PLoS ONE: Flotillin2 Expression correleert met HER2 Levels en een slechte prognose in Gastric Cancer

De abstracte

Doelstelling

Flotillin gen bekend als een tumor suppressor promotor of, afhankelijk van het type tumor of tumor stadium. Ons doel was om de klinische betekenis van flotillin2 eiwitexpressie bij maagkanker te onderzoeken.

Methods

We onderzochten flotillin2 en erbB2 levels in weefsel microarray van 282 maagkanker monsters en het verband geanalyseerd tussen flotillin2 niveaus, clinicopathologic factoren en de prognose. De regulering van erbB2 door flotillin2 werd onderzocht met flotillin2-siRNA getransfecteerde maagkanker cellen.

Resultaten

Flotillin2 gedeeltelijk co-gelokaliseerd met erbB2 in het plasmamembraan zoals gedetecteerd door confocale microscopie, het niveau van erbB2 daalden na flotillin knockdown in SGC-7901 kankercellen, en de expressie van flotillin2 positief gecorreleerd aan die van erbB2. In niet-neoplastische maagslijmvlies werd flotillin2 niet tot uitdrukking in de epitheliale compartiment. In maagkanker, positieve kleuring van flotillin2 werd getoond in 129 (45,7%) van de 282 gevallen, ook, het was significant geassocieerd met een Lauren rang, histologisch type lymfovasculaire invasie en tumor locatie. Bovendien overlevingsanalyse toonde dat flotillin2 expressie was een onafhankelijke prognostische factor slechte overleving (p < 0,001).

Conclusies

De resultaten geven aan dat een positieve correlatie bestaat tussen flotillin2 en erbB2 expressieniveaus, flotillin2 misschien betrokken zijn bij de stabilisatie van erbB2 in het plasmamembraan wordt flotillin2 significant gecorreleerd met kanker progressie en een slechte prognose bij maagkanker

Citation:. Zhu Z, Wang J, Z zon, Zon X, Wang Z, Xu H (2013) Flotillin2 Expression correleert met HER2 Levels en een slechte prognose bij maagkanker. PLoS ONE 8 (5): e62365. doi: 10.1371 /journal.pone.0062365

Uitgever: Joseph Najbauer, Universiteit van Pécs Medical School, Hongarije |

Ontvangen: 15 februari 2013; Aanvaard: 20 maart 2013; Gepubliceerd: 2 mei 2013 |

Copyright: © 2013 Zhu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81272718), Young Scholars 'Onderzoek Fonds voor de Doctoral Programma van Hoger Onderwijs van China (20122104120008) en het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek van de eerste Hospital van de China Medical University (FSFH1208). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Veel plasmamembraaneiwitten is bekend dat ze betrokken zijn bij celproliferatie, celadhesie, celmotiliteit en tumorcel invasie, die meer dan twee derde van bekende drug targets. Het celmembraan geassocieerde eiwitten van aanzienlijk belang met betrekking tot verschillende aspecten van de tumor, carcinogene en metastatische mechanismen moleculaire diagnostiek en therapie [1]. Flotillins zijn geassocieerd met vesiculaire instulpingen van het plasmamembraan en fungeren als regulatoren van signaaltransductie [2]. Onder flotillin familieleden, zijn er twee verschillende genen flotillin (flotillin1 en 2), flotillin2 eiwitexpressie gemeld in sommige menselijke kankercellijnen en tumormonsters [3], [4], [5], [6]. Aangezien flotillin2 direct met signaalmoleculen zoals receptoren, kinasen, adhesiemoleculen en G-eiwitten, het fungeert als een tumor modulator middel van de regulering van celproliferatie, differentiatie, apoptose, adhesie en invasie [4].

Overexpressie van erbB2 (humane epidermale groeifactor receptor 2), ook bekend als HER2, membraan-geassocieerde tyrosine kinase dat kan leiden tot de activering van cellulaire signaaltransductie, resulterend in de cellulaire transformatie en celproliferatie geassocieerd met kanker, zoals borstkanker kanker, eierstokkanker en maagkanker [7], [8], [9]. Hoge expressie van erbB2 is significant gecorreleerd met verhoogde tumorinvasie, metastase, resistentie tegen chemotherapie en slechte prognose van patiënten [10]. Recente studies toonden aan dat flotillin2 eiwit, onder andere functies, betrokken bij endocytische mechanismen en cellulaire transport processen, en bleek in een moleculair complex met erbB2 [11]. Te begrijpen of stabilisatie van erbB2 in het plasmamembraan wordt gemedieerd door flotillin2 en hun klinische betekenis, voerden we vergelijkende membraan proteoomanalyse van menselijke maagkanker.

In deze studie beschrijven we flotillin2 en erbB2 expressieniveaus zijn positief gecorreleerde op celniveau als bij maagkanker weefsel en laten we zien dat erbB2 wordt geïnternaliseerd en afgebroken door een mechanisme op flotillin2 uitputting. Bovendien werd de clinicopathologic betekenis van flotillin2 verder geëvalueerd met behulp van archiefmateriaal weefselmonsters en statistische analyse. We vonden dat flotillin2 is een onafhankelijk voorspeller, ook een potentiële nieuwe biomarker voor lymfeklier. Onze gegevens zal een goed begrip van maagkanker carcinogenese en mijnbouw biomarkers voor de diagnose en behandeling van deze ziekte te vergemakkelijken.

Materialen en methoden

Tissue Monsters en Follow-Up

A in totaal 282 patiënten die een operatie voor maagkanker had tussen januari 2006 en december 2009 op de eerste Affiliated hospital van de China Medical University werd geselecteerd voor deze studie. Alle patiënten afkomstige monsters werden verzameld en gearchiveerd onder protocollen door de Institutional Review Boards van de First Affiliated Hospital China Medical University goedgekeurd. De diagnose werd bevestigd door ten minste twee pathologen en enscenering werd op basis van pathologische bevindingen op basis van de 7e Amerikaanse Paritair Comité voor de richtlijnen Cancer. De mediane duur van follow-up was 51 (bereik 5-78) maanden.

De 282 patiënten ondergingen gastroctomy werden onderworpen aan klinische observatie, met inbegrip van de borst en de buik CT-beeldvorming, CEA-niveau te sluiten en bloedonderzoek in 2 tot 3 maanden intervallen en jaarlijks gastroscopie. Overall survival (OS) snelheden werden gedefinieerd als het interval van de eerste operatie klinisch of radiologisch bewezen recidief of metastase en dood, respectievelijk. De einddatum van de follow-up studie voor het uitvoeren van de analyse was 29 juni 2012.

Ethics statement

ethische goedkeuring voor dit onderzoek werd verkregen uit de Research Ethics Committee van de China Medical University, China. Alle patiënten verstrekken van tumorweefsel en normale maag weefselmonsters tekende een toestemmingsformulier voor de chirurgische verwijdering van de maagcarcinoom mogelijk te maken voor dit onderzoek uit te voeren.

TMA bouw en immunohistochemie

Hematoxylin en eosine (H &E) -stained objectglaasjes werden gescreend op optimale tumorweefsel en goedaardige tumor weefsel grenzend aan (minimaal 2 cm van de tumor) en TMA objectglaasjes werden uitgevoerd met een tissue handmatige arraying instrument. Twee kernen werden verzameld van elke formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) maagkanker weefselmonster en naar een normale maagslijmvlies monster met behulp van een 1,0-mm punch instrument. Monsters van dezelfde patiënt werden gespot naast elkaar te zorgen soortgelijke reactieomstandigheden voor de normale en tumorweefsel van de patiënt. Immunohistochemische analyse werd uitgevoerd op FFPE monsters zoals eerder beschreven onder toepassing van een Envision kit (Dako Cytomation, Glostrup, Denemarken) [12]. Snelkookpan gemedieerde antigen herstel werd in citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 7 min. Secties werden geïncubeerd met 1 200 verdunning van anti-flotillin2 (Santa Cruz, SC-25507) en erbB2 (SC-33684) overnacht bij 4 ° C en vervolgens geïncubeerd met geit anti-muis of anti-konijn Envision System Plus-HRP ( Cytomation Dako) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na drie keer spoelen in PBS gedurende 10 minuten elk, werden de coupes geïncubeerd met DAB gedurende 1 min, tegengekleurd met Mayer hematoxyline, gedehydrateerd en gemonteerd.

Evaluatie van immunohistochemische kleuring

immunoreactiviteit werd geëvalueerd onafhankelijk van elkaar door twee onderzoekers die werden verblind voor de patiënt uitkomst. De evaluatie is gebaseerd op de kleurintensiteit en de mate van kleuring. Kleurintensiteit voor flotillin2 en erbB2 werd gescoord als 0 (negatief), 1 (zwak), 2 (matig) en 3 (sterk). Kleuring mate werd gescoord als 0 (0%) 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) en 4 (76-100%), afhankelijk van het percentage positieve -stained cellen. De som van de kleurintensiteit en de kleuring mate scores werd als de uiteindelijke score kleuring. De monsters werden verdeeld in drie groepen op basis van hun totale scores: 0-1, negatief, 2-4, zwak positieve, en 5-7, sterke positieve

FISH-analyse voor maagkanker cellen
<. p> Amplificatie van het erbB2-gen werd bepaald door tweekleurige FISH met gebruik van Passvision HER2 DNA probe Kit (Vysis Inc. Downers Grove, IL, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Het HER2-Spectrum Orange probe een DNA-sequentie die specifiek is voor de humane erbB2-gen locus en hybridiseert tot regio 17q11.2-q12 van humaan chromosoom. De CEP 17 (chromosoom opsomming probe 17) als controle bevat alfa-satelliet DNA. De kern werd tegengekleurd met 40, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). De naakt muizen maagkanker model (SGC-7901, MGC-803 en BGC-823) bereid zoals eerder beschreven [13], [14]. De tumor glaasjes werden waargenomen onder BX60 fluorescentiemicroscoop uitgerust met digitale camera (DP50) (Olympus, Tokyo, Japan) en de beelden werden opgenomen met zoeker software. Een cel werd als amplificatie weergegeven wanneer een bepaalde cluster of meer dan 10 signalen voor erbB2 gevonden.

Celkweek en transfecties

Maagkanker cellijnen SGC-7901 (matig gedifferentieerd), MGC -803 en BGC-823 (slecht gedifferentieerde) werden al gekocht van de celbank van de Chinese Academy of Sciences. Kanker cellijnen werden in RPMI 1640 (Hyclone, Logan city, USA) aangevuld met 10% FBS gehouden. Alle cellijnen werden in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C. Voor siRNA transfectie werden cellen zonder geënt in platen met zes putjes bij een dichtheid van 2 x 10 ^{5 cellen /putje, 24 uur voorafgaande aan transfectie siRNA gericht op niet-overlappende delen van de mRNA-sequentie gebruikt voor flotillin2. Voor de uitputting van flotillin2, een pool van twee verschillende siRNA met de sequenties doelgericht gestuurde construct GAGGUUGUGCAGCGCAAUU en GGAUGAAGCUCAAGGCAGA [15], werden de cellen uitgezet zonder antibiotica gekweekt gedurende 24 uur en getransfecteerd door lipofectamine transfectie reagens (Invitrogen) volgens de fabrikant procedure. Na 4 uur transfectie werd het medium gewijzigd in compleet groeimedium bevattende serum en antibiotica, en de cellen werden gedurende 3 dagen voor de experimenten begonnen.}

Immunofluorescentie, Western blot en qRT-PCR

Cellen werden tweemaal gewassen met koude PBS en gelyseerd op ijs in RIPA buffer met proteaseremmers en gekwantificeerd BCA methode. 50 ug eiwit lysaten werden gescheiden op 6% SDS-polyacrylamidegel electroforese polyvinylideenfluoride membranen (Millipore, Bedford, MA) en geblokkeerd in 5% niet vette droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (pH = 7,5). Membranen werden overnacht immunoblotting bij 4 ° C met anti flotillin2 /erbB2 polyklonale antilichamen zoals hierboven beschreven IHC, respectievelijk, gevolgd door hun respectieve secundaire antilichamen. Signalen werden gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (Pierce, Rockford, IL). Immunofluorescentie voor de binding van primair antilichaam werd zichtbaar gemaakt door TRITC /FITC-geconjugeerd geit anti-muis IgG antilichaam en de objectglaasjes werden vervolgens onderzocht met een confocale laser scanning microscoop.

PCR amplificaties voor kwantificering van flotillin2, erbB2 en GAPDH mRNA in cellen werden gedaan in een LightCycler systeem (Roche Applied Science) met behulp van de LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I-kit (Roche Diagnostics). In het kort, werd een meester mengsel voorbereid op ijs, met 1 pl van complementaire DNA, 2 pl LC DNA Master SYBR Green I mixen, 50 ng primers, en 4 mM MgCl2. De amplificatieomstandigheden voor 40 cycli bestaande uit denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 s, hybridisatie bij 65 ° C gedurende 10 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 10 s. De producten werden vervolgens onderworpen aan een temperatuurgradiënt 68-95 ° C bij 0,1 ° C /s onder continu fluorescentie monitoring smeltcurven van de producten. De expressie niveaus werden genormaliseerd naar erbB2 mRNA expressie.

Statistische analyse

De χ ^{2-test of Fisher's exact test voor het aandeel werd gebruikt, voor zover van toepassing, om de relatie tussen flotillin2 te analyseren en erbB2 expressie en clinicopathologische variabelen. De overlevingskansen zijn berekend door de Kaplan-Meier-methode en de verschillen tussen de survival curves werden onderzocht door de log-rank test. Univariate Cox proportional hazards regressie toegepast op de individuele hazard ratio (HR) te schatten. De significante variabelen in de univariate analyse (P < 0,05) werden vervolgens in de multivariate analyse gezet. De HR met 95% betrouwbaarheidsinterval (BI) werd gemeten om de gevaren risico van individuele factoren schatten. P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS statistische software programma versie 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).}

Resultaten

Uitdrukkingen van flotillin2 en erbB2 bij maagkanker

gekleurde coupes weefsel microarrays (TMA) van 282 weefselkernen werden beoordeeld op hun cytoplasmatische immunohistochemische kleuring intensiteit tegen flotillin2 en erbB2 eiwit. De 282 leesbare monsters die 282 maagkanker, 181 peri-carcinoom en 101 monsters van normale maag epitheel weefsel. Tumorcellen liet typische diffuse membraankleuring van flotillin2 u naar maagcarcinoom (figuur 1a) met soortgelijke locatie van erbB2 (figuur 1b), in niet-neoplastische maagslijmvlies, flotillin2 en erbB2 waren beide niet tot expressie. Positieve kleuring van flotillin2 bleek in 129 (45,7%) van 282 monsters, erbB2 was 59 (20,9%). Amplificatie van erbB2-gen werd bepaald door dual-color FISH van xenotransplantaten in naakt muizen. ErbB2 genamplificatie in een cluster patroon (rood) waargenomen bij MGC-803, BGC-823 en SGC-7901 cellen, erbB2 overexpressie alleen in menselijke SGC-7901 maagkanker cellen (Figuur 2a-c).

associatie tussen de uitingen van flotillin2 met erbB2

We analyseerden de cellulaire lokalisatie van erbB2 en flotillins in SGC-7901 maagkanker cel. We konden aantonen door confocale microscopie dat flotillin2 gedeeltelijk co-lokaliseren met erbB2 in het plasmamembraan (Figuur 1a-e). Onze gegevens tonen aan dat de expressie van flotillin2 maken heeft een significante correlatie met die van erbB2 (p < 0,001) in de immunohistochemische weefsel array analyse (Tabel 1). Bovendien kan interactie tussen flotillins en erbB2 worden aangetoond door immunoblot (figuur 2d) en kwaliteit RT-PCR experimenten (figuur 2e), neerhalen van endogene flotillin2 geleid neerhalen van erbB2. We vervolgens onderzocht het effect van flotillins de opname en daaropvolgende degradatie van erbB2. Zoals hieronder beschreven, erbB2 en HER2 hebben ook veel relaties van clinicopathologische factoren met elkaar gemeen.

Associatie tussen flotillin2 en klinisch-pathologische factoren

In deze studie, 282 maagkanker patiënten met voldoende primaire tumoren materialen en volgen -up tijd beschikbaar waren, waarvan de weefsels werden verzameld in de afgelopen 6 jaar. Tabel 2 gaf de beschrijvende statistieken van parameters gemeten voor deze patiënten. De mediane duur van de follow-up was 54 maanden (range 9-78 maanden). De 5-jaars totale overleving (OS) bedroeg 48,2%

We vonden dat de verhoogde expressie van flotillin2 en erbB2 was zowel significant geassocieerd met histologische type (p < 0,001, respectievelijk)., Lauren waardering (p < 0,001, respectievelijk) en Lymfovasculaire invasie (p = 0,059 en p < 0,001, Tabel 2). Bovendien werd flotillin2 significant gecorreleerd met tumorgrootte (p = 0,006), T-trap (p = 0,001) en lymfeknoop metastasen (p = 0,033, Tabel 2). Er werd echter geen significante correlatie gevonden tussen flotillin2 expressie en andere parameters zoals leeftijd, geslacht, locatie, macroscopische type en lever metastase.

Expressie van flotillin2 met betrekking tot prognose

Met behulp van Cox proportionele risico's regressie model, de univariate verbanden tussen tumor kenmerken en resultaten van patiënten werden verkregen (Tabel 3). Van de 282 patiënten geanalyseerd werden statistisch significante verschillen in OS gezien, met een slechte uitkomst voor patiënten met hogere kleuring van flotillin2 en erbB2. Andere voorspellende factoren bleken te correleren met OS waren leeftijd (P = 0,042), size (P = 0,001), macroscopische type (p = 0,001), pT (P < 0,001) en pN fase (P < 0,001) (Tabel 3). Met behulp van log-rank test, waren er significante verschillen in OS tussen positieve en negatieve patiënten van flotillin2 en erbB2 (P < 0,001, respectievelijk) bij alle patiënten werden weergegeven in figuur 3.

Cox multivariate proportioneel hazard-regressiemodel werd vervolgens gebruikt om te bepalen welke factoren tezamen voorspellend OS. Variabelen die werden geacht aanzienlijke in univariate analyse te zijn opgenomen in de analyse. De betekenis, gecorrigeerd voor andere co-variates, werd gegeven in Tabel 4. Multivariate analyse van het gezamenlijke effect van flotillin2 en erbB2 met andere prognostische factoren bleek dat PT (P < 0,001) en pN fase (P < 0,001) flotillin2 (HR = 1.485, 95% CI:. 1,278-1,725, P < 0,001) was een betere onafhankelijk prognostische marker dan erbB2 (HR = 1,375, 95% BI: 1,133-1,947 P = 0,004) voor OS (tabel 4)

Discussie

bij de beoordeling van de biologische prognostische factoren is van klinisch belang, in het bijzonder voor een ziekte met een slechte uitkomst, zoals maagkanker. Deze studie bevestigt de constitutieve expressie van flotillin2 bij maagkanker weefselspecimen en cellijnen, vonden we ook dat flotillin2 een onafhankelijke prognostische factor slechte overleving van maagkankerpatiënten. Bovendien toonde deze studie voor het eerst een positief verband tussen de uitingen van flotillin2 en HER2 bij maagkanker. In eerder onderzoek Pust et al. (2012) gevonden dat borstkanker cellijnen afgeleid van metastasen toonde een hoger flotillin mRNA en eiwitexpressies dan die afgeleid van primaire maagkanker. Aldus legde zij de rol van flotillin2 als weefsel- en stadiumspecifieke tumor modulator, waar het als een remmer of promotor van tumorvorming en progressie afhankelijk van de eiwit interactie partners zoals groeifactorreceptoren of celadhesiemoleculen [11] . Onze resultaten komen overeen met deze beschrijving omdat flotillin2 uitdrukking in het huidige onderzoek was positief gecorreleerd met HER2 expressie, die positief was gecorreleerd met een slechte prognose bij maagkanker.

De gegevens van twee recente publicaties geven aan dat flotillin heeft een functionele rol in receptor tyrosine kinase signalering, met name in de activatie van MAP kinase signalering en regulatie van FGF signalering in HeLa-cellen [16], [17]. In de SKBR3 borstkankercellen, zodat Akt fosforylering wordt verlaagd na uitputting van flotillin-2, maar niet na flotillin-1 knockdown, overeen met onze gegevens. Zo zou receptor tyrosine kinases of receptor tyrosine kinase-gemedieerde signalerende routes worden geregeld flotillins op verschillende manieren en /of in een celtype-specifieke wijze, is het mogelijk dat de verschillende signaalwegen geactiveerd door erbB2 worden gereguleerd door ofwel flotillin2. Toch is de erbB2 verlaagde niveaus veroorzaakt door flotillin2 knockdown ondersteunen onze hypothese van een flotillin2-gemedieerde stabilisatie van erbB2.

ErbB2 bekend is geassocieerd met een slechte prognose bij maagkanker zijn flotillins beschreven worden geassocieerd met tumor Genesis. We hebben aangetoond dat flotillin2 co-lokaliseert met erbB2 in het plasmamembraan en speelt een functionele rol in de regulering van de erbB2 bij maagkanker. Hoge expressie van flotillin2 wordt geassocieerd met een slechte prognose en gereduceerde overlevingstijd en blijkt als potentiële voorspeller van uitval bij maagkanker. Vermeld is dat oestrogeen receptoren betrokken bij maagkanker en flotillin2 interactie met de receptoren [18], [19], een belangrijk gevolg van flotillin2 functie gastrische ontwikkeling van kanker aangeeft. Anderzijds, gebaseerd op onze tissue microarray studies, flotillin2 overexpressie was sterk geassocieerd met verhoogde celmigratie en maligne transformatie leidt tot lymfeklieren en toegenomen invasiviteit. In onze studie verhoogde flotillin2 en HER2 zowel een significante correlatie met histologische type (P < 0,001 beide), Lauren waardering (P < 0,001 beide), terwijl flotillin2 een hoge relevantie T-stadium krijgt ook (P < 0,001) en lymfeklieren metastase (P = 0,033). Deze sterke correlatie suggereert dat flotillin2 kan worden gebruikt als een biomarker om subgroepen van patiënten met maagkanker identificeren met een agressiever fenotype. De multivariate analyse toonde flotillin2 dient als een betere prognostische marker om het risico op uitzaaiingen en recidief (HR = 1,485, 95% BI: 1,278-1,725) voorspellen dan Her2 (HR = 1,375, 95% BI: 1,133-1,947) voor OS. Wij stellen flotillin2 overexpressie kan bijdragen aan verhoogde proliferatie en ontwikkeling van maagkanker.

Kortom, dit is de eerste demonstratie van een positieve correlatie tussen flotillin2 en erbB2 niveaus in gekweekte cellen maagkanker en in weefsels. Bovendien flotillin2 expressie correleert met slechte prognose bij maagkanker, wat aangeeft dat flotillin2 voorspellende biomarker voor maagkanker kan zijn. Gebleken is dat erbB2 overexpressie tumoren vaker resistent tegen behandeling met een antilichaam gebaseerde (trastuzumab /Herceptin) therapie, waarbij de klinische eerstelijns behandeling geworden bij patiënten met te erbB2-overexpressie uitgezaaide maagkanker [20] , [21]. Maar zelfs in combinatie met andere chemotherapeutische geneesmiddelen, meer dan 20% van de patiënten met erbB2-overexpressie vertonen geen reactie op de behandeling. Aldus worden gemikt flotillin2 expressie huidige aanpak van de behandeling van kanker kunnen worden ontwikkeld.

• PLoS ONE: Multiple-to-Multiple Relaties tussen MicroRNA's en Target genen in Gastric Cancer
• PLoS ONE: Socio-demografische en geografische factoren in Sterfte slokdarmkanker en maagkanker in Zweden