PLoS ONE: mikroRNA 135a undertrykker lymfeknutemetastase gjennom nedregulering av ROCK1 i tidlig Gastric Cancer

Abstract

microRNAs (mirnas) spiller en avgjørende rolle i magekreft progresjon og metastasering. Denne studien undersøkte rollen miRNA-135a i begynnelsen av magekreft (EGC) inkludert lymfeknute (LN) metastaser. Vi har undersøkt sammenhengen mellom miRNA-135a uttrykk og kliniske resultater hos 59 pasienter som gjennomgikk kirurgi for EGC. Ved hjelp av magekreft cellelinjer utførte vi funksjonelle og target gen-analyser. miRNA-135a-ekspresjon ble nedregulert i 33,9% av pasientene. Disse pasientene viste en betydelig mer avansert stadium (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045) og høyere rate av LN metastaser (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) enn de med oppregulering av miRNA-135a uttrykk. I en multivariat analyse, nedregulering av miRNA-135a var en selvstendig risikofaktor for LN metastaser (justert odds ratio 8,04; 95% konfidensintervall 1,08 til 59,81; p = 0,042). Funksjonelle analyser ved hjelp av magekreft cellelinjer viste at miRNA-135a trykt celle levedyktighet, epitelial-mesenchymale overgang, celle invasjon, og migrasjon. ROCK1 var et mål av miRNA-135a og dens uttrykk ble omvendt korrelert til at av miRNA-135a. ROCK1 uttrykk ble betydelig økt i EGC pasienter med LN metastaser enn i de uten LN metastaser. Våre resultater bekrefter svulsten-undertrykkende rolle miRNA-135a, og demonstrere sin rolle i LN metastaser i EGC. miRNA-135a og målet genet ROCK1
kan være nye terapeutiske og prognostiske mål for EGC

Citation. Shin JY, Kim Yi, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) mikroRNA 135a undertrykker lymfeknutemetastase gjennom nedregulering av ROCK1 i Early Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10,1371 /journal.pone.0085205

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

mottatt: 28 oktober 2013, Godkjent: 23 november 2013; Publisert: 21 januar 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble finansiert av stipend 1110532-3 fra National Cancer Center, Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser. HA er en PLoS ONE redaksjonell styremedlem og dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er fremdeles den nest vanligste årsaken til kreftdødelighet i verden, til tross for synkende forekomst og dødelighet i utviklede land [1 ].

i områder, blant annet Korea og Japan, hvor screening for magekreft utføres i stor grad, er ofte mulig tidlig deteksjon. Fordi en økt forekomst av tidlig deteksjon av magekreft kan føre til en bedre prognose, har interesser i å forbedre pasientenes livskvalitet og utnytte minimalt invasive behandlinger økt. Hos pasienter med magekreft, lymfeknute (LN) metastaser er en av de viktigste prognostiske faktorer, og den totale forekomsten av en LN metastase i begynnelsen av magekreft (EGC) varierer fra 5 til 20% [2] - [4].

gastrektomi med LN disseksjon regnes som standard behandling for magekreft; men trenger 80 og 95% av pasientene med EGC ikke krever en LN disseksjon hvis magekreft er fullstendig spaltet med mindre invasiv behandling for eksempel endoskopisk reseksjon [5] - [7] eller minimalt invasiv kirurgi ( f.eks
, enkel kile reseksjon eller fast punkt LN navigasjon kirurgi) [8] - [10]. Selv om studier av biologiske prognostiske og prediktive markører for LN metastaser i EGC er utført, ingen prediktive verktøy finnes for nodal metastasering av EGC faktisk.

Flere studier har rapportert at dybden av invasjonen, tumor størrelse, og lymfatisk invasjon er forbundet med metastase i LN EGC [4], [11]. Men de fleste av disse faktorene har blitt bestemt etter endelig patologisk undersøkelse av resected vev, som ikke er nyttig for å bestemme behandlingsstrategi.

microRNAs (mirnas) er små ikke-proteinkodende RNA. Studier har vist at endringer i ekspresjon av mirnas bidrar til patogenesen av kreft inkludert de av gastrointestinal opprinnelse [12] -. [15]

mirnas har også vist seg å være nyttig i å skille kreft og normalt vev [ ,,,0],16], [17]. I tillegg er mirnas uttrykkes differensielt i hvert trinn av magekreft karsinogenese [18]. miRNA-27 [19] og den ZEB1 regulerte miRNA-200 familie [20] har vist seg å være relatert til fasen av epitelial-mesenchymale overgang (EMT) i magekreft. Derfor kan mirnas være forbundet med prosessen med LN metastase i EGC. Blant mirnas har miRNA-135a er vist å være en tumor undertrykkende miRNA, og dets ekspresjon blir nedregulert i flere kreftformer, inkludert nyrecellekarsinom [21] og lymfom [22]. I sin tur, over-ekspresjon eller restaurering av miRNA-135a fremmer apoptose og hemmer proliferasjonen av tumorceller gjennom sine målgener c-Myc [21] og JAK2 [22], respektivt. I en in vitro
studien, miRNA-135a trykt trekkende og invasive aktiviteter mage kreftceller [23]. Men svulsten undertrykkende rolle miRNA-135a i magekreft er uklart.

Formålet med denne studien var å undersøke sammenhengen mellom miRNA-135a uttrykk og kliniske utfall i EGC pasienter inkludert LN metastaser.

Materialer og metoder

Menneskelige vevsprøver og kliniske data

Femti-ni voksne pasienter med diagnosen EGC ved National Cancer Center, Korea, fra januar 2011 til april 2013 ble prospektivt inkludert i denne studien. Disse pasientene ble behandlet med en åpen eller laparoskopi-assistert gastrektomi med D1 + eller mer LN disseksjon. Omfanget av LN disseksjon fulgt anbefalingene fra den japanske Gastric Cancer Association [24]. Scenen etter operasjonen ble evaluert i henhold til 7 ^{th utgaven av amerikanske Joint Committee on Cancer TNM staging system [25]. Humant vev, inkludert både magekreft og matchede normale vev fra hver pasient ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Fra gjennomgangen av medisinske diagrammer, clinicopathologic kjennetegn som alder, kjønn, Helicobacter pylori
status, tumor egenskaper, scene, og status for LN metastaser ble innhentet og analysert. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av Institutional Review Board of National Cancer Center, Korea (NCCNCS-11-445).}

Cell kultur og transfeksjon

normalt humant gastrisk epitelial cellelinje HFE145 [26], [27] var en gave fra Dr Hassan Ashktorab og Duane T. Smoot (Howard University, Washington, USA) og kommersielt tilgjengelige mage kreft cellelinjer AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668, og SNU719 ble hentet fra Korea cellelinje Bank (KCLB, Seoul, Korea). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Blant de gastrisk kreft-cellelinjer, ble MKN28 og SNU668 cellelinjer valgt fordi de sjelden uttrykker miRNA-135a, og YCC og KATOIII cellelinjer ble valgt fordi de har en betydelig baseline ekspresjon av miRNA-135a (figur 1A). Transfections med miRNA-135a ligner (Mirvana ™ miRNA etterligner, Ambion, Austin, TX, USA), en miRNA-135a inhibitor (Mirvana ™ miRNA-hemmer, Ambion, Austin, TX, USA), og ROCK1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 '; UGBioneer, Seoul, Korea) i SNU668, YCC2, MKN28, og KATOIII cellelinjer ble utført ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX og Lipofectamine 2000 reagenser (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. MKN28, SNU668, YCC2, og KATOIII cellelinjer ble høstet to dager etter transfeksjon, og ulike analyser ble utført.

RNA ekstraksjon og mirnas kvantifisering

Total RNA ble isolert fra 13 cellelinjer og 59 mage kreftpasienter 'vev, henholdsvis ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Den universelle TaqMan PCR hovedblandings reagenser kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) ble anvendt. Amplifisering og påvisning ble utført ved å bruke en 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) med 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C (15 sekunder) og gløding /forlengelse ved 60 ° C (60 sekunder). Dette ble etterfulgt av revers transkripsjon ved 50 ° C i 30 minutter og denaturering ved 95 ° C i 10 minutter. For å kvantifisere modne mirnas, ble TAQMAN mikroRNA Analyser kits (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) som brukes for påvisning av miRNA-135a og en kontroll miRNA (RNU6B).

Western blot analyse

Protein var ekstrahert fra 13 cellelinjer og 59 vevsprøver EGC pasientenes ved hjelp av RIPA-buffer (Biosesang, Seoul, Korea) som inkluderer en protease inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA) i henhold til produsentens protokoll. Deretter ble Western blotting utført ved anvendelse av anti-ROCK1 og anti-β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) antistoffer. Signaler ble oppdaget med en ECL prime kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.

celleproliferasjon analyser

Celleproliferering ble målt ved hjelp av en MTT analyse. Celler ble sådd ut i 96-brønners kulturplater (3 x 10 ^{3-celler per brønn) og transfekteres med miRNA-135a ligner etter to dagers inkubering. Deretter ble 200 ul av MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til hver brønn. Etter fire timers ytterligere inkubering ble MTT løsninger kastet, 200 ul DMSO (Amresco, Solon, OH, USA) ble tilsatt til hver brønn, og platen ble ristet forsiktig. Absorbans ble målt på en ELISA-leser (Moecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ved en testbølgelengde på 570 nm.}

cellesyklusanalyse

Celler ble sådd ut i 60π kulturplater og transfektert med miRNA -135a etterligner eller en miRNA ligner negativ kontroll (ligner~~POS=HEADCOMP-NC). Disse cellene ble høstet ved trypsinering og fiksert i 70% etanol i minst to timer ved -20 ° C. Cellepellets ble vasket med kald fosfatbufret saltløsning og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i PI /RNase Farging buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Etter farging ble prøvene analysert med FACScan flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og 10.000 hendelser ble samlet per prøve. Data fra flowcytometri ble analysert ved hjelp av Cell quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Trans-filter migrasjon og invasjon analyser

Cellene ble transfektert med miRNA-135a ligner , miRNA-135a-inhibitorer, ROCK1 siRNA, og ROCK1 siRNA negativ kontroll (scRNA) for en dag og deretter overført til det øvre kammer av transwell plate belagt med 0,5 mg /ml kollagen type i (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) og en 1:15 fortynning av Matrigel (BD Biovitenskap, Bedford, MA, USA). RPMI 1640 med 10% FBS og 1% antibiotika (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) ble tilsatt til det nedre kammer og platen var inkubering i 20 timer. Migrere og invaderende celler ble kvantifisert ved hjelp av hematoxylin og eosin farging.

De luciferase reporter plasmid konstruksjoner

vill type 3 'UTR av ROCK1 inneholder bindingsseter for miRNA-135a ble forsterket ved hjelp gDNA fra SNU668 celler som mal. De korrelerte mutante konstruksjoner ble opprettet av mutere frøet regioner av miRNA-135 bindingssteder. Både villtype og mutant 3 'UTR ble klonet i nedstrøms av luciferasegenet i en pGL3 kontrollvektor. Konstruksjonene ble verifisert ved sekvensering.

Luciferase assay

luciferase analysene ble utført i SNU668 og YCC2 celler. SNU668 og YCC2-celler ble transfektert med hver av plasmidene (tom vektor [MOCK], ROCK1 3 'UTR villtype [WT], og ROCK1 3' UTR-mutant [MUT], som en miRNA-135a bindingssetet) sammen med miRNA- 135a ligner, miRNA-135a-hemmere, og negativ kontroll RNA i 24-brønners plater. To dager etter transfeksjon ble cellene høstet og lysert. Luciferase-analyser ble utført på de lysatene ved hjelp av et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Luciferase aktiviteten ble normalisert til p-galaktosidase.

Immunhistokjemisk farging

Immunhistokjemisk (IHC) farging ble utført for representative 20 saker fra ROCK1 lav og høy uttrykk grupper. Antigen henting ble gjort med varmebehandling i 30 min i pH 8,0 Tris-EDTA buffer (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) ved 95 ° C. Tissue objektglass ble inkubert ved 42 ° C i 30 minutter med anti-ROCK1 mAb (ab134181, klon EPR638Y, kanin monoklonale, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Negative kontroller ble brukt identisk med ikkeimmunisert kanin IgG. Resultatene ble tolket av en erfaren patolog (MC Kook).

Statistisk analyse

Skala data er gitt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Chi-square eller Fishers eksakte tester og Mann-Whitney U-test ble brukt for å sammenligne kategoriske variabler og kontinuerlige variabler, henholdsvis. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble anvendt for å sammenligne genuttrykksmønstrene mellom miRNA-135a og ROCK1. En multivariat logistisk regresjonsmodell ble brukt til å bestemme uavhengige faktorer assosiert med LN metastaser. Kovariater som var betydelig hjelp chi-square eller Fishers eksakte tester ( P
< 0,05) ble inngått den logistiske regresjonsmodellen. Alle data ble analysert ved hjelp av Stata 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, USA). En P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultater

miRNA-135a uttrykk nivåer er assosiert med progresjon og LN metastaser i EGC

En tidligere studie viste at miRNA-135a uttrykk er nedregulert i mage kreft cellelinjer [23]. Ved å bruke QRT-PCR, fant vi også at miRNA-135a uttrykk er nedregulert i ulike magekreft cellelinjer sammenlignet med det i en normal gastrisk epitel cellelinje (figur 1A).

Men sammenhengen mellom miRNA-135a uttrykk og kliniske resultater i magekreft er ikke undersøkt. Derfor vi målte miRNA-135a uttrykk nivåer i grunnskolen magekreft og tilhørende nivåer i normalt vev fra 59 pasienter med EGC. Ned- og opp-regulering av gener i tumorvevet i forhold til normalt vev ble definert som forholdet mellom tumor til normale vev genuttrykk nivåer av < 1,0 og >. 1,0, henholdsvis

Motsatt til resultatet av in vitro
eksperiment, bare 20 (33,9%) av 59 pasienter med EGC oppviste nedregulering av miRNA-135a uttrykk. Men disse pasientene viste signifikant et mer avansert stadium (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; råolje odd ratio [OR], 2,11; 95% konfidensintervall [CI], 01.08 til 04.10) og en høyere forekomst av LN metastaser (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014; urene OR, 2,73; 95% CI, 1,50 til 4,98) enn de med oppregulering av miRNA-135a ekspresjon (tabell S1). Sensitivitet og spesifisitet av miRNA-135a uttrykk status for prediksjon av LN metastaser var 75,0% og 72,5%, henholdsvis. I tillegg kan pasienter med mer avansert stadium (figur 1B) eller LN metastase (figur 1C) viste en signifikant lavere forhold av tumor til normale miRNA-135a ekspresjonsnivåer enn de med stadium IA eller uten metastase LN. En multivariabel logistisk regresjonsanalyse viste også at miRNA-135a nedreguleringen ble uavhengig assosiert med metastase LN (justert OR, 8,04; 95% CI, 1,08 til 59,81; p = 0,042; Tabell 1). Sammen er disse funnene tyder på at nedregulering av miRNA-135a uttrykk kan være forbundet med magekreft progresjon inkludert LN metastaser.

miRNA-135a undertrykker magekreft celle levedyktighet, EMT, migrasjon og invasjon

for ytterligere å undersøke sammenhengen mellom miRNA-135a og kliniske utfall, utførte vi funksjonelle analyser for celle levedyktighet, cellesyklus, EMT, migrasjon og invasjon i mage kreft cellelinjer. Overekspresjon av miRNA-135a av miRNA-135a ligner undertrykte betydelig celle levedyktighet (figur 2A) og økt subdiploid brøkdel av SNU668 celler, en cellelinje som sjelden uttrykker miRNA-135a (figur 2B), noe som tyder på økt apoptose av mage kreftceller. Imidlertid undertrykkelse av miRNA-135a ved miRNA-135a-inhibitorer induserte hverken en økning i cellelevedyktigheten og heller ikke en subdiploid fraksjon reduksjon i YCC2-celler, en cellelinje som uttrykker store miRNA-135a (figur 2A og 2B). Vi har også undersøkt sammenhengen mellom miRNA-135a uttrykk og EMT i magekreftceller, fordi miRNA-135a nedregule var en uavhengig risikofaktor for LN metastaser i EGC pasienter (tabell 1). Øket ekspresjon av miRNA-135a er forbundet med undertrykkelse av EMT og viste en økning i ekspresjon av E-cadherin og undertrykkelse av både N-cadherin og Slug i SNU688 celler. I motsetning til inhibering av miRNA-135a ekspresjon resulterte i aktivering av EMT, inkludert undertrykkelse av E-cadherin ekspresjon og oppregulering av både N-cadherin og Slug ekspresjon i YCC2 celler (figur 2C). I vurderingen for funksjonelle konsekvenser, overekspresjon av miRNA-135a av miRNA-135a ligner undertrykte betydelig migrasjon og invasjon evner SNU668 mage kreftceller (figur 2D). Motsatt, blokade av miRNA-135a av miRNA-135a-hemmere betydelig økt migrasjon og invasjon av YCC2 mage kreftceller (figur 2E). Samlet våre resultater antydet at miRNA-135a er en svulst undertrykkende regulator for magekreft spredning og metastasering.

ROCK1 er et mål gen av miRNA-135a i magekreft

For å belyse mekanismene som ligger til grunn effektene av miRNA-135a på kliniske utfall, vi søkte antatte mål ved hjelp av TargetScan 6,2 database. Av 718 bevart mål, valgte vi mål med høyest poengsum som nedregulering kan føre til økt kreftcellevekst, migrasjon og invasjon. Vi har funnet at ROCK1 kan være et målgen av miRNA-135a fordi inhibering eller undertrykkelse av ROCK1 har blitt rapportert å fremme apoptose og for å undertrykke migrering, invasjon, og proliferasjon av kreftceller inkludert de av magekreft [28] - [30]. TargetScan analyse viste at den 3'UTR sekvensen av ROCK1 har en tilgjengelig bindingssete for miRNA-135a (figur 3A). For å bekrefte om ROCK1 er et mål for miRNA-135a, ble en luciferase assay utført. Luciferase 3'UTR konstruksjoner er beskrevet i metodedelen var co-transfektert inn SNU688 celler med miRNA-135a ligner og inn YCC2 celler med miRNA-135a-hemmere. Vi har også bygget ROCK1 3'UTR MUT av punktmutasjon C → G i den mulige bindingsstedet (figur 3A). Den relative luciferase-aktivitet av de ROCK1 3'UTR WT var signifikant økt i nærvær av miRNA-135a-inhibitorer (figur 3B). Motsatt denne aktiviteten ble betydelig redusert i nærvær av miRNA-135a ligner (Figur 3C). I mage kreft cellelinjer, miRNA-135a og ROCK1 viste en motsatt uttrykk mønster. Western blot analyse viste at ROCK1 ekspresjon ble nedregulert i nærvær av miRNA-135a etterligner, og oppregulert i nærvær av miRNA-135a-inhibitorer (figur 3D og 3E). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at miRNA-135a undertrykker ROCK1 uttrykk ved direkte rettet mot sin 3'UTR.

Uttrykk for ROCK1 er omvendt korrelert til at av miRNA-135a hos pasienter med EGC

Analysis av 59 pasienter med EGC viste at uttrykket nivåer av ROCK1 hadde en signifikant negativ korrelasjon med de av miRNA-135a (r = -0,697, p < 0,001; figur 4A). I tillegg kan pasienter med oppregulering av miRNA-135a ekspresjon hadde signifikant lavere nivåer av ROCK1 proteinekspresjon enn de med nedregulering av miRNA-135a (gjennomsnittlig tumor til normal-forholdet, 0,81 vs. 1,55, s < 0,001; figur 4B) .

ROCK1 er assosiert med LN metastaser i EGC og er involvert i magekreft celle migrasjon og invasjon trykt av miRNA-135a

For å ytterligere evaluere sammenhengen mellom ROCK1 uttrykk og kliniske resultater i EGC, vi analyserte mønstre av ROCK1 uttrykk i referanse til LN metastase status av inkluderte pasienter. Pasienter med LN metastase hadde en signifikant høyere ekspresjon av ROCK1 protein enn de uten LN metastase (midlere svulst til normal-forholdet, 1,86 vs. 0,93, p = 0,007; figur 5A). Videre nivåer av ROCK1 IHC-farging var lik dem fra ROCK1 ekspresjon i Western blot-analyse ( ie
, pasienter uten LN metastase hadde svake IHC fargemønstre [Figur 5B], men de med LN metastase hadde sterk positiv IHC-farging [Figur 5C]).

til slutt, for å undersøke om de undertrykte migrasjons- og invasjons evner tillagt av miRNA-135a oppregulering observert i mage kreft cellelinjer var resultat av ROCK1 oppregulering, utførte vi migrasjon og invasjon analyser ved hjelp av magekreft cellelinjer transfektert med spesifikk ROCK1 siRNA. ROCK1 siRNA trykt trekkende og invasive aktiviteter i SNU668 celler (Figur 5D). I YCC2 celler co-transfektert med miRNA-135a-hemmere og ROCK1 siRNA (figur 5E), migrasjon og invasjon analyser viste at hemming av ROCK1 av siRNA betydelig svekket de styrke trekkende og invasive effekter av miRNA-135a nedregulering av miRNA-135a-hemmere (Figur 5F).

til sammen tyder disse resultater på at ROCK1 er forbundet med metastase i LN EGC pasienter, og at dette er et resultat av øket ROCK1 ekspresjon i sammenheng med miRNA-135a nedregulering. Derfor kan ROCK1 være involvert i miRNA-135a-trykt magekreft metastaser.

Diskusjoner

I denne studien fant vi at miRNA-135a hadde svulst undertrykkende roller i magekreft. Hos pasienter med EGC, nedregulering av miRNA-135a var en uavhengig risikofaktor for LN metastaser. I magekreftceller, oppregulert miRNA-135a trykt magekreftutvikling ved å undertrykke celleproliferasjon, EMT, og metastasering. Videre har vi også identifisert et nytt mål gen av miRNA-135a, ROCK1, som ble assosiert med LN metastaser i magekreft.

Hos pasienter med EGC, er evaluering av LN metastaser før behandling et viktig skritt i bestemmelsen av behandlingsstrategier. Mindre invasive behandlinger som for eksempel endoskopisk reseksjon [5] - [7] eller fast punkt LN navigasjon kirurgi [9], [10] kan være mulig i EGC pasienter uten LN metastasering. Disse behandlingsmetoder har forbedret pasientenes livskvalitet i forhold til sene komplikasjoner forbundet med standard kirurgiske behandlinger, inkludert dumping syndrom, vekttap, og reflux-relaterte symptomer [31]. Derfor er mer spesifikke og sensitive biomarkører som kreves for å forutsi status for LN metastase hos pasienter med EGC. I denne studien, miRNA-135a nedregule var en selvstendig faktor for LN metastaser, og prediksjon verdien av miRNA-135a uttrykk status var relativt høy med en sensitivitet 75% og en spesifisitet 73%. Selv om ytterligere validering studier er nødvendig, disse resultatene viste at måling av miRNA-135a nivåer før bestemme behandling plan for EGC pasienter kan være en nyttig test for å forutsi LN status.

Interessant, miRNA-135a har blitt rapportert å være svulst undertrykkende og onkogen. Overekspresjon av miRNA-135a har vært forbundet med undertrykkelse av tumorvekst og proliferasjon i nyrecellekarsinom [21] og med økt apoptose og bedre sykdomsfri overlevelse i lymfom [22]. I motsetning til dette ble miRNA-135a som er involvert i kolorektal cancer progresjon [32] og i øket brystcellemigrering og invasjon [33]. I denne studien ble miRNA-135a vist seg å være en svulst undertrykkende miRNA, som er i samsvar med resultatet av en tidligere studie [23]. Spesielt, jo høyere uttrykk for miRNA-135a trykt flere trinn av magekreft inkludert spredning, migrasjon og invasjon. Videre har vi også funnet at miRNA-135a kan undertrykke EMT, som er rapportert å være assosiert med initiering av det flertrinnsfremgangsmåte for karsinogenese og fremming av metastase [34], [35]. Før denne studien, har sammenhengen mellom miRNA-135a og EMT ikke undersøkt, men tidligere studier har vist at mirnas som miRNA-27 [19], miRNA-200 familie [20], miRNA-7 [36] og miRNA-1228 [37] undertrykke EMT gjennom sine egne mål gener i magekreft. Til sammen er miRNA-135a en svulst undertrykkende miRNA i magekreft.

En tidligere studie analysere 353 menneskelige mage kreft vev viste at uttrykk mønstre av mirnas er mangfoldig og at noen mirnas var assosiert med progresjon og prognose i mage kreft [14]. I studien ble miRNA-135a klassifisert som en onkogene miRNA i magekreft basert på resultatene av DNA microarray-analyser. Men i en fersk [23] og vår studie, miRNA-135a fungerte som en tumor suppressor tross for den høye frekvensen av pasienter med miRNA-135a oppregulering. Selv om mange pasienter (66%) hadde oppregulering av miRNA-135a som ligner på resultatet av en tidligere studie [14], disse pasientene viste en betydelig mindre avansert stadium og en lavere rate av LN metastaser. Videre, videre in vitro
studier viste også at en høyere uttrykk for miRNA-135a ble forbundet med undertrykkelse av magekreftutvikling. Disse resultatene tyder på at uttrykk mønstre av mirnas kan være forskjellig fra kliniske utfall, og derfor å bekrefte de eksakte roller spesifikke mirnas, videre studier er nødvendig.

ROCK1 er medlem av Rho-forbundet serin /treonin kinase-familien, som fungerer som en sentral regulator av aktin cytoskjelettet organisasjon og dynamikk [23], [38]. ROCK1 har en rekke funksjoner i tumorigenesis inkludert migrasjon, invasjon og metastasering [28]. ROCK1 er et mål for flere miRNAs i ulike kreftformer, inkludert miRNA-584 i nyrecellekreft [39], miRNA-335 i neuroblastom [40], og miRNA-146a i prostata kreft [41]. I magekreft, har ROCK1 vært positivt korrelert med LN metastaser og TNM stadium [42], og er involvert i miRNA-148a-indusert undertrykkelse av magekreft celle migrasjon og invasjon [30]. Videre ROCK1 inhibitor fremmet apoptose i magekreftceller [29]. I denne studien fant vi at ROCK1 er et mål for miRNA-135a i magekreft og dens uttrykk er positivt assosiert med LN metastaser i EGC pasienter. In vitro
Forsøkene viste også at ROCK1 er involvert i magekreft cellemotilitet og invasjon. Disse resultatene antyder at ROCK1 kan være en ny terapeutisk mål med evnen til å inhibere gastrisk cancer metastase.

Som konklusjon, har vi identifisert miRNA-135a som en ny prognostisk biomarkør for LN metastase hos pasienter med EGC og viste at miRNA-135a trykkes magekreftutvikling ( dvs.
, spredning, EMT, og metastase i mage kreft cellelinjer) ved å målrette ROCK1. Selv om disse funnene krever validering i andre uavhengige pasientgrupper, foreslår de at miRNA-135a og målet genet ROCK1 kan være en ny biomarkør og terapeutisk mål for magekreft med LN metastaser.

Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1 .
Clinicopathologic karakteristikker av pasienter med tidlig magekreft i henhold miRNA-135a uttrykk status
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085205.s001 plakater (DOC)

• PLoS ONE: Sammenhengen mellom Polymorfisme i XRCC1 Gene og behandlingsresultater for pasienter med avansert magekreft: en systematisk oversikt og meta-analyse
• PLoS ONE: Targeting cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK alarm og hemmer celleproliferasjon i Gastric Cancer