PLOS ONE: Importance clinique de miR-137 Expression chez les patients atteints de cancer gastrique Après Radical Gastrectomy

Résumé

La dysrégulation de miR-137 joue un rôle vital dans l'oncogenèse et la progression de divers types de cancer, mais son rôle dans le pronostic des patients atteints de cancer gastrique reste inconnue. Cette étude a été conçue pour étudier l'expression et la signification pronostique de miR-137 chez les patients atteints de cancer gastrique après gastrectomie radicale. Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée pour évaluer l'expression de miR-137 dans des lignées gastriques humaines de cellules cancéreuses et des tissus chez des patients atteints d'un adénocarcinome gastrique. Les résultats ont été évalués pour l'association avec des facteurs cliniques et la survie globale à l'aide de l'analyse de Kaplan-Meier. Les valeurs pronostiques d'expression et les résultats cliniques miR-137 ont été évalués par une analyse de régression de Cox. Les résultats exposés que le niveau de miR-137 l'expression a été réduite dans les lignées cellulaires du cancer de l'estomac et des tissus humains, et régulés à la baisse l'expression de miR-137 est associée à la différenciation des cellules tumorales, N stade et le stade TNM. Diminution de l'expression de miR-137 dans les tissus de cancer gastrique était positivement corrélée avec la survie globale médiocre des patients atteints de cancer gastrique. Une analyse plus poussée Cox de régression multivariée a suggéré que l'expression de miR-137 est un indicateur pronostique indépendant pour le cancer gastrique, sauf pour le stade TNM. L'application de la valeur pronostique de l'expression de miR-137 à l'étape TNM groupe III a montré une meilleure stratification du risque pour la survie globale. En conclusion, les résultats ont renforcé le rôle critique pour le miR-137 expression régulée à la baisse dans le cancer gastrique et a suggéré que l'expression de miR-137 pourrait être un indicateur pronostique pour cette maladie. De plus, ces patients avec le stade TNM III cancer de l'estomac et une faible miR-137 expression pourraient avoir besoin de traitement post-opératoire plus agressif et un suivi plus étroit

Citation:. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye, Shi S, Nian Y (2015) importance clinique de miR-137 expression chez les patients atteints de cancer gastrique Après Radical gastrectomie. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10.1371 /journal.pone.0142377

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, JAPON

Reçu le 14 Août 2015; Accepté le 21 Octobre 2015; Publié 6 Novembre, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Gu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:.. les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

la Chine est l'un des pays ayant la plus forte incidence du cancer gastrique et représente plus de 40% de tous les nouveaux cas dans le monde [1,2]. Malgré un traitement agressif, le pronostic du cancer gastrique avancé en Chine a tendance à être triste [3,4]. À l'heure actuelle, la tumeur-node-métastases (TNM) système de mise en scène de l'Union internationale contre le cancer /American Joint Committee on Cancer (UICC /AJCC) est le facteur pronostique le plus important pour le cancer gastrique [5]. Cependant, parce qu'il existe une hétérogénéité au niveau moléculaire du cancer gastrique, il ne suffit pas de compter uniquement sur le stade TNM de prédire le pronostic du cancer gastrique [6]. Par conséquent, l'identification de marqueurs moléculaires qui sont prédictifs de l'agressivité du cancer gastrique et le pronostic du patient comme complémentaire à stade TNM a le potentiel d'améliorer la capacité de traiter les patients et pourrait fournir des indications cliniquement pertinentes d'importance dans la gestion de la maladie. En outre, la sélection des patients qui pourraient bénéficier le plus d'un traitement de précision est considéré comme la meilleure méthode pour réduire les taux de mortalité du cancer gastrique, sauf pour la chirurgie.

microARN (miARN) sont de petits endogènes 19-25 nucléotides ARN qui régulent l'expression des gènes après transcriptionnelle par appariement de bases avec la région 3 'non traduite (3' UTR) des ARN messagers cibles (ARNm) non codante, qui résulte de la dégradation de l'ARNm ou l'inhibition de la traduction [7]. Dans de nombreux cancers humains, les miARN peuvent fonctionner comme des oncogenes ou des gènes suppresseurs de tumeur pour supprimer la traduction ou pour induire une dégradation de l'ARNm en fonction de la nature de leurs cibles [8]. Auparavant, les études ont montré que l'expression de miR-137 est régulé à la baisse et considérée comme un marqueur pronostique dans divers types de cancer, notamment le cancer du poumon [9], le cancer colorectal [10], le cancer de l'ovaire [11], le myélome multiple [12] , tumeurs stromales gastro [13], le glioblastome [14], et un carcinome épidermoïde de la tête et du cou [15]. Il a été récemment montré que l'expression de miR-137 a diminué de manière significative dans les tissus de cancer gastrique et la suppression a été en même temps que la gravité des changements pathologiques, ce qui suggère le rôle potentiel de suppression de tumeur de miR-137 dans le cancer gastrique [16]. Cependant, une analyse approfondie de l'expression de miR-137 en corrélation avec le pronostic des patients atteints de cancer gastrique n'a pas été effectuée et attend de plus amples éclaircissements.

L'objectif principal de cette recherche est d'évaluer la relation entre l'expression de miR -137 et la survie globale des patients atteints de cancer gastrique dans un effort pour identifier la signification pronostique de l'expression de miR-137. Les résultats de cette étude présentent que le niveau de miR-137 expression était régulation à la baisse dans les cellules et les tissus de cancer gastrique, et miR-137 expression était un indicateur pronostique indépendant pour le cancer gastrique.

Matériel et méthodes

éthique déclaration

Cette étude a été examiné et approuvé par la Commission de révision institutionnelle du deuxième hôpital affilié de l'Université Xi'an Jiaotong et l'Hôpital affilié de l'Université de Yan'an (province du Shanxi, en Chine). Tous les participants à l'étude, ou leur tuteur légal, à condition informé consentement écrit préalable pour étudier les inscriptions.

culture
Cell

GES-1 et cinq lignes normales immortalisées de lignée cellulaire épithéliale gastrique humaine humains gastriques cellules cancéreuses, y compris MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, et AGS, ont été obtenus directement à partir de Shanghai banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Toutes ces cellules sont couramment cultivées et maintenues dans du RPMI-1640 (Gibco) du milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (Invitrogen) à 37 ° C dans un incubateur de cellules humidifiée avec une atmosphère de 5% de CO ₂

les échantillons cliniques

tissus d'adénocarcinome gastrique frais et les tissus normaux adjacents ont été recueillies à partir de deux ensembles indépendants comprenant 154 patients atteints d'un adénocarcinome gastrique. Tous les patients inclus dans cette étude étaient gastrectomie radicale subi (résection R0 selon l'UICC /AJCC et D2 lymphadénectomie). Spécimens de jeu d'apprentissage (n = 67) ont été obtenues entre Janvier 2005 et Décembre 2009 de la deuxième hôpital affilié de l'Université Jiaotong de Xi'an (province du Shanxi, en Chine), et des spécimens de jeu de validation (n = 87) ont été obtenues entre Janvier 2008 et Décembre 2010 de l'Hôpital affilié de l'Université de Yan'an (province du Shanxi, en Chine). Les échantillons ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide jusqu'à utilisation. Les échantillons ont été réévaluées par deux pathologistes indépendamment, et le stade du cancer gastrique est classé selon le système de stade TNM de l'UICC /AJCC [5]. Les patients ont été exclues si elles avaient déjà été exposés à une thérapie ciblée, radiothérapie, chimiothérapie et /ou la thérapie d'intervention pour le cancer de l'estomac.

qRT-PCR

L'ARN total contenant miRNA a été extrait de culture des cellules ou des tissus à l'aide miRNeasy Mini Kit (Qiagen). L'ADNc a été synthétisé en utilisant le kit de transcription inversée miScript (Qiagen) selon les instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée en utilisant 50 ng d'ARN total avec une amorce spécifique pour miR-137, ainsi que le kit de transcription inverse SYBR Green microARN. miARN ont été quantifiés en utilisant l'essai SYBR Green miARN qRT-PCR selon le protocole du fabricant (Applied Biosystems). La réaction qRT-PCR a été réalisée sur un système en temps réel rapide 7500 (Applied Biosystems). Toutes les RT-PCR quantitatives ont été effectuées en triple. Les données ont été analysées à l'aide d'une base automatisée. Le cycle seuil (Ct) a été défini comme étant le nombre de cycles fractionnée au cours de laquelle la fluorescence a dépassé le seuil donné. Les données obtenues à partir de la qRT-PCR ont été analysés en utilisant la méthode ΔΔCt (2 ^{ΔΔCt). Les amorces de PCR ensembles utilisés ici pour miR-137 a été conçu comme suit: miR-137 amorce sens: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ', et l'amorce inverse: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6 a été utilisé comme un contrôle interne et amplifié avec l'amorce sens: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ', et l'amorce inverse: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.}

L'analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée en utilisant GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) et SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). La survie globale a été définie comme le temps entre le premier jour du diagnostic et de la date de décès liés au cancer ou la dernière visite de suivi. Le χ de Pearson ^{2 ou le test exact de Fisher a été utilisé pour analyser la relation entre miR-137 expression et facteurs clinicopathologiques. Les taux de survie cumulatifs ont été calculés par la méthode de Kaplan-Meier et les différences entre les sous-groupes ont été examinés par le test du log-rank. Numéros à risque ont été calculés pour chaque début de période. La valeur pronostique de l'expression de miR-137 a été déterminée par analyse univariée et multivariée. Toutes les valeurs de P étaient deux côtés, et P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative}

Résultats

Analyse de l'expression de miR-137 dans les cellules cancéreuses gastriques humaines

. pour déterminer le niveau de miR-137 expression dans des cellules de cancer gastrique humaine, nous avons d'abord évalué miR-137 l'expression par qRT-PCR lignée humaine normale immortalisée de l'estomac épithéliale GES-1 et cinq lignées de cellules de cancer gastrique humain, y compris MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, et AGS. Comme cela est représenté sur la figure 1A, les cellules cancéreuses gastriques humaines ont exprimé des niveaux sensiblement inférieurs de miR-137 de GES-1. Collectivement, ces observations suggèrent que l'expression de miR-137 est diminuée dans les cellules de cancer gastrique par rapport à la cellule humaine normale immortalisée gastrique épithéliale, et une diminution de miR-137 expression peut être liée à l'oncogenèse du cancer gastrique.

Les associations entre expression miR-137 et les facteurs clinicopathologiques

Les niveaux de miR-137 expression ont encore été mesurés pour analyser leur relation avec les facteurs clinicopathologiques. Les patients ont été divisés en groupe de haut et de bas expression selon le rapport de leurs tissus cancéreux niveaux d'expression normale /médiane de miR-137 selon les résultats de qRT-PCR (rapport cut-off = 1,5). Et selon le critère, environ 56,72% (ensemble de la formation, 38 de 67) et 49,43% (Validation réglée, 43 sur 87) des tumeurs ont été marqués aussi bas miR-137 expression. Comme on le voit dans le tableau 1, l'expression de miR-137 était significativement associé à la différenciation des cellules tumorales (P = 0,009 et P = 0,002, respectivement), le stade N (P = 0,019 et P < 0,001, respectivement), et le stade TNM (P = 0,007 et P = 0,007, respectivement) dans les deux ensembles indépendants. En outre, dans l'ensemble de la formation, miR-137 expression a également été liée de façon significative avec le stade de T (P = 0,002). Par ailleurs, le pour cent des patients avec une faible expression de miR-137 a augmenté accompagné de progression de la maladie du stade TNM I à III dans les deux ensembles indépendants (figure 1B et 1C).

Valeur pronostique de miR-137 expression chez les patients avec cancer gastrique

pour étudier plus en détail la valeur pronostique de miR-137 expression chez les patients atteints de cancer gastrique, nous avons comparé la survie globale selon miR-137 expression, et l'analyse de survie de Kaplan-Meier a été réalisée. Comme le montre la figure 2, les patients ayant un faible miR-137 expression ont montré la survie globale significativement plus courte que ces hauts celles des deux ensembles indépendants (P < 0,001 et P < 0,001, respectivement), ce qui indique un impact vital de miR-137 expression les résultats cliniques chez les patients atteints de cancer gastrique. En outre, les analyses univariée pour la survie globale dans cette étude présentaient que la faible expression de miR-137 est un prédicteur pronostique négatif significatif pour les patients atteints de cancer gastrique dans l'ensemble de la formation (risque relatif [RR], 6,30; IC 95%, 2,17 à 18,27; P = 0,001) et un ensemble de validation (HR, 3,74; IC 95%, 1,81 à 7,73; P < 0,001). Par ailleurs, la différenciation des cellules tumorales (P = 0,023 et P = 0,048, respectivement), stade T (P = 0,002 et P = 0,012, respectivement), le stade N (P = 0,004 et P = 0,001, respectivement), le stade TNM (P < 0,001 et P < 0,001, respectivement) tous également affectés de manière significative la survie du cancer gastrique (tableau 2). En outre, des analyses de régression multivariée de Cox ont été effectuées pour obtenir des estimations de risque indépendants liés à la survie globale. Comme le montre le tableau 3 ci-après, le stade TNM et miR-137 expression ont tous deux été reconnus comme des paramètres indépendants et significatifs pronostiques dans les deux ensembles indépendants (ensemble de la formation: le stade TNM: HR, 12,83; IC 95%, 3,48 à 47,30; P < 0,001; miR-137 expression: HR, 6,80; IC 95%, 2,06 à 22,48; P = 0,002; validation set: TNM étape: HR, 5,21; IC 95%, 2,04 à 13,31; P = 0,001; miR-137 expression: HR, 2,41; IC 95%, 1,13 à 5,11;. P = 0,023, respectivement)

analyse stratifiée sur scène TNM

Pour déterminer si miR-137 expression pourrait stratifier les patients atteints de stade TNM différent strate, nous avons fait des analyses stratifiées des patients atteints de cancer gastrique avec le stade TNM I + II et le stade TNM III et évalué la valeur pronostique de miR-137 expression dans les deux ensembles indépendants, respectivement. Comme indiqué dans le Tableau 4, seuls les patients atteints de cancer gastrique avec le stade TNM III pourrait être stratifiée par l'expression de miR-137 de manière significative, le pronostic de III patients atteints de cancer gastrique au stade TNM avec haute miR-137 expression était significativement mieux que ceux à faible miR-137 expression dans les deux ensembles indépendants (ensemble de la formation: P = 0,006, validation set: P = 0,016, respectivement; la figure 3).

Discussion

la Chine est encore l'un des pays les plus l'incidence du cancer gastrique, bien que, dans de nombreux pays industrialisés a diminué au cours des dernières décennies, et la maladie de stade avancé déjà présent dans la grande majorité des patients [1,2,4]. Actuellement, Classification TNM de l'UICC /AJCC est le facteur pronostique le plus important pour le cancer gastrique [5]. Cependant, parce qu'il existe une hétérogénéité au niveau moléculaire du cancer gastrique, il ne suffit pas de compter uniquement sur le stade TNM de prédire le pronostic du cancer gastrique [6,17]. Par conséquent, l'identification de marqueurs moléculaires qui sont prédictifs de l'agressivité du cancer gastrique et le pronostic du patient comme complémentaire à stade TNM a le potentiel d'améliorer la capacité de gérer les patients et pourrait fournir des indications cliniquement pertinentes importantes dans le traitement de la maladie. En outre, la sélection des patients qui pourraient bénéficier d'un traitement plus précis et des thérapies ciblées est considérée comme la meilleure méthode pour réduire les taux de cancer de l'estomac de mortalité. Les recherches concernant la relation entre les miARN et le cancer gastrique a progressivement gagné l'attention des chercheurs dans le domaine de la chirurgie générale, et cette recherche est devenue un important sujet de recherche au cours des dernières années [7]. Dans la présente étude, nous avons évalué les niveaux de miR-137 l'expression dans l'estomac des lignées de cellules cancéreuses humaines avec une PCR quantitative en temps réel, les résultats exposés que les cellules de cancer gastrique humain, y compris MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803, et AGS, ont exprimé des niveaux significativement inférieurs de miR-137 de GES-1, qui est une ligne normale gastrique humaine des cellules épithéliales immortalisées. Ce résultat indique que l'expression anormale de miR-137 peut être liée à l'oncogenèse du cancer gastrique. Cependant, la clarification du mécanisme sous-jacent de la dysrégulation de miR-137 dans les cellules et les tissus de cancer gastrique attend une enquête plus approfondie.

Même avec les autres miARN, il a été rapporté que miR-137 a été étroitement corrélée avec la formation et le développement des cancers humains [8,18]. Comme des éléments importants de la régulation des gènes, dans de nombreuses cellules cancéreuses humaines, miR-137 pourrait réguler les gènes différents et influencer leurs fonctions dans de nombreuses voies cellulaires. la prolifération cellulaire et la migration du cancer du sein pourraient être supprimés par miR-137 en supprimant l'œstrogène récepteur lié un (ERRA) [19]. Alors que, dans les cellules cancéreuses colorectales, l'expression ectopique de miR-137 peut aussi arrêter le cycle cellulaire, de réprimer la croissance cellulaire, et d'inhiber l'invasion cellulaire en ciblant la protéine de régulation de la division cellulaire 42 homolog (Cdc42) [20]. Récemment, Wu et al. a indiqué que le miR-137 est actionné comme suppresseur de tumeur sur des cellules de cancer de l'estomac, en ciblant AKT2, et en outre affecter la GSK-3β et Bad et potentiellement impliqués dans la tumorigenèse et les métastases du cancer gastrique [16]. Zheng et ses collègues ont démontré que l'expression ectopique de miR-137 était suffisante pour inhiber la prolifération des cellules gastriques du cancer [21]. En outre, Steponaitiene R et al. expose que miR-137 méthylation est un événement fréquent dans les cancers gastro-intestinaux qui se produit au début de manière progressive au cours de la carcinogenèse gastrique et inversement corrélée à la méthylation globale [22]. Les études mentionnées ci-dessus ont confirmé que miR-137 joue un rôle similaire à miARN suppresseurs de tumeur. Cependant, toutes ces recherches sont principalement effectuées dans les lignées cellulaires de cancer gastrique, la relation entre le niveau de miR-137 et les facteurs cliniques caractéristiques des patients atteints d'un cancer gastrique expression n'a pas été établie. Dans la présente recherche, nous avons évalué l'association entre l'expression de miR-137 et le pronostic des patients atteints de cancer gastrique après gastrectomie radicale, et a constaté que miR-137 expression était un facteur pronostique indépendant pour la survie globale de ces patients, en plus de stade TNM , et le pronostic des patients avec une faible expression de miR-137 ont été significativement pire que ceux qui ont élevé. À notre connaissance, cette étude est la première à identifier l'expression de miR-137 comme un facteur de mauvais pronostic indépendant pour la survie globale des patients atteints de cancer gastrique suivant gastrectomie radicale. Sur la base de cette condition, en appliquant la valeur pronostique de l'expression de miR-137 à l'étape TNM groupe III a montré une meilleure stratification du risque pour la survie globale chez les patients atteints de cancer gastrique à un stade avancé. Cependant, l'évolution potentielle de la pratique clinique doit être validée dans un essai contrôlé randomisé dans l'avenir.

À ce jour, depuis miARN représentent un hotspot émergent de la recherche sur le cancer, il y a un intérêt croissant à l'égard des réponses miRNA aux expositions environnementales et style de vie, y compris le statut social, les conditions de vie et les habitudes de vie, comme le tabagisme et la consommation d'alcool. Stánitz E et al. ont montré que miR-21 et miR-143 ont été régulés à la hausse, et miR-34a a été régulés à la baisse dans les échantillons de cancer gastrique dans les pays occidentaux [23]. A la lumière de ces conditions, que miR-137 underexpression est également observée dans les échantillons de cancer gastrique de patients de pays occidentaux doit être évaluée à l'avenir. En outre, le cancer gastrique du même histopathologie de la population différente région géographique pourrait montrer miARN différentielles et les profils d'expression des protéines, qui pourraient résulter de l'existence de différents facteurs de risque de cancérogenèse.

Il existe plusieurs limites de cette étude. Tout d'abord, cette étude est limitée par la nature rétrospective de l'analyse et les biais de sélection ne peuvent pas être totalement éliminés même si nous avons recueilli les données à partir d'une base de données prospective maintenu. Deuxièmement, il y avait une hétérogénéité dans les seuils utilisés pour déterminer le seuil d'expression miR-137 dans cette recherche. Les valeurs médianes ont été le plus utilisé systématiquement, mais une variété de seuils ont été rapportés. Troisièmement, il n'y a pas, y compris les données de survie sans maladie dans cette étude. Il existe de nombreux facteurs, tels que les examens de suivi et le traitement post-opératoire, pourraient influer sur la survie sans maladie. Et les données de survie sans maladie devraient être recueillies dans les recherches futures. Enfin, le nombre de patients inclus dans cette étude est relativement faible. De vastes études cliniques prospectives randomisées contrôlées sont nécessaires pour identifier la valeur pronostique de miR-137 expression chez les patients atteints de cancer gastrique.

En résumé, les résultats de cette étude démontrent que miR-137 est un marqueur prometteur pour prédire la survie globale des patients atteints de cancer gastrique après gastrectomie radicale. De plus, ces III patients atteints de cancer gastrique au stade TNM avec une faible expression de miR-137 pourraient avoir besoin de traitement post-opératoire plus agressif et un suivi plus étroit.

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