PLOS ONE: Flotillin2 expressão se correlaciona com níveis de HER2 e mau prognóstico no câncer gástrico

Abstract

Objectivo

gene Flotillin é conhecido como um promotor de tumor ou supressor, dependendo do tipo de tumor ou estágio do tumor. Nós teve como objetivo investigar o significado clínico da expressão da proteína flotillin2 no câncer gástrico.

Métodos

Foram examinados os níveis flotillin2 e erbB2 em tissue microarray de 282 amostras de câncer gástrico e analisou a associação entre flotillin2 níveis, fatores clínico-patológicas e prognóstico. A regulamentação da erbB2 por flotillin2 foi examinado com as células cancerosas gástricas transfectadas com siRNA flotillin2.

Resultados

Flotillin2 parcialmente co-localizados com erbB2 na membrana plasmática como detectado por microscopia confocal, os níveis de erbB2 foram reduzidos após flotillin knockdown em células cancerosas SGC-7901, ea expressão de flotillin2 foi positivamente correlacionada com a de erbB2. Na mucosa gástrica não neoplásico, flotillin2 não foi expressa no compartimento epitelial. No cancro gástrico, coloração positiva de flotillin2 foi mostrado em 129 (45,7%) de 282 casos, também, foi significativamente associado com um grau de Lauren, tipo histológico, invasão linfática e localização do tumor. Além disso, a análise de sobrevivência mostrou que a expressão flotillin2 foi um fator prognóstico independente de sobrevida pobres (p < 0,001).

Conclusões

Estes resultados indicam que existe uma correlação positiva entre flotillin2 e os níveis de expressão erbB2, flotillin2 talvez envolvidos na estabilização de erbB2 na membrana plasmática, flotillin2 é significativamente correlacionada com a progressão do câncer e mau prognóstico no câncer gástrico

Citation:. Zhu Z, Wang J, Sun Z, Sun X, Wang Z, Xu H (2013) Flotillin2 expressão se correlaciona com níveis de HER2 e mau prognóstico no câncer gástrico. PLoS ONE 8 (5): e62365. doi: 10.1371 /journal.pone.0062365

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria

Recebido: 15 de fevereiro de 2013; Aceito: 20 de março de 2013; Publicado em: 02 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Natural Science Foundation da China (81272718), Fundo de Investigação de Jovens Pesquisadores "para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (20122104120008) e do Fundo de Pesquisa científica da Primeira Hospital da China Medical University (FSFH1208). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitas proteínas da membrana plasmática são conhecidos por estar envolvidos na proliferação celular, a adesão celular, motilidade celular e a invasão de células tumorais, representando mais de dois terços dos alvos de drogas actualmente conhecidas. A membrana da célula e as proteínas associadas são de interesse substancial em relação a vários aspectos do tumor, a partir de mecanismos carcinogénicos e metastáticos ao diagnóstico e terapêutica molecular [1]. Flotillins estão associados com vesiculares invaginações da membrana plasmática, e actuam como reguladores de transdução de sinal [2]. Entre flotillin membros da família, existem dois genes diferentes (flotillin flotillin1 e 2), a expressão da proteína flotillin2 foi avaliado em algumas linhas celulares de cancro humano e amostras de tumor [3], [4], [5], [6]. Desde flotillin2 interage directamente com moléculas de sinalização, tais como receptores, quinases, moléculas de adesão e as proteínas G, que atua como um modulador do tumor por meio da regulação da proliferação celular, diferenciação, apoptose, adesão e invasão [4].

A sobreexpressão de erbB2 (receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2), também conhecida como HER2, é a tirosina-cinase associada a membrana, que pode conduzir à activação dos sistemas de transdução de sinal celular, resultando em eventos de transformação celular e a proliferação de células associadas com o cancro, tais como cancro da mama câncer, câncer de ovário e câncer gástrico [7], [8], [9]. nível de ErbB2 alta expressão foi significativamente correlacionado com a invasão do tumor aumentou, metástase, resistência à quimioterapia, e mau prognóstico de doentes [10]. Estudos recentes demonstraram que a proteína flotillin2, entre outras funções, foi envolvida em mecanismos endocíticos e processos celulares de tráfico, e verificou-se ser em um complexo molecular com erbB2 [11]. Para entender se a estabilização da erbB2 na membrana plasmática é mediada por flotillin2 e seu significado clínico, foi realizada membrana análise proteômica comparativa de câncer gástrico humano.

Neste estudo, descrevemos os níveis flotillin2 e expressão erbB2 são positivamente correlacionado a um nível celular, bem como no tecido de cancro gástrico e que mostram que erbB2 é internalizado e degradado por um mecanismo mediante o esgotamento flotillin2. Além disso, o significado clínico-patológico de flotillin2 foi ainda avaliada usando amostras de tecido de arquivo e análise estatística. Descobrimos que flotillin2 é um fator independente de prognóstico, também um potencial romance biomarcador para linfonodo metástases. Nossos dados irá facilitar a compreensão da carcinogênese e mineração biomarcadores gástrico para o diagnóstico e tratamento desta doença.

Materiais e Métodos

Amostras de tecidos e Follow-Up

A total de 282 pacientes que tinham cirurgia para câncer gástrico entre Janeiro de 2006 e Dezembro de 2009, o primeiro hospital afiliada da China Medical University foi selecionado para este estudo. Todas as amostras de pacientes derivadas foram coletados e arquivados sob protocolos aprovados pelos Institutional Review Boards do Hospital China Medical University Primeira filiados. O diagnóstico foi confirmado por pelo menos dois patologistas e estadiamento foi baseado nos achados patológicos segundo a 7ª Comité Misto americana sobre as orientações câncer. A duração média do acompanhamento foi de 51 (variação, 5-78) meses.

Os 282 pacientes que se submeteram gastroctomy foram submetidos a fechar observação clínica, incluindo tórax e tomografia computadorizada abdominal, nível de CEA, e exames de sangue em 2 a intervalos de 3 meses e uma gastroscopia anual. sobrevivência (SO) taxas globais foram definidos como o intervalo entre a cirurgia inicial para recorrência clinicamente ou radiologicamente comprovada ou metástase e morte, respectivamente. A data final do estudo de acompanhamento para a realização da análise foi 29 de junho de 2012.

Ética declaração

A aprovação ética para esta pesquisa foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa da China Medical University, China. Todos os pacientes que fornecem tecido do tumor, bem como amostras de tecido gástrico normais assinaram um termo de consentimento antes da remoção cirúrgica do carcinoma gástrico para permitir essa investigação a realizar.

construção TMA e imunohistoquímica

Hematoxilina e eosina (H & e) -stained lâminas foram rastreadas para o tecido tumoral e tecido não canceroso óptimo adjacente ao tumor (pelo menos 2 cm do tumor) e lâminas de TMA foram construídos com um instrumento manual de arraying tecido. Dois núcleos foram recolhidos de cada, (FFPE) da amostra fixada em formalina embebido em parafina de tecido do cancro gástrico e a partir de cada amostra normal da mucosa gástrica utilizando um instrumento diâmetro do punção de 1,0 mm. As amostras do mesmo paciente foram vistos ao lado do outro para assegurar condições de reacção semelhantes, para o tecido normal e de tumor do referido paciente. Análise imuno-histoquímica foi realizada em amostras de FFPE como descrito anteriormente utilizando um kit Envision (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) [12]. Panela de pressão de recuperação de antigénio mediada foi realizada em tampão de citrato (pH 6,0) durante 7 min. As secções foram incubadas com 1 200 diluição dos anti-flotillin2 (Santa Cruz, SC-25507) e erbB2 (SC-33684) durante a noite a 4 ° C, e, em seguida, incubadas com anticorpo de cabra anti-ratinho ou anti-coelho Envision Plus System-HRP ( Dako Cytomation) durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes em PBS durante 10 minutos cada, as secções foram incubadas com DAB durante 1 min, contra-coradas com Hematoxilina de Mayer, desidratados, e montado.

Avaliação da imuno-coloração

A imunorreactividade foi avaliada independentemente por dois pesquisadores que estavam cegos para o resultado do paciente. A avaliação baseou-se a intensidade de coloração e a extensão da coloração. intensidade de coloração para flotillin2 e erbB2 foi pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderada), e 3 (forte). medida coloração foi pontuada como 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%), dependendo da percentagem de positivos células -stained. A soma da intensidade de coloração e as pontuações de coloração medida foi usada como a contagem final de coloração. Os espécimes foram divididos em três grupos de acordo com suas notas globais: 0-1, negativo, 2-4, fracamente positivo e 5-7, forte

análise FISH positivo para células gástricas cancerosas
<. p> a amplificação do gene erbB2 foi determinada pelo método de FISH de duas cores utilizando o kit de sonda de DNA Passvision HER2 (Vysis Inc. Downers Grove, IL, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A sonda HER2 Espectro de laranja contém uma sequência de ADN específica para o local do gene humano ErbB2 e hibrida com região 17q11.2-q12 do cromossoma humano. O CEP 17 (cromossomo enumeração sonda 17) usado como um controle contém DNA alfa-satélite. O núcleo foi contrastado com 40, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Os camundongos nus do modelo de câncer gástrico (SGC-7901, MGC-803 e BGC-823) foram feitas como descrito anteriormente [13], [14]. Os slides de tumor foram observadas em BX60 microscópio de fluorescência equipado com câmera digital (DP50) (Olympus, Tóquio, Japão), e as imagens foram capturadas com software Visor. Uma célula foi considerado para mostrar amplificação quando um cluster definido ou mais de 10 sinais de erbB2 foi encontrado.

Cultura celular e transfecções

linhas celulares de cancro gástrico SGC-7901 (moderadamente diferenciado), MGC -803 e BGC-823 (pouco diferenciado) foram todos comprados a partir do banco de células da Academia chinesa de Ciências. linhas celulares de cancro foram mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone cidade, Logan, EUA) suplementado com 10% de FBS. Todas as linhas celulares foram em uma atmosfera de CO2 a 5% humidificada, a 37 ° C. Para siARN transfecção, as células foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 2 × 10 ^{5 células /poço, 24 h antes da transfecção, siRNAs segmentação não sobrepostos partes da sequência de ARNm foram utilizados para flotillin2. Para a depleção de flotillin2, um conjunto de dois siARN diferente com as sequências da construção de direccionamento GAGGUUGUGCAGCGCAAUU e GGAUGAAGCUCAAGGCAGA [15], as células foram semeadas a cabo sem antibióticos, cultivadas durante 24 horas e transfectadas utilizando Lipofectamine reagente de transfecção (Invitrogen) de acordo com o fabricante do procedimento. Após 4 h de transfeco, o meio foi mudado para meio completo de crescimento contendo soro e antibióticos, e as células foram cultivadas durante 3 dias antes de experiências foram iniciadas.}

imunofluorescência, Western blot e qRT-PCR

As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas em gelo em tampão RIPA com inibidores de protease e quantificada pelo método BCA. 50 ug de proteína de lisados ​​foram resolvidos em gel de SDS de poliacrilamida a 6%, electrotransferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA) e bloqueadas em leite seco magro a 5% em solução salina tamponada com Tris (pH = 7,5). As membranas foram imunotransferidas durante a noite a 4 ° C com anti-flotillin2 /anticorpos policlonais erbB2 como IHC descritas acima, respectivamente, em seguida, seguidos pelos seus respectivos anticorpos secundários. Os sinais foram detectados por quimioluminescência aumentada (Pierce, Rockford, IL). Para imunofluorescência, a ligação do anticorpo primário foi visualizado por anticorpo IgG anti-ratinho de cabra TRITC /conjugada com FITC, e as lâminas foram então examinada por um microscópio confocal de varrimento laser.

amplificações por PCR para a quantificação de flotillin2, erbB2 e ARNm GAPDH em células foram efectuadas num sistema LightCycler (Roche Applied Science) utilizando o kit do LightCycler FastStart DNA mestre SYBR Green I (Roche Diagnostics). Em resumo, uma mistura mestre foi preparada em gelo, contendo 1 ul de DNA complementar, 2 ul de ADN LC Mestre SYBR Green I misturar, 50 ng de iniciadores, e MgCl2 4 mM. As condições de amplificação durante 40 ciclos de desnaturação a consistiu de 95 ° C durante 10 s, emparelhamento a 65 ° C durante 10 s e extensão a 72 ° C durante 10 s. Os produtos foram, em seguida, submetido a um gradiente de temperatura entre 68 a 95 ° C a 0,1 ° C /s, com monitorização contínua da fluorescência para produzir curvas de fusão dos produtos. Os níveis de expressão foram normalizadas para expressão de mRNA erbB2.

A análise estatística

O χ ^{2 de teste ou foi utilizado o teste exato de Fisher para proporções, conforme apropriado, para analisar a relação entre flotillin2 e expressão erbB2 e as variáveis ​​clínico-patológicas. As taxas de sobrevivência foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças entre as curvas de sobrevivência foram analisados ​​pelo teste de log-rank. Univariada riscos proporcionais de Cox regressões foram aplicados para estimar a taxa de risco individuais (HR). As variáveis ​​significativas nas análises univariadas (p < 0,05) foram, então, colocados em análise multivariada. O RH com intervalo de confiança de 95% (CI) foi medida para estimar o risco de perigo de fatores individuais. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises foram realizadas utilizando o SPSS software estatístico programa versão 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).}

Resultados

expressões de flotillin2 e erbB2 no cancro gástrico

cortes corados de microarrays de tecido (TMA) de 282 núcleos de tecido foram classificados para a sua citoplasmática intensidade de coloração imuno-histoquímica contra flotillin2 e proteína erbB2. Os 282 amostras legíveis incluídos 282 carcinoma gástrico, 181 peri-carcinoma e 101 amostras de tecido epitelial gástrica normal. As células tumorais mostraram coloração da membrana difusa típica de flotillin2 pode ser encontrado no carcinoma gástrico (Figura 1a) com o local semelhante de ErbB2 (figura 1b), em não-neoplásicas da mucosa gástrica, flotillin2 e erbB2 foram ambos não expressa. A coloração positiva de flotillin2 foi mostrado em 129 (45,7%) de 282 amostras, erbB2 foi de 59 (20,9%). A amplificação do gene erbB2 foi determinado por FISH de duas cores de xenoenxertos em ratinhos nus. a amplificação do gene de ErbB2 em conjunto um padrão (vermelho) foi observada em MGC-803, células BGC-823 e SGC-7901, erbB2 sobre-expressão apenas em células de cancro gástrico humano SGC-7901 (Figura 2A-C).

associação entre as expressões de flotillin2 com erbB2

Foi analisada a localização celular da erbB2 e flotillins na célula câncer gástrico SGC-7901. Poderíamos mostrar por microscopia confocal que flotillin2 parcialmente co-localizam com a erbB2 na membrana plasmática (Figura 1A-E). Os nossos dados mostram que a expressão de flotillin2 fazer tem uma correlação significativa com a de erbB2 (p < 0,001), na análise imuno-histoquímica de arranjo de tecido (Tabela 1). Além disso, a interação entre flotillins e erbB2 pode ser demonstrada por immunoblot (Figura 2d) e qualidade experiências de RT-PCR (Figura 2E), derrubando de flotillin2 endógena resultou na demolição de erbB2. A seguir, analisou o impacto da flotillins sobre a internalização e consequente degradação da erbB2. Conforme descrito abaixo, erbB2 e HER2 também têm muitas relações de fatores clínico-patológicos em comum.

Associação entre flotillin2 e fatores clínico-patológicos

Neste estudo, 282 pacientes com câncer gástrico com suficientes materiais de tumores primários e siga tempo -up estavam disponíveis, cujos tecidos foram recolhidos durante os últimos 6 anos. Tabela 2 deu a estatística descritiva para os parâmetros medidos para estes pacientes. A duração média do acompanhamento foi de 54 meses (intervalo de 9-78 meses). A taxa (OS) sobrevida de 5 anos global foi de 48,2%

Descobrimos que a expressão aumentada de flotillin2 e erbB2 foi tanto significativamente associada com o tipo histológico (p < 0,001, respectivamente)., Grau Lauren (p < 0,001, respectivamente) e invasão linfovascular (p = 0,059 e p < 0,001, Tabela 2). Além disso, flotillin2 foi significativamente correlacionado com o tamanho do tumor (p = 0,006), estágio T (p = 0,001) e nó de linfa de metástases (p = 0,033, Tabela 2). No entanto, não foi observada correlação significativa entre a expressão flotillin2 e outros parâmetros, incluindo idade, sexo, localização, tipo macroscópica e metástase hepática.

A expressão de flotillin2 em relação ao prognóstico

Usando proporcional perigos de regressão de Cox modelo, as relações entre univariadas características do tumor e os resultados dos doentes foram obtidos (Tabela 3). Dos 282 pacientes analisados, diferenças estatisticamente significativas na OS foram vistos, com um mau resultado para os pacientes com maior coloração das flotillin2 e erbB2. Outros fatores preditivos que foram encontrados para ser correlacionados com OS foram a idade (P = 0,042), tamanho (P = 0,001), tipo macroscópica (P = 0,001), PT (P < 0,001) e do estádio pN (P < 0,001) (Tabela 3). Usando o teste log-rank, houve diferenças significativas na OS entre pacientes positivos e negativos da flotillin2 e erbB2 (P < 0,001, respectivamente) em todos os pacientes foram mostrados na Figura 3.
multivariada modelo de regressão de risco proporcional

Cox foi então usada para determinar quais fatores foram em conjunto predicativo do OS. As variáveis ​​que foram pensados ​​para ser significativo na análise univariada foram incluídos na análise. O significado, ajustado para outras covariáveis, foi dado na Tabela 4. A análise multivariada do efeito conjunto de flotillin2 e erbB2 com outros fatores prognósticos mostraram que pT (P < 0,001) e do estádio pN (P < 0,001) flotillin2 (HR = CI 1.485, 95%. 1,278-1,725, P < 0,001) foi um marcador melhor forma independente prognóstico que erbB2 (HR = 1,375, IC 95%: 1,133-1,947 P = 0,004) para OS (Tabela 4)

Discussão

A avaliação dos fatores prognósticos biológicos é de importância clínica, especialmente para uma doença com resultado ruim como o câncer gástrico. O presente estudo confirmou a expressão constitutiva de flotillin2 em amostras de tecido de câncer gástrico e linhas de células, também descobrimos que flotillin2 foi um fator prognóstico independente de sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico. Além disso, o presente estudo demonstrou, pela primeira vez, uma relação positiva entre as expressões de flotillin2 e HER2 no cancro gástrico. No estudo anterior, Pust et al. (2012) verificaram que as linhas celulares de cancro de mama derivadas de metástases distantes mostrou um nível mais elevado de ARNm flotillin e expressões proteína do que as derivadas de cancro gástrico primário. Assim, explicaram o papel de flotillin2 como um modulador do tumor tecido- e fase-específica, onde actua como um inibidor ou promotor de formação e progressão do tumor de acordo com os seus parceiros de interacção de proteínas, tais como receptores de factores de crescimento ou moléculas de adesão celular [11] . Nossos resultados concordam com esta descrição porque a expressão flotillin2 no presente estudo foi positivamente correlacionada com a expressão de HER2, que foi positivamente correlacionada com mau prognóstico no câncer gástrico.

Os dados de duas publicações recentes indicam que flotillin tem um papel funcional na sinalização do receptor de tirosina-cinase, especialmente na activação de sinalização da MAP cinase e a regulação da sinalização do FGF em células HeLa [16], [17]. Nas células de cancro da mama SKBR3, o resultado que a AKT fosforilação é reduzida mediante a depleção de flotillin-2, mas não após flotillin-1 knockdown, concordou com os nossos dados. Assim, tirosina-quinases receptoras ou vias de sinalização mediada por receptor de tirosina cinase pode ser regulada por flotillins de diferentes maneiras e /ou de uma forma específica do tipo de célula, é possível que as diferentes vias de sinalização desencadeada por erbB2 são regulados por qualquer flotillin2. No entanto, os níveis reduzidos de erbB2 desencadeada por flotillin2 suporte knockdown nossa hipótese de uma estabilização mediada por flotillin2 de ErbB2.

ErbB2 é conhecida por estar associada com mau prognóstico no cancro gástrico, flotillins foram descritos para ser associado a tumor gênese. Nós demonstramos que flotillin2 co-localiza com erbB2 na membrana plasmática e desempenha um papel funcional na regulação da erbB2 no câncer gástrico. Alta expressão de flotillin2 está associada com mau prognóstico e tempo de sobrevida reduzida, e emerge como um preditor potencial de recaída no câncer gástrico. Tem sido relatado que os receptores de estrogénio foram envolvidos na carcinogénese gástrica e flotillin2 interage com os receptores [18], [19], indica um impacto significativo da função flotillin2 sobre o desenvolvimento do cancro gástrico. Por outro lado, com base nos nossos estudos de microarranjos de tecido, a superexpressão flotillin2 foi altamente associada ao aumento da migração celular e transformação maligna levando a comprometimento de linfonodos e aumento da capacidade de invasão. Em nosso estudo, flotillin2 elevada e HER2 ambos mostraram uma correlação significativa com o tipo histológico (P < 0,001 ambos), grau Lauren (P < 0,001 ambos), enquanto flotillin2 também terá uma elevada relevância com estádio T (P < 0,001) e linfonodo metástase (P = 0,033). Esta correlação forte sugere que flotillin2 pode ser utilizada como um biomarcador para identificar subconjuntos de pacientes com cancro gástrico com um fenótipo mais agressivo. A análise multivariada demonstrou flotillin2 serve como um marcador de prognóstico melhor para prever o risco de metástases e recidiva (HR = 1,485, IC 95%: 1,278-1,725) do que Her2 (HR = 1,375, IC 95%: 1,133-1,947) para OS. Propomos que a sobre-expressão flotillin2 pode contribuir para o aumento da proliferação e do desenvolvimento de câncer gástrico.

Em conclusão, este é a primeira demonstração de uma correlação positiva entre os níveis de erbB2 flotillin2 e em células cancerosas gástricas cultivadas, bem como nos tecidos. Além disso, o nível de expressão flotillin2 correlaciona-se com mau prognóstico no câncer gástrico, indicando que flotillin2 pode ser um biomarcador de prognóstico para câncer gástrico. Verificou-se que os tumores sobre-expressam erbB2 são mais susceptíveis de serem resistentes ao tratamento com um (Herceptin trastuzumab /) terapia baseada em anticorpos, que se tornou a primeira linha de tratamento clínico em pacientes com erbB2 que sobre-expressam o cancro gástrico metastático [20] , [21]. No entanto, mesmo em combinação com outros medicamentos quimioterapêuticos, mais de 20% dos pacientes com erbB2-superexpressão não apresenta uma resposta ao tratamento. Assim, visando a expressão flotillin2, novas estratégias no tratamento do câncer pode ser desenvolvida.

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