PLoS ONE: klinische betekenis van MiR-137 Expression bij patiënten met maagkanker na radicale Gastrectomy

Abstract

De ontregeling van miR-137 speelt een belangrijke rol bij de oncogenese en progressie van verschillende soorten kanker, maar zijn rol bij prognose maagkankerpatiënten blijft onbekend. Deze studie werd ontworpen om de expressie en prognostische betekenis van miR-137 bij maagkanker patiënten na radicale gastrectomie te onderzoeken. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) werd uitgevoerd om de expressie van miR-137 in humane maagkanker cellijnen en weefsels bij patiënten met adenocarcinoom van de maag. De resultaten werden beoordeeld op associatie met klinische factoren en overleving door Kaplan-Meier-analyse. Prognostische waarde van miR-137 expressie en klinische resultaten werden beoordeeld door Cox regressie-analyse. De resultaten vertoonden dat de expressie van miR-137 was verlaagd bij menselijke maagkanker cellijnen en weefsels en down-gereguleerde expressie van miR-137 werd geassocieerd met tumorcel differentiatie, N-stadium, en TNM. Verminderde miR-137 expressie bij maagkanker weefsels werd positief gecorreleerd met een slechte algehele overleving van maagkankerpatiënten. Verdere multivariate Cox regressie-analyse suggereerde dat miR-137 expressie was een onafhankelijke prognostische indicator voor maagkanker, behalve voor TNM stadium. Het toepassen van de prognostische waarde van miR-137 expressie TNM stadium III groep toonde een betere risicostratificatie voor de algehele overleving. Samenvattend, de resultaten versterkten de cruciale rol van de downgereguleerde miR-137 expressie in maagkanker en suggereerde dat miR-137 expressie een prognostische indicator voor deze ziekte zijn. Daarnaast kunnen deze patiënten met TNM stadium III maagkanker en lage miR-137 expressie meer agressieve postoperatieve behandeling en dichter follow-up nodig

Visum:. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye, Shi S, Nian Y (2015) klinische betekenis van MiR-137 Expression bij patiënten met maagkanker na radicale Gastrectomie. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10.1371 /journal.pone.0142377

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medische Universiteit, JAPAN

Ontvangen: 14 augustus 2015; Aanvaard: 21 oktober 2015; Gepubliceerd: 6 november 2015

Copyright: © 2015 Gu et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

financiering:.. de auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

China is een van de landen met de hoogste incidentie van maagkanker en is goed voor meer dan 40% van alle nieuwe gevallen wereldwijd [1,2]. Ondanks agressieve therapie, de prognose van gevorderde maagkanker in China heeft de neiging sombere [3,4] te zijn. Op dit moment, tumor-node-metastase (TNM) staging-systeem van de Unie voor Internationale Kanker Controle /Amerikaanse Joint Committee on Cancer (UICC /AJCC) is de belangrijkste voorspellende factor voor maagkanker [5]. Omdat er heterogeniteit op moleculair niveau van maagkanker is onvoldoende om alleen vertrouwen op TNM de prognose maagkanker [6] voorspellen. Daarom is de identificatie van moleculaire merkers die voorspellend maagkanker agressiviteit en prognose voor de patiënt als een aanvulling op TNM heeft de potentie om het vermogen om patiënten te verbeteren en kan klinisch relevante inzichten van belang verschaffen in ziektebeheersing. Bovendien, het selecteren van de patiënten die zouden kunnen profiteren grootste nauwkeurigheid van behandeling wordt gezien als de beste methode om de sterftecijfers van maagkanker verlagen behalve chirurgie.

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine endogene 19-25 nucleotiden niet-coderende RNA's die genexpressie reguleren record transcriptioneel tot baseparing met het 3'-ongetranslateerde gebied (3'-UTR) van target messenger RNAs (mRNAs) die resulteert in mRNA afbraak of remming van translatie [7]. In vele menselijke kankers, kan miRNAs functioneren als oncogenen en tumorsuppressorgenen translatie onderdrukken of mRNA degradatie veroorzaken afhankelijk van de aard van hun doelen [8]. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de expressie van miR-137 neerwaarts gereguleerd en beschouwd als een prognostische marker bij verschillende soorten kanker, zoals longkanker [9], colorectale kanker [10], ovariale kanker [11], multiple myeloom [12] , gastro-intestinale stromale tumor [13], glioblastoma [14], en plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en hals [15]. Recent werd aangetoond dat miR-137 expressie was significant verlaagd bij maagkanker weefsels en de onderdrukking werd gelijktijdig met de ernst van pathologische veranderingen, suggereert de potentiële tumor suppressor rol van miR-137 in maagkanker [16]. Er is echter een uitgebreide analyse van de expressie van miR-137 in gecorreleerde om de prognose van maagkanker patiënten niet uitgevoerd en wacht op nadere toelichting.

Het principe doel van dit onderzoek is om de relatie tussen de expressie van miR evalueren -137 en de algehele overleving van maagkanker patiënten in een poging om de prognostische betekenis van miR-137 expressie te identificeren. De resultaten van deze studie tentoonstelling die de expressie van miR-137 was down-regulatie bij maagkanker cellen en weefsels, en miR-137 expressie was een onafhankelijke prognostische indicator voor maagkanker.

Materialen en methoden

Ethics statement

Deze studie werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional review Board van de Tweede Affiliated Hospital van Xi'an Jiaotong University en The Affiliated Hospital van Yan'an University (provincie Shanxi, China) goedgekeurd. Alle deelnemers aan de studie, of hun wettelijke voogd, mits schriftelijke toestemming voorafgaand aan de inschrijving op de hoogte te studeren.

Cell cultuur

Onsterfelijk normale menselijke maag epitheel cellijn GES-1 en vijf menselijke maagkanker cellijnen, waaronder MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803 en AGS, werden direct verkregen van Shanghai Cell Bank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Al deze cellen werden routinematig gekweekt en gehouden in RPMI-1640 (Gibco) kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator cel met een atmosfeer van 5% CO ₂

klinische monsters

Fresh maagdarmkanker weefsels en aangrenzende normale weefsels werden verzameld uit twee onafhankelijke sets bestaande uit 154 patiënten met adenocarcinoom van de maag. Alle patiënten die deelnamen aan deze studie waren ingrijpend gastrectomie (R0 resectie volgens de UICC /AJCC en D2 lymfadenectomie). Exemplaren van de training set (n = 67) werden verkregen tussen januari 2005 en december 2009 uit de Tweede Affiliated Hospital van Xi'an Jiaotong University (provincie Shanxi, China), en exemplaren van de validatie set (n = 87) werden verkregen tussen januari 2008 en december 2010 van de Affiliated Hospital van Yan'an University (provincie Shanxi, China). Monsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof tot gebruik. Monsters werden opnieuw door twee pathologen onafhankelijk en het stadium van maagkanker is geclassificeerd volgens het TNM systeem volgens de UICC /[5] AJCC. Patiënten werden uitgesloten indien zij voorheen blootgesteld aan een gerichte therapie, radiotherapie, chemotherapie en /of interventie therapie voor maagkanker.

qRT-PCR

Totaal RNA bevattende miRNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen of weefsels gebruiken miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA werd gesynthetiseerd met behulp miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant. Reverse transcriptie werd uitgevoerd onder toepassing van 50 ng totaal RNA met een primer specifiek voor miR-137, samen met de SYBR Green microRNA reverse transcriptie kit. miRNAs werden gekwantificeerd met de SYBR Green miRNA qRT-PCR volgens het protocol van de fabrikant (Applied BioSystems). De qRT-PCR reactie werd uitgevoerd op een 7500 Fast Realtime System (Applied Biosystems) uitgevoerd. Alle kwantitatieve RT-PCR's werden uitgevoerd in drievoud. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerd basislijn. De drempelcyclus (Ct) werd gedefinieerd als de fractionele aantal cycli waarbij de fluorescentie boven de bepaalde drempel. De resultaten van de qRT-PCR-gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ΔΔCt methode (2 ^{ΔΔCt). De PCR primers sets hier voor miR-137 is gemaakt als volgt: miR-137 voorwaartse primer: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 'en reverse primer: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6 werd gebruikt als een interne controle en geamplificeerd met voorwaartse primer: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 'en reverse primer: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.}

Statistische analyse

Statistische analyse was uitgevoerd onder toepassing van GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) en SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). De overleving werd gedefinieerd als de tijd tussen de eerste dag van de diagnose en de datum van kanker gerelateerde dood of het laatste follow-up bezoek. Pearson χ ^{2 of Fisher's exact test werd gebruikt om de relatie tussen miR-137 expressie en clinicopathologische factoren te analyseren. De cumulatieve overlevingskansen werden berekend door Kaplan-Meier-methode en de verschillen tussen de subgroepen werden onderzocht door de log-rank test. Nummers risico werden berekend voor het begin van elke periode. De prognostische waarde van miR-137 expressie werd bepaald door univariate en multivariate analyse. Alle P-waarden waren met twee kanten, en P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant te zijn}

Resultaten

Expressie analyse van miR-137 in menselijke maagkanker cellen

Met het oog. het expressieniveau van miR-137 bepalen in menselijke maagkanker cellen, we eerst geëvalueerd miR-137 expressie door qRT-PCR geïmmortaliseerde normale menselijke maag epitheel cellijn GES-1 en vijf menselijke maagkanker cellijnen, waaronder MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803 en AGS. Zoals getoond in figuur 1A, de menselijke maagkanker cellen brachten significant lagere niveaus van miR-137 dan GES-1. Tezamen suggereren deze waarnemingen dat miR-137 expressie is verminderd bij maagkanker cellen in vergelijking met normale geïmmortaliseerde humane maag epitheelcellen en verminderde miR-137 expressie kan worden gerelateerd aan de oncogenese van maagkanker.

Associaties tussen miR-137 expressie en clinicopathologic factoren

De expressie van miR-137 werden verder gemeten om hun relatie met clinicopathologic factoren te analyseren. De patiënten werden verdeeld in hoge en lage expressie groep volgens de verhouding van hun normale /kankerweefsel mediane expressie van miR-137 volgens de resultaten van qRT-PCR (cut-off-verhouding = 1,5). En volgens het criterium, ongeveer 56,72% (Training set, 38 of 67) en 49,43% (validatie set, 43 of 87) tumoren werden gescoord zo laag miR-137 expressie. Zoals getoond in Tabel 1, werd de expressie van miR-137 significant geassocieerd met tumorcel differentiatie (P = 0,009 en P = 0,002, respectievelijk), N-stadium (P = 0,019 en P < 0,001, respectievelijk), en TNM (P = 0,007 en p = 0,007, respectievelijk) in twee onafhankelijke sets. Bovendien, in de training set, miR-137 expressie werd ook significant gerelateerd aan T-stadium (P = 0,002). Daarnaast percentage patiënten met lage miR-137 verhoogde expressie gepaard met ziekteprogressie van TNM stadium I tot III kunnen twee onafhankelijke sets (Figuur 1B en 1C).

Voorspellende waarde van miR-137-expressie bij patiënten met maagkanker

om verder de prognostische waarde van miR-137 expressie bij maagkanker patiënten te onderzoeken, vergeleken we de totale overleving volgens miR-137 expressie en Kaplan-Meier survival analyse werd uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 2, patiënten met lage miR-137 expressie vertoonden significant korter overleving dan hogen in de twee onafhankelijke sets (P < 0,001 en P < 0,001, respectievelijk), die een belangrijke invloed van miR-137 expressie op data klinische uitkomst bij patiënten met maagkanker. Daarnaast univariate analyses voor de totale overleving in deze studie vertoonden dat lage miR-137 expressie is een significante negatieve prognostische predictor voor patiënten met maagkanker in de training set (hazard ratio [HR], 6,30; 95% CI, 2,17-18,27; P = 0,001) en validatie set (HR, 3,74; 95% BI 1,81-7,73; P < 0,001). Daarnaast tumorcel differentiatie (P = 0,023 en P = 0,048, respectievelijk), T-trap (P = 0,002 en P = 0,012, respectievelijk), N-stadium (P = 0,004 en P = 0,001, respectievelijk), TNM (P < 0,001 en P < 0,001, respectievelijk) alle ook beïnvloedde de overleving van maagkanker (tabel 2). Verder werden Cox multivariate regressie-analyses uitgevoerd om risico-inschattingen onafhankelijk gerelateerd aan de totale overleving ontlenen. Zoals in de onderstaande tabel 3, werden TNM podium en miR-137 expressie zowel erkend als onafhankelijke en significante prognostische parameters in de twee onafhankelijke sets (Training set: TNM stadium: HR, 12,83; 95% CI, 3,48-47,30; P < 0.001; miR-137 expressie: HR, 6.80; 95% CI, 2,06-22,48; P = 0,002; Validation ingesteld: TNM stadium: HR, 5,21; 95% CI, 2,04-13,31; P = 0,001; miR-137 expressie: HR, 2,41; 95% BI 1,13-5,11;. P = 0,023, respectievelijk)

Gestratificeerde analyse van TNM stadium

Om te bepalen of miR-137 expressie kon stratify patiënten met verschillende TNM stadium stratum, hebben we gestratificeerde analyses van maagkanker patiënten met TNM I + II en III TNM en beoordeelde de prognostische waarde van miR-137 expressie in de twee onafhankelijke sets respectievelijk. Zoals vermeld in tabel 4, alleen de maagkanker patiënten met TNM stadium III aanzienlijk kunnen worden gestratificeerd door miR-137 expressie, de prognose van de TNM stadium III maagkanker patiënten met een hoge miR-137 expressie was significant beter dan die met lage miR-137 expressie in de twee onafhankelijke sets (Training set: P = 0,006, Validatie instellen: P = 0,016, respectievelijk figuur 3).

Discussie

China is nog steeds een van de landen met de hoogste incidentie van maagkanker, hoewel dat in veel geïndustrialiseerde landen afgenomen afgelopen decennia en geavanceerde ziekte reeds in het overgrote deel van de patiënten [1,2,4]. Op dit moment, TNM-classificatie van UICC /AJCC is de belangrijkste voorspellende factor voor maagkanker [5]. Omdat er heterogeniteit op moleculair niveau van maagkanker is onvoldoende om alleen vertrouwen op TNM de prognose maagkanker [6,17] voorspellen. Daarom is de identificatie van moleculaire merkers die voorspellend maagkanker agressiviteit en prognose voor de patiënt als een aanvulling op TNM heeft de potentie om de mogelijkheid behandeling van patiënten en kan belangrijk klinisch relevante inzichten ziektebehandeling bieden verbeteren. Bovendien, het selecteren van de patiënten die grootste van nauwkeurigheid behandeling en gerichte therapieën wordt gezien als de beste methode om de sterftecijfers van maag- kanker kunnen profiteren. Onderzoek naar de relatie tussen miRNAs en maagkanker is geleidelijk opgedaan aandacht van onderzoekers in het algemene chirurgie veld, en dit onderzoek is een belangrijk onderwerp voor onderzoek in de afgelopen jaren uitgegroeid tot [7]. In de onderhavige studie hebben we de expressie van miR-137 onderzocht bij menselijke maagkanker cellijnen met kwantitatieve real-time PCR, de resultaten vertoond die de menselijke maagkanker cellen, waaronder MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803 en AGS, uitgedrukt aanzienlijk lagere niveaus van miR-137 dan GES-1, die een geïmmortaliseerde normale menselijke maag epitheel cellijn. Dit resultaat gaf aan dat abnormale miR-137 expressie kan worden gerelateerd aan de oncogenese van maagkanker. Echter, verduidelijkt het onderliggende mechanisme van ontregeling van miR-137 in maagkanker cellen en weefsels wacht verder onderzoek.

Hetzelfde met de andere miRNAs, is gemeld dat miR-137 nauw gecorreleerd met de vorming en ontwikkeling van menselijke kankers [8,18]. Als belangrijke onderdelen van genregulatie, in vele menselijke kankercellen, kon miR-137 regelen verschillende genen en hun functies te beïnvloeden in vele cellulaire routes. Cel proliferatie en migratie van borstkanker zou kunnen worden onderdrukt door miR-137 door het onderdrukken oestrogeen gerelateerde receptor a (erra) [19]. Terwijl in colorectale kankercellen, ectopische expressie miR-137 kon ook celcyclus onderdrukt celgroei en remmen celinvasie door targeting celdeling controle-eiwit 42 homoloog (Cdc42) [20]. Onlangs, Wu et al. aangegeven dat miR-137 wordt ingewerkt tumor suppressor op maagkanker cellen doelwit AKT2 en verdere invloed Slechte en GSK-3β en mogelijk betrokken zijn bij tumorigenese en metastase van maagkanker [16]. Zheng en zijn collega's toonden aan dat ectopische expressie van miR-137 was voldoende om maagkanker celproliferatie [21] remmen. Bovendien Steponaitiene R et al. vertoonde dat miR-137 methylering is een frequente gebeurtenis gastrointestinale kankers die begin stapsgewijs optreedt tijdens maagkanker en omgekeerd correleert met algemene methylering [22]. De bovengenoemde studies bevestigden dat miR-137 speelt een rol die vergelijkbaar is met tumor suppressor miRNAs. Echter, al deze onderzoeken voornamelijk uitgevoerd in maagkanker cellijnen is de relatie tussen de expressie van miR-137 en de klinische kenmerkende factoren van patiënten met maagkanker niet vastgesteld. In het huidige onderzoek, evalueerden we de relatie tussen de expressie van miR-137 en de prognose van patiënten met maagkanker na radicale gastrectomie, en vond dat miR-137 expressie was een onafhankelijke prognostische factor voor de algehele overleving van deze patiënten in aanvulling op TNM en de prognose van de patiënten met een lage miR-137 expressie waren significant slechter dan die met een hoge. Voor zover wij weten is dit de eerste studie voor miR-137 expressie identificeren als een onafhankelijke prognostische factor voor slechte overleving maagkanker patiënten na radicale gastrectomie. Op basis van deze toestand, aanbrengen van de prognostische waarde van miR-137 expressie TNM stadium III groep een betere risicostratificatie voor algehele overleving in patiënten met late-stadium maagkanker. Toch moet de potentiële verandering van de klinische praktijk worden gevalideerd in een gerandomiseerd onderzoek in de toekomst.

Tot op heden, aangezien miRNAs vertegenwoordigen een opkomende hotspot van het onderzoek naar kanker, is er een toenemende belangstelling met betrekking tot de miRNA reacties tot milieu-risico's en lifestyle, met inbegrip van sociale status, leefomstandigheden, en levensstijl gedrag, zoals roken en alcoholgebruik. Stánitz E et al. toonde aan dat miR-21 en miR-143 waren up-gereguleerd en miR-34a werd down-gereguleerd in monsters van maagkanker in de westerse landen [23]. In het licht van deze voorwaarden, of miR-137 onderexpressie ook wordt waargenomen bij maagkanker monsters van patiënten uit westerse landen moet worden geëvalueerd in de toekomst. Bovendien zou maagkanker van dezelfde histopathologie van de bevolking verschillende geografische regio's differentiële miRNAs en eiwit expressie patronen, die zou kunnen voortvloeien uit het bestaan ​​van verschillende risicofactoren van kanker laten zien.

Er zijn verschillende beperkingen van deze studie. Ten eerste is dit onderzoek beperkt door de terugwerkende kracht van de analyse en selectie bias kan niet volledig worden geëlimineerd, hoewel we de gegevens van een prospectief gehandhaafd databank verzameld. Ten tweede was er heterogeniteit in het wordt gebruikt om de cutoff van miR-137 expressie te bepalen in dit onderzoek drempels. De gemiddelde waarden werden het meest consistent gebruikt, maar verschillende drempelwaarden gemeld. Ten derde, er is niet met de gegevens van ziektevrije overleving in deze studie. Er zijn vele factoren, zoals de vervolgonderzoeken en de postoperatieve behandeling kan beïnvloeden, de ziektevrije overleving. En de ziektevrije overleving gegevens moeten worden verzameld in de toekomst onderzoeken. Tenslotte wordt het aantal patiënten in dit onderzoek is relatief klein. Grote gerandomiseerde prospectieve klinische studies nodig om de prognostische waarde van miR-137 expressie in patiënten met maagkanker identificeren.

Samenvattend, de resultaten van deze studie tonen aan dat miR-137 is een veelbelovende merker te voorspellen de algehele overleving van patiënten met maagkanker na radicale gastrectomie. Bovendien zou deze TNM stadium III maagkanker patiënten met een laag miR-137 expressie meer agressieve postoperatieve behandeling en dichter follow-up nodig.

• PLoS ONE: Belang van Serum Pepsinogens als een biomarker voor maagkanker en atrofische gastritis recyclen: een systematische review en meta-analyse
• PLoS ONE: Gedereguleerde Expressie van SRC, LYN en CKB Kinases door DNA-methylatie en de mogelijke rol bij maagkanker Invasiviteit en metastase