poderia ser um indicador de prognóstico para a doença. Além disso, esses pacientes com câncer gástrico estágio TNM III e baixa expressão de miR-137 pode precisar de tratamento pós-operatório mais agressivo e mais follow-up
Citation:. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye, Shi S, Nian Y (2015) Importância clínica de miR-137 Expressão em pacientes com câncer gástrico Após Radical Gastrectomia. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10.1371 /journal.pone.0142377
editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO
Recebido: 14 Agosto, 2015; Aceito: 21 de outubro de 2015; Publicação: 06 de novembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Gu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a China é um dos países com a maior incidência de câncer gástrico e é responsável por mais de 40% de todos os novos casos em todo o mundo [1,2]. Apesar da terapia agressiva, o prognóstico do cancro gástrico avançado na China tende a ser lúgubre [3,4]. Actualmente, tumor-nódulo-metástase (TNM) sistema de estadiamento da União para Comissão Mista de Controle do Câncer Internacional /American do Cancro (UICC /AJCC) é o mais importante fator prognóstico para câncer gástrico [5]. No entanto, porque existe uma grande heterogeneidade no nível molecular do cancro gástrico, é insuficiente para confiar apenas na fase TNM para predizer o prognóstico do cancro [6] gástrico. Portanto, a identificação dos marcadores moleculares, que são preditivos da agressividade cancro gástrico e prognóstico do paciente como complementar a fase TNM tem o potencial para melhorar a capacidade de tratar pacientes e pode fornecer informações clinicamente relevantes de importância para a gestão da doença. Além disso, a seleção de pacientes que poderiam se beneficiar do tratamento maior precisão é considerada como o melhor método para reduzir as taxas de mortalidade de câncer gástrico, exceto para a cirurgia.
Os microRNAs (miRNAs) são pequenas endógenos 19-25 nucleotídeos os ARN que regulam a expressão de genes transcricionalmente pós através de emparelhamento de bases com a região 3 'não traduzida (3'-UTR) de ARN mensageiro (ARNm alvo) não-codificante, o que resulta na degradação do mRNA ou a inibição da tradução [7]. Em muitos cancros humanos, miARN pode funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumores para suprimir a tradução ou a degradação de ARNm induzir dependendo da natureza dos seus objectivos em [8]. Anteriormente estudos demonstraram que a expressão de miR-137 é regulada para baixo e considerado como um marcador de prognóstico em vários tipos de cancro, incluindo cancro do pulmão [9], o cancro colorrectal [10], do cancro do ovário [11], mieloma múltiplo [12] , tumor estromal gastrointestinal [13], glioblastoma [14], e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço [15]. Recentemente, foi demonstrado que a expressão de miR-137 foi significativamente diminuída em tecidos de cancro gástrico, e a supressão foi simultaneamente com a gravidade das alterações patológicas, sugerindo o potencial papel de supressor de tumor do miR-137 em cancro gástrico [16]. No entanto, uma extensa análise da expressão de miR-137 em correlação com o prognóstico de pacientes com câncer gástrico não foi executado e aguarda elucidação.
O objectivo principal desta pesquisa é avaliar a relação entre a expressão de miR 137 e sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico em um esforço para identificar o significado prognóstico da expressão de miR-137. Os resultados deste estudo mostra que o nível de miR-137 expressão era a regulação negativa em células cancerosas gástricas e tecidos, e miR-137 expressão era um indicador prognóstico independente para câncer gástrico.
Ética declaração
Este estudo foi analisado e aprovado pelo Institutional Review Board of The Second Hospital Filiado de Xi'an Jiaotong University e The Hospital Afiliado da Universidade de Yan'an (província de Shanxi, China). Todos os participantes do estudo, ou seu responsável legal, desde o consentimento informado por escrito antes da participação no estudo.
gástrica linha de células epiteliais humanas GES-1 e cinco linhas celulares de cancro imortalizadas normais humanos gástricas, incluindo MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, e AGS, foram obtidas diretamente do Shanghai Cell Bank da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas estas células foram rotineiramente cultivadas e mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco) meio de cultura suplementado com soro fetal de bovino 10% (Invitrogen) a 37 ° C numa incubadora humidificada de células com uma atmosfera de 5% de CO 2. espécimes clínicos tecidos de adenocarcinoma gástrico frescas e tecidos normais adjacentes foram coletados a partir de dois conjuntos independentes, compreendendo 154 pacientes com adenocarcinoma gástrico. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a gastrectomia radical (R0 ressecção de acordo com a UICC /AJCC e linfadenectomia D2). Espécimes de conjunto de treinamento (n = 67) foram obtidos entre janeiro de 2005 e dezembro de 2009 a partir da segunda Hospital Filiado de Xi'an Jiaotong University (província de Shanxi, China) e espécimes de conjunto de validação (n = 87) foram obtidos entre janeiro de 2008 e dezembro de 2010 de O Hospital Afiliado da Universidade de Yan'an (província de Shanxi, China). As amostras foram rapidamente congeladas em azoto líquido até à sua utilização. Os espécimes foram reavaliados por dois patologistas de forma independente, eo estágio do câncer gástrico é classificada de acordo com o sistema de estágio TNM do UICC /[5] AJCC. Os pacientes foram excluídos se tivessem sido previamente expostos a qualquer terapia-alvo, radioterapia, quimioterapia e /ou terapia de intervenção para o câncer gástrico. O RNA total contendo miRNA foi extraído de cultura células ou tecidos utilizando miRNeasy Mini Kit (Qiagen). O ADNc foi sintetizado utilizando miScript Transcrição Reversa Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando 50 ng de ARN total com um iniciador específico para miR-137, em conjunto com o kit de transcrição reversa SYBR Green microARN. miARNs foram quantificados usando o ensaio de SYBR Green miARN qRT-PCR de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems). A reacção de qRT-PCR foi realizada em um Fast System 7500 em tempo real (Applied Biosystems). Todas as RT-PCR foram realizadas em triplicado. Os dados foram analisados utilizando uma linha de base automatizada. O ciclo limiar (Ct) foi definido como o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência excedeu o limiar determinado. Os dados obtidos a partir de qRT-PCR foram analisados utilizando o método ΔΔCt (2 ΔΔCt). Os conjuntos de iniciadores de PCR utilizados aqui para miR-137 foi concebido da seguinte forma: o miR-137 para a frente de iniciadores: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ', e o iniciador reverso: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6 foi usado como um controle interno e amplificado com iniciador directo: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 'e iniciador inverso: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'. A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA) e SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). A sobrevida global foi definido como o tempo entre o primeiro dia do diagnóstico ea data de morte relacionada ao câncer ou a última visita de acompanhamento. χ de Pearson 2 ou teste exato de Fisher foi utilizado para analisar a relação entre o miR-137 expressão e fatores clínico-patológicos. as taxas de sobrevivência cumulativos foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças entre os subgrupos foram analisados pelo teste de log-rank. Números em risco foram calculados para o início de cada período de tempo. O valor prognóstico da expressão de miR-137 foi determinada por análise uni e multivariada. Todos os valores de P foram frente e verso, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo Resultados Análise da expressão de miR-137 em células cancerosas gástricas humanas A fim. para verificar o nível de miR-137 de expressão em células de cancro gástrico humano, que numa primeira fase, o miR-137 de expressão por qRT-PCR em linha humano normal imortalizada gástrica célula epitelial GES-1 e cinco linhas celulares de cancro gástrico humano, incluindo MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, e AGS. Como mostrado na Fig 1A, as células gástricas humanas cancerosas expressaram níveis significativamente mais baixos de miR-137 que GES-1. Colectivamente, estas observações sugerem que a expressão de miR-137 é reduzida em células de cancro gástrico em comparação com a célula humana normal imortalizada gástrica epitelial, e diminuíram o miR-137 de expressão pode estar relacionada com a oncogénese do cancro gástrico. Os níveis de miR-137 de expressão foram ainda medidos para analisar sua relação com fatores clínico-patológicas. Os pacientes foram divididos em grupo de alta e baixa expressão de acordo com a relação dos seus níveis de expressão de tecido de cancro normais /mediana de miR-137 de acordo com os resultados de qRT-PCR (cut-off proporção = 1,5). E de acordo com o critério, cerca de 56,72% (conjunto de treinamento, 38 de 67) e 49,43% (Validação definido, 43 de 87) tumores foram classificados como baixa expressão de miR-137. Como mostrado na Tabela 1, a expressão de miR-137 foi significativamente associado com a diferenciação de células de tumor (P = 0,009 e P = 0,002, respectivamente), estádio N (P = 0,019 e P < 0,001, respectivamente), e fase TNM (P = 0,007 e P = 0,007, respectivamente), nos dois conjuntos independentes. Além disso, no conjunto de treinamento, miR-137 expressão também foi significativamente relacionado com o estádio T (P = 0,002). Além disso, a percentagem de pacientes com baixa expressão de miR-137 aumentou acompanhada com a progressão da doença a partir da fase I a III TNM nos dois conjuntos independentes (Figura 1B e 1C). para investigar mais o valor prognóstico do miR-137 expressão em pacientes com câncer gástrico, comparamos a sobrevida global de acordo com o miR-137 expressão e análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada. Como mostrado na Figura 2, os pacientes com baixa expressão de miR-137 mostraram sobrevivência global significativamente mais curtos do que aqueles elevados nos dois conjuntos independentes (P < 0,001 e P < 0,001, respectivamente), o que indica um impacto fundamental de miR-137 expressão em o resultado clínico em pacientes com câncer gástrico. Além disso, análises univariada para sobrevida global neste estudo exibiu que a baixa expressão de miR-137 é um preditor prognóstico negativo significativo para os pacientes com câncer gástrico no conjunto de treinamento (hazard ratio [HR], 6,30; IC 95%, 2,17-18,27; P = 0,001) e conjunto de validação (HR, 3,74; IC 95%, 1,81-7,73; P < 0,001). Além disso, a diferenciação das células do tumor (P = 0,023 e P = 0,048, respectivamente), estágio T (P = 0,002 e P = 0,012, respectivamente), estádio N (P = 0,004 e P = 0,001, respectivamente), fase TNM (P < 0,001 e P < 0,001, respectivamente) tudo também afectou significativamente a sobrevivência do cancro gástrico (Tabela 2). Além disso, foram realizadas análises de regressão multivariada de Cox para derivar estimativas de risco independentes relacionados à sobrevida global. Como mostrado na Tabela 3 seguinte, estágio TNM e miR-137 expressão foram ambos reconhecidos como parâmetros independentes e significativos prognósticos em dois conjuntos independentes (conjunto de treinamento: estágio TNM: HR, 12,83; IC 95%, 3,48 a 47,30; P < 0,001; miR-137 expressão: HR, 6,80; IC 95%, 2,06-22,48; P = 0,002; Validação definido: TNM fase: HR, 5,21; IC 95%, 2,04-13,31; P = 0,001; miR-137 expressão: HR, 2,41; IC 95%, 1,13-5,11;. P = 0,023, respectivamente) a análise estratificada no palco TNM para determinar se miR-137 expressão poderia estratificar pacientes com estágio diferente TNM estrato, fizemos análises estratificadas de pacientes com câncer gástrico em estágio TNM I + II e fase III TNM e avaliaram o valor prognóstico de miR-137 expressão nos dois conjuntos independentes respectivamente. Como listado na Tabela 4, apenas os pacientes com câncer gástrico em estágio TNM III poderia ser estratificada por expressão de miR-137 significativamente, o prognóstico do estágio TNM III pacientes com câncer gástrico com alta expressão de miR-137 foi significativamente melhor do que aqueles com baixa miR-137 expressão nos dois conjuntos independentes (conjunto de treinamento: P = 0,006, Validação definido: P = 0,016, respectivamente; Fig 3). Discussão a China ainda é um dos países com maior incidência de câncer gástrico, embora que em muitas nações industrializadas tem diminuído nas últimas décadas, ea doença estágio avançado já presente na grande maioria dos pacientes [1,2,4]. Atualmente, TNM sistema de estadiamento da UICC /AJCC é o mais importante fator prognóstico para câncer gástrico [5]. No entanto, porque existe uma grande heterogeneidade no nível molecular do câncer gástrico, é insuficiente para confiar apenas no estágio TNM para prever o prognóstico de câncer gástrico [6,17]. Portanto, a identificação dos marcadores moleculares, que são preditivos da agressividade cancro gástrico e prognóstico do paciente como complementar a fase TNM tem o potencial para melhorar a capacidade de gerir os doentes e poderia proporcionar conhecimentos importantes clinicamente relevantes para o tratamento da doença. Além disso, a seleção de pacientes que poderiam se beneficiar do tratamento maior precisão e terapias-alvo é pensado como o melhor método para reduzir as taxas de mortalidade de câncer gástrico. Pesquisa sobre a relação entre miRNAs e câncer gástrico gradualmente ganhou a atenção de pesquisadores no campo cirurgia geral, e esta pesquisa tornou-se um tema de pesquisa importante nos últimos anos [7]. No presente estudo, foi avaliado o nível de miR-137 expressão em linhas celulares de cancro gástrico humano com quantitativa PCR em tempo real, os resultados apresentaram que as células cancerosas gástricas humanas, incluindo MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803, e AGS, expressaram níveis significativamente mais baixos de miR-137 que GES-1, que é uma linha celular imortalizada humana normal epiteliais gástricas. Este resultado indicou que a expressão de miR-137 anormal pode estar relacionada com a oncogénese do cancro gástrico. No entanto, clarificar o mecanismo subjacente da desregulação do miR-137 em células cancerosas gástricas e tecidos aguarda uma investigação mais aprofundada. Mesmo com os outros miRNAs, foi relatado que o miR-137 foi estreitamente relacionado com a formação e desenvolvimento dos cancros humanos [8,18]. Como componentes importantes de regulação gênica, em muitas células cancerosas humanas, miR-137 poderia regular diferentes genes e influenciar as suas funções em muitas vias celulares. A proliferação celular e migração de cancro da mama pode ser suprimida por miR-137 por supressão relacionada um receptor de estrogénio (Erra) [19]. Enquanto, em células de cancro colorectal, ectópica expressão de miR-137 também poderia paragem do ciclo celular, reprimir o crescimento de células e inibir a invasão celular através da segmentação proteína de controlo de divisão celular homólogo de 42 (Cdc42) [20]. Recentemente, Wu et ai. indicou que o miR-137 é actuado como supressor de tumor em células de cancro gástrico por segmentação AKT2 e ainda afectar a GSK-3β e Bad, e potencialmente envolvido na tumorigénese e metástases de cancro gástrico [16]. Zheng e seus colegas demonstraram que a expressão ectópica de miR-137 foi suficiente para inibir a proliferação de células de cancro gástrico [21]. Além disso, Steponaitiene R et al. exibiu que o miR-137 metilação é um evento freqüente em cancros gastrointestinais que ocorre no início de forma gradual durante a carcinogênese gástrica e inversamente correlacionada com a metilação mundial [22]. Os estudos acima mencionados confirmou que o miR-137 desempenha um papel que é semelhante ao miARNs supressores de tumores. No entanto, todas estas pesquisas são efectuadas principalmente nas linhas celulares de cancro gástrico, a relação entre o nível de miR-137 e os factores clínicos característicos de doentes com cancro gástrico expressão não foi estabelecida. Na presente pesquisa, avaliou-se a associação entre a expressão de miR-137 e prognóstico de pacientes com câncer gástrico após gastrectomia radical, e descobriram que miR-137 expressão era um fator prognóstico independente para a sobrevida global desses pacientes, além de estágio TNM e o prognóstico dos pacientes com baixa expressão de miR-137 foram significativamente pior do que aqueles com alta. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para identificar a expressão de miR-137 como um fator de prognóstico independente para a sobrevida global de pacientes com câncer gástrico seguinte gastrectomia radical. Com base nesta condição, aplicando-se o valor prognóstico da expressão de miR-137 para o estágio TNM III grupo mostrou uma melhor estratificação de risco para a sobrevida global em pacientes com câncer gástrico em estágio final. No entanto, a mudança potencial da prática clínica deve ser validado em um estudo randomizado controlado no futuro. Até o momento, já que miRNAs representam um hotspot emergente de pesquisa sobre o câncer, há um interesse crescente no que diz respeito às respostas miRNA às exposições ambientais e estilo de vida, incluindo status social, condições de vida e comportamentos de estilo de vida, como tabagismo e consumo de álcool. Stanitz E et al. mostraram que miR-21 e miR-143 foram regulados positivamente, e miR-34a foi regulada para baixo em amostras de câncer gástrico em países ocidentais [23]. À luz destas condições, se o miR-137 subexpressão também é observada em amostras de cancro gástrico em pacientes de países ocidentais tem de ser avaliada no futuro. Além disso, o câncer gástrico do mesmo histopatologia da população diferente de região geográfica poderia mostrar miRNAs diferenciais e padrões de expressão de proteína, o que pode resultar da existência de diferentes fatores de risco de carcinogênese. Existem várias limitações deste estudo. Em primeiro lugar, este estudo é limitado pela natureza retrospectiva da análise e os vieses de seleção não pode ser totalmente eliminado, embora nós recolhidos os dados de um banco de dados prospectivamente mantida. Em segundo lugar, houve heterogeneidade nos limiares utilizados para determinar o ponto de corte de expressão de miR-137 nesta pesquisa. foram os mais consistentemente utilizado, no entanto, uma variedade de limiares têm sido relatados os valores medianos. Em terceiro lugar, não é, incluindo os dados de sobrevida livre de doença neste estudo. Existem muitos fatores, tais como os exames de acompanhamento e o tratamento pós-operatório, podem influenciar a sobrevida livre de doença. E os dados de sobrevida livre de doença devem ser recolhidos nas pesquisas futuras. Finalmente, o número de pacientes incluídos neste estudo é relativamente pequena. estudos clínicos randomizados controlados potenciais grandes são necessários para identificar o valor prognóstico do miR-137 expressão em pacientes com câncer gástrico. Em resumo, os resultados deste estudo demonstram que miR-137 é um marcador promissor para predizer a sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico após gastrectomia radical. Além disso, estes estágios TNM III pacientes com câncer gástrico com baixa expressão de miR-137 pode precisar de tratamento pós-operatório mais agressivo e mais follow-up.
qRT-PCR
A análise estatística
As associações entre expressão de miR-137 e fatores clínico-patológicas
valor prognóstico da expressão de miR-137 em pacientes com câncer gástrico
Não tema a colonoscopia
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