PLoS ONE: Клиническое значение MIR-137 Expression у пациентов с раком желудка после радикальной Gastrectomy

Абстрактный
<р> дисрегуляция MIR-137 играет жизненно важную роль в онкогенеза и прогрессировании различных типов рака, но его роль в прогнозе больных раком желудка остается неизвестной. Это исследование было разработано для изучения экспрессии и прогностическое значение микроРНК-137 в больных раком желудка после радикальной резекции желудка. Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) проводили для оценки экспрессии микроРНК-137 в желудочном линиях раковых клеток и тканей человека у больных с аденокарциномой желудка. Результаты оценивались по ассоциации с клиническими факторами и общей выживаемости путем с помощью анализа Каплана-Мейера. Прогнозные значения экспрессии и клинических исходов микроРНК-137 были оценены Cox регрессионного анализа. Результаты выставлены, что уровень экспрессии микроРНК-137 была снижена в желудочном линий раковых клеток и тканей человека, а также понижающей регуляции экспрессии микроРНК-137 было связано с дифференциацией клеток опухоли, N стадии и стадии TNM. Снижение экспрессии микроРНК-137 в желудочном раковых тканей положительно коррелирует с плохим общей выживаемости больных раком желудка. Далее многофакторный Cox регрессионный анализ позволил предположить, что экспрессия микроРНК-137 был независимым прогностическим индикатором для рака желудка на стадии TNM исключением. Применяя прогностическое значение экспрессии микроРНК-137 на стадии TNM III группа показала более стратификацию риска для общей выживаемости. В заключение, результаты усилили критическую роль для понижающей регуляции экспрессии микроРНК-137 при раке желудка и предположил, что экспрессия микроРНК-137 может быть прогностическим показателем для этого заболевания. Кроме того, у этих пациентов со стадией TNM III рака желудка и низким уровнем экспрессии микроРНК-137, возможно, потребуется более агрессивное лечение в послеоперационном периоде и более тесного последующей деятельности
<р> Цитирование:. Gu Q, J Чжан, Ху Н, Тан Е., Ши S, Нянь Y (2015) Клиническое значение MIR-137 Expression у пациентов с раком желудка после радикальной гастрэктомия. PLoS ONE 10 (11): e0142377. DOI: 10.1371 /journal.pone.0142377
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, JAPAN
<р> Поступило: 14 августа 2015 года; Принято: 21 октября, 2015 года; Опубликовано: 6 ноября 2015
<р> Copyright: © 2015 Гу и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> финансирование:.. авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

Китай является одной из стран с самым высоким уровнем заболеваемости раком желудка и составляет более 40% всех новых случаев во всем мире [1,2]. Несмотря на агрессивную терапию, прогноз поздних стадий рака желудка в Китае имеет тенденцию быть мрачными [3,4]. В настоящее время опухоль-узлов метастазы (TNM) система стадирования Союза по международному контролю рака /Американского объединенного комитета по раку (UICC /AJCC) является наиболее важным прогностическим фактором развития рака желудка [5]. Тем не менее, поскольку существует гетерогенность на молекулярном уровне, рака желудка, он недостаточен, чтобы полагаться только на стадии TNM для прогнозирования рака рака желудка [6]. Таким образом, идентификация молекулярных маркеров, которые являются предсказанием желудочного рака агрессивностью и прогноз пациента в качестве дополнительного к стадии TNM имеет потенциал, чтобы улучшить способность лечить пациентов и может обеспечить клинически значимых понимание важности в управлении заболеванием. Кроме того, отбор пациентов, которые могли бы принести пользу наибольший из прецизионной обработки мыслится как лучший способ снизить уровень смертности от рака желудка за исключением хирургического вмешательства.

MicroRNAs (микроРНК) небольшие эндогенные 19-25 нуклеотида некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов пост транскрипционно посредством спаривания оснований с 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) целевых информационных РНК (мРНК), что приводит к деградации мРНК или ингибирования трансляции [7]. Во многих раковых заболеваний человека, микроРНК может функционировать в качестве онкогенов или генов-супрессоров опухолей, чтобы подавить перевод или индуцировать деградацию мРНК в зависимости от характера их целей [8]. Ранее исследования показали, что экспрессия микроРНК-137 вниз регулируется и рассматривается в качестве прогностического маркера в различных типах рака, включая рак легких [9], колоректальный рак [10], рак яичников [11], множественной миеломы [12] , желудочно-кишечные стромальные опухоли [13], глиобластомы [14], и плоскоклеточный рак головы и шеи [15]. Недавно было показано, что экспрессия микроРНК-137 значительно снизилась в желудочном раковых тканей, а также подавление было одновременно с тяжестью патологических изменений, что свидетельствует о потенциальной подавителя опухоли роль микроРНК-137 в раке желудка [16]. Тем не менее, обширный анализ экспрессии микроРНК-137 в коррелируется с прогнозом у больных раком желудка не была выполнена, и ожидает дальнейшего разъяснения.
<Р> Принцип Целью данного исследования является оценка взаимосвязи между выражением MIR -137 и общей выживаемости больных раком желудка в попытке определить прогностическое значение экспрессии микроРНК-137. Результаты этого исследования демонстрируют, что уровень экспрессии микроРНК-137 была понижающая регуляция в желудочном раковых клетках и тканях, и микроРНК-137 экспрессия была независимым прогностическим индикатором для рака желудка.

Материалы и методы <бр>

Этика заявление
<р> Это исследование было рассмотрено и одобрено Советом по Institutional рассмотрению Второй филиал больницы Сиань Цзяотун университет и филиал больницы Яньань университета (провинция Шаньси, Китай). Все участники исследования или их законных опекунов, при условии, сообщил, письменное согласие до включения в исследование регистрации.

Клеточная культура

увековечены нормальные желудка эпителиальных клеток линии человеческой GES-1 и пять желудка клеточных линий рака человека, в том числе MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803 и AGS, были получены непосредственно из Шанхая клеток банка китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все эти клетки выращивают обычным и поддерживают в среде RPMI-1640 (Gibco) культуральной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen) при 37 ° С в увлажненном инкубаторе клеток с атмосферой 5% CO <суб> 2

Клинические образцы
<р> Свежие ткани желудка аденокарциномы и прилегающих к ним нормальные ткани были собраны из двух независимых наборов, включающих 154 пациентов с аденокарциномой желудка. Все пациенты, зарегистрированные в данном исследовании, были выполнена радикальная резекция (R 0 резекция в соответствии с UICC /AJCC и D2 лимфаденэктомии). Образцы обучающей выборки (n = 67) были получены в период с января 2005 года по декабрь 2009 года от Второй филиал больницы Сиань университета Цзяотун (провинция Шаньси, Китай), и образцы множества проверки (п = 87) были получены в период с января 2008 года и декабрь 2010 года с аффилированном больницы Яньань университета (провинция Шаньси, Китай). Образцы были флэш-замораживали в жидком азоте до использования. Образцы были пересмотрены двумя патологи независимо друг от друга, и стадия рака желудка классифицируется в соответствии со стадией системы TNM от UICC /[5] AJCC. Пациенты были исключены, если они ранее подвергались воздействию какой-либо целенаправленной терапии, химиотерапии, лучевой терапии и /или вмешательства терапии по поводу рака желудка.

QRT-PCR
<р> Общую РНК, содержащая микроРНК экстрагировали из культивируемых клеток или тканей с использованием miRNeasy Mini Kit (Qiagen). кДНК синтезируют с помощью обратной транскрипции miScript Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обратную транскрипцию проводили с помощью 50 нг тотальной РНК с праймером, специфичным для MIR-137, вместе с комплектом обратной транскрипцией SYBR Green микроРНК. микроРНК были определены количественно с помощью анализа SYBR Green микроРНК QRT-ПЦР в соответствии с протоколом производителя (Applied Biosystems). Реакцию QRT-ПЦР проводили на 7500 быстродействующая система в режиме реального времени (Applied Biosystems). Все количественные RT-ПЦР проводили в трех повторностях. Данные были проанализированы с использованием автоматического базового уровня. Пороговый цикл (Ct) был определен как дробное число циклов, при котором флуоресценция превысил заданный порог. Данные, полученные из QRT-ПЦР анализировали с помощью метода ΔΔCt (2 ΔΔCt). Праймеры PCR наборы, используемые здесь для MIR-137 был сконструирован следующим образом: микроРНК-137 прямой праймер: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ', и обратный праймер: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6, был использован в качестве внутреннего контроля и амплифицировали с прямой праймер: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ', и обратный праймер: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.

Статистический анализ
<р> Статистический анализ осуществляется с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) и SPSS 19.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Общая выживаемость определялась как время между первого дня постановки диагноза и даты, связанной с раком смерти или последнего последующего визита. χ Пирсона 2 или точный критерий Фишера использовался для анализа взаимосвязи между микроРНК-137 выражения и клинико-патологическими факторами. Совокупные показатели выживаемости были рассчитаны по методу Каплана-Мейера и различия между подгруппами были исследованы с помощью теста лог-ранга. Числа риска были рассчитаны на начало каждого периода времени. Прогностическое значение экспрессии микроРНК-137 определяли с помощью однофакторного и многофакторного анализа. Все значения P были двусторонними, а Р &л; 0,05 считали статистически значимыми

Результаты

в раковых клетках желудка человека Анализ экспрессии микроРНК-137
<р> В порядке. для определения уровня экспрессии микроРНК-137 в клеток рака желудка человека, мы сначала оценивали микроРНК-137 экспрессия путем Qrt-ПЦР в обессмерченных нормальной желудка человека линии эпителиальных клеток ГЭС-1 и пять желудочные линий раковых клеток человека, в том числе MKN-45, SGC7901, КУП-823, MGC-803 и АГС. Как показано на рис 1А, человеческие клетки рака желудка выражены значительно более низкие уровни микроРНК-137, чем ГЭС-1. Эти наблюдения показывают, что экспрессия микроРНК-137 уменьшается в клеток рака желудка по сравнению с увековеченную нормальной желудка человека эпителиальной клетки, и снижение микроРНК-137 экспрессия может быть связано с онкогенеза рака желудка.

Ассоциации между выражение микроРНК-137 и клиникопатологическими факторы
<р> уровни экспрессии микроРНК-137 были дополнительно измерены, чтобы проанализировать свои отношения с клиникопатологическими факторами. Пациенты были разделены на высокой и низкой экспрессии группы в соответствии с отношением их нормальных /ткани рака медианные уровни экспрессии микроРНК-137 по результатам QRT-PCR (отношение отсечки = 1,5). И в соответствии с критерием, приблизительно 56,72% (обучающий набор, 38 из 67) и 49,43% (Validation комплект, 43 из 87) опухолей оценивали как низкой экспрессии микроРНК-137. Как показано в таблице 1, экспрессия микроРНК-137 был в значительной степени связано с дифференциацией клеток опухоли (р = 0,009 и р = 0,002, соответственно), N стадии (Р = 0,019 и Р &ЛТ; 0,001, соответственно), а также стадии TNM (Р = 0,007 и p = 0,007, соответственно) в двух независимых наборов. Кроме того, в обучающем наборе, экспрессия микроРНК-137 был также в значительной степени связано с Т стадии (Р = 0,002). Кроме того, процент пациентов с низким уровнем экспрессии микроРНК-137 увеличилась сопровождается прогрессированием заболевания от стадии TNM I до III в двух независимых множеств (рис 1В и 1С).

прогностическое значение экспрессии микроРНК-137 у пациентов с желудка
рак <р> для дальнейшего изучения прогностической ценности микроРНК-137 в экспрессии у больных раком желудка, мы сравнили общую выживаемость согласно выражению микроРНК-137, а также анализ выживаемости Каплана-Мейера была выполнена. Как показано на фиг.2, у пациентов с низким уровнем экспрессии микроРНК-137 показали значительно более короткое общее выживание, чем те строгих в двух независимых наборов (P &ЛТ; 0,001 и Р &ЛТ; 0,001, соответственно), что указывало на жизненно влияние экспрессии микроРНК-137 на клинические исходы у больных раком желудка. Кроме того, одномерный анализ общей выживаемости в данном исследовании выставлены, что низкая экспрессия микроРНК-137 является значительным отрицательным прогностическим показателем для пациентов с раком желудка в обучающем наборе (отношение рисков [ОР] 6,30; 95% ДИ, 2,17 до 18,27; P = 0,001) и набор проверки (HR, 3,74; 95% ДИ 1,81 до 7,73; P &л; 0,001). К тому же, дифференцировки опухолевых клеток (Р = 0,023 и Р = 0,048, соответственно), Т стадия (Р = 0,002 и Р = 0,012, соответственно), N стадия (Р = 0,004 и Р = 0,001, соответственно), ТНМ стадия (Р &л; 0,001 и Р &л; 0,001, соответственно) все же значительно влияет на выживание при раке желудка (таблица 2). Кроме того, Cox анализ многомерной регрессии были проведены для получения независимой оценки риска, связанных с общей выживаемости. Как показано в следующей таблице 3, TNM стадия и экспрессии микроРНК-137 оба были признаны в качестве независимых и значимых прогностических параметров в двух независимых наборов (набор Training: TNM стадии: HR, 12,83; 95% ДИ 3,48 до 47,30, P < 0,001; микроРНК-137 выражение: HR, 6,80; 95% ДИ 2,06 до 22,48; р = 0,002; Validation набор: TNM этап: HR, 5,21; 95% ДИ 2,04 до 13,31; р = 0,001; MIR-137 выражение: HR, 2,41; 95% ДИ от 1,13 до 5,11;. P = 0,023, соответственно)

Стратифицированная анализ на TNM стадии

для того, чтобы определить, может ли микроРНК-137 экспрессия стратифицировать пациентов с разной стадии TNM прослойка, мы сделали слоистые анализы больных раком желудка с TNM стадии I + II и TNM стадии III и оценивали прогностическое значение экспрессии микроРНК-137 в двух независимых множеств соответственно. Как указано в Таблице 4, только у больных раком желудка со стадией TNM III может быть стратифицированной выражением микроРНК-137 значительно, прогноз стадии TNM III больных раком желудка с высоким уровнем экспрессии микроРНК-137 была значительно лучше, чем те, с низким MIR-137 выражение в двух независимых множеств (Обучение множество: P = 0,006, Validation набор: P = 0,016 соответственно; рис 3).

Обсуждение
<р> Китай остается одной из стран с самым высоким заболеваемость раком желудка Несмотря на то, что во многих промышленно развитых стран сократилась за последние десятилетия, и передовой стадии заболевания уже присутствуют в подавляющем большинстве больных [1,2,4]. В настоящее время TNM постановка система UICC /AJCC является наиболее важным прогностическим фактором развития рака желудка [5]. Тем не менее, потому что гетерогенность на молекулярном уровне рака желудка, что недостаточно полагаться только на стадии TNM предсказать прогноз рака желудка [6,17]. Таким образом, идентификация молекулярных маркеров, которые являются предсказанием желудочного рака агрессивностью и прогноз пациента в качестве дополнительного к стадии TNM имеет потенциал, чтобы улучшить способность управлять пациентов и может обеспечить важные клинически значимые проникновения в суть лечения заболевания. Кроме того, отбор пациентов, которые могли бы принести пользу наибольший из прецизионной обработки и целевой терапии мыслится как лучший способ уменьшить показатели смертности рака желудка. Исследования, касающиеся взаимосвязи между микроРНК и раком желудка постепенно привлекла к себе внимание со стороны исследователей в общей области хирургии, и это исследование стало важной темой исследований в последние годы [7]. В настоящем исследовании мы оценивали уровень экспрессии микроРНК-137 в желудочном линиях раковых клеток человека с количественной ПЦР в реальном времени, результаты выставлялись, что человеческие клетки рака желудка, в том числе MKN-45, SGC7901, КУП-823, MGC- 803 и АГС, выраженное значительно более низкие уровни микроРНК-137, чем ГЭС-1, которая является увековечены нормальной человеческой эпителия желудка линия клеток. Этот результат показал, что аномальный экспрессия микроРНК-137 может быть связано с онкогенеза рака желудка. Тем не менее, уточнение основной механизм дисрегуляции микроРНК-137 в желудочном раковых клеток и тканей ожидает дальнейшего исследования.
<Р> То же самое с другими микроРНК, сообщалось, что микроРНК-137 был тесно связан с формированием и развитием злокачественных опухолей человека [8,18]. В качестве важных компонентов регуляции генов, во многих раковых клетках человека, микроРНК-137 может регулировать различные гены и влиять на их функции во многих клеточных путей. пролиферации и миграции клеток рака молочной железы может быть подавлена ​​MIR-137 путем подавления эстрогена, связанный рецептор а (ERRA) [19]. В то время как, в колоректальных раковых клетках, эктопическая экспрессия микроРНК-137 может также остановку клеточного цикла, подавляют рост клеток, а также ингибировать инвазию клеток путем ориентации контрольного белка клеточного деления 42 гомолога (CDC42) [20]. В последнее время, Ву и др. показали, что микроРНК-137 действует в качестве супрессора опухоли на желудочную раковых клеток путем охвата AKT2 и далее влияет на плохое и GSK-3 β и, возможно, участвует в онкогенеза и метастазирования рака желудка [16]. Чжэн и его коллеги продемонстрировали, что эктопическая экспрессия микроРНК-137 было достаточно, чтобы ингибировать пролиферацию раковых клеток желудка [21]. Кроме того, Steponaitiene R и др. выставлены, что микроРНК-137 метилирование является частым событием в двенадцатиперстной кишки, которое происходит в начале ступенчатым образом в течение желудочном канцерогенезе и обратно коррелирует с глобальным метилирования [22]. Вышеуказанные исследования подтвердили, что микроРНК-137 играет роль, которая похожа на супрессоров опухолей микроРНК. Тем не менее, все эти исследования в основном выполнены в желудочном линиях раковых клеток, не была установлена ​​связь между уровнем экспрессии микроРНК-137 и клинических факторов, характерных больных раком желудка. В настоящем исследовании мы проанализировали связь между экспрессией микроРНК-137 и прогноз больных раком желудка после радикальной резекции желудка, и обнаружили, что микроРНК-137 экспрессия была независимым прогностическим фактором для общей выживаемости этих пациентов в дополнение к TNM стадии , и прогноз у пациентов с низким уровнем экспрессии микроРНК-137 были значительно хуже, чем с высоким. Насколько нам известно, это первое исследование с целью идентификации экспрессии микроРНК-137 как независимый плохой прогностический фактор для общей выживаемости больных раком желудка следующей радикальной резекции желудка. Исходя из этого условия, применяя прогностическое значение экспрессии микроРНК-137 на стадии TNM III группа показала лучшую стратификацию риска для общей выживаемости у пациентов с поздними стадиями рака желудка. Тем не менее, потенциал изменение клинической практики должно быть подтверждено в рандомизированном контролируемом исследовании в будущем.

На сегодняшний день, так как микроРНК представляют формирующийся горячую точку исследований рака, существует растущий интерес в отношении ответов микроРНК для воздействия окружающей среды и образа жизни, в том числе социального статуса, условий жизни и образа жизни поведения, таких как курение сигарет и употребление алкоголя. Stánitz E и др. показали, что микроРНК-21 и микроРНК-143 были до регулируемой, и микроРНК-34а подавлялась в образцах рака желудка в западных странах [23]. В свете этих условий, является ли наблюдается микроРНК-137 underexpression в желудочном образцах раковых пациентов из западных стран необходимо оценивать в будущем. Кроме того, рак желудка того же гистопатологией от населения различных географических региона может показать дифференциальные микроРНК и экспрессии белка шаблоны, которые могут возникнуть в результате существования различных факторов риска канцерогенеза.
<Р> Есть несколько ограничений данного исследования. Во-первых, это исследование ограничено ретроспективным характером анализа и уклонов отбора не могут быть полностью устранены, хотя мы собрали данные из перспективно поддерживаемой базы данных. Во-вторых, была гетерогенность порогов, используемых для определения среза экспрессии микроРНК-137 в этом исследовании. Средние значения были наиболее последовательно использовали, было зарегистрировано, однако различные пороговые значения. В-третьих, не включая данные болезни свободного выживания в этом исследовании. Есть много факторов, таких как последующих экзаменов и послеоперационного лечения, могут повлиять на выживаемость без заболевания. А данные заболевания выживаемость должна быть собрана в будущих исследованиях. И, наконец, число пациентов, включенных в данное исследование является относительно небольшим. Большие потенциальные рандомизированные контролируемые клинические исследования необходимы, чтобы определить прогностическое значение микроРНК-137 экспрессии у больных раком желудка
. <Р> Таким образом, результаты этого исследования показывают, что микроРНК-137 является перспективным маркером для прогнозирования общая выживаемость больных раком желудка после радикальной резекции желудка. Кроме того, эти стадии TNM III больных раком желудка с низким уровнем экспрессии микроРНК-137, возможно, потребуется более агрессивное лечение в послеоперационном периоде и более тесного наблюдения.

• PLoS ONE: Значение сыворотки Pepsinogens в качестве биомаркера для рака желудка и атрофический гастрит скрининга: сист…
• PLoS ONE: дерегулируемых Выражение SRC, Lyn и ЦКБ киназ с помощью метилирования ДНК и его потенциальную роль в рак же…