PLOS ONE: Associação significativa de Interleukin4 Intron 3 VNTR Polimorfismo com a susceptibilidade ao câncer gástrico em uma população do sul da Índia de Telangana

Abstract

Fundo

O câncer gástrico (GC) é a quinta neoplasia mais comum e continua a ser um problema de saúde pública considerável em todo o mundo. As variações genéticas nos genes que codificam citocinas e seus receptores influenciar a intensidade da resposta inflamatória Helicobacter pylori
associados, o que pode contribuir para as diferenças individuais no resultado e gravidade da doença. Interleukin4 é um típico pleiotrópico ajudante T 2 (Th2) de citoquina e é um mediador fundamental de equilíbrio Th1 /Th2. Ele está envolvido na regulação da carcinogênese mediadas por inflamação de órgãos humanos, incluindo o cancro gástrico.

Objectivo

O presente estudo de caso-controle retrospectivo foi realizado para avaliar a associação de IL4 intron 3 polimorfismo VNTR com a susceptibilidade a GC em uma população indígena sul do estado de Telangana.

Materiais e Métodos

um total de 182 pacientes com GC diagnosticados e 326 controles saudáveis ​​selecionados aleatoriamente foram incluídos no presente estudo. O ADN genómico foi extraído de leucócitos periféricos e de genotipagem foi determinada por ensaio baseado em PCR. Associação entre genótipos e câncer gástrico foi examinado por análise de regressão logística não condicional.

Resultado

A variante 3R /2R e 2R /2R genótipos de IL4 exon3 polimorfismo VNTR tinha cerca de 1,9 vezes e 3fold aumentou GC risco, respectivamente, quando comparado com 3R /3R genótipo [3R /2R vs
. 3R /3R: odds ratio (AOR) = 1,90, 95% de intervalo de confiança (IC) = 1,23-2,95 P = 0,004 e 2R /2R vs
. 3R /3R: AOR (IC 95%) = 2,96 (1,29-6,82), P = 0,011]. Além disso, um aumento significativo do risco de CG foi encontrada para os portadores do alelo (2R 3R /2R + 2R /2R), em comparação com o genótipo 3R /3R (AOR (IC 95%) = 2,04 (1,35-3,10), P = < 0,000). A freqüência do alelo IL4 2R foi de 0,28 entre o grupo GC e 0,18 entre os controles, ea diferença foi estatisticamente significativa (P = < 0,000)

Conclusão

O presente estudo revelou uma associação. do alelo 2R e genótipos transportadora 2R na etiopatogenia da GC no sul da Índia população

Citation:. Bhayal AC, Krishnaveni D, Rao KPR, Kumar AR, Jyothy a, Nallari P, et al. (2015) Associação significativa de Interleukin4 Intron 3 VNTR Polimorfismo com a susceptibilidade ao câncer gástrico em uma população do sul da Índia de Telangana. PLoS ONE 10 (9): e0138442. doi: 10.1371 /journal.pone.0138442

editor: Gregory Lesinski, The Ohio State University, Estados Unidos

Recebido: 02 de março de 2015; Aceito: 31 de agosto de 2015; Publicação: 18 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Bhayal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de declínio da incidência e taxas de mortalidade observadas em todo o mundo, o câncer gástrico (CG) é o quinto câncer mais comum (952,000 casos, 6,8% do total) e ocupa o terceiro lugar como causa de mortalidade relacionada ao câncer (723.000 mortes, 8,8 % do total), [1]. Seu padrão e incidência taxas mostram uma variação considerável de acordo com idade, sexo, etnia, condições sócio-econômicas e localização geográfica em todo o mundo [2]. Mais de 70% dos casos ocorrem em países em desenvolvimento e metade do total mundial ocorre na Ásia Oriental. as taxas de incidência idade-padronizados são cerca de duas vezes maior em homens como em mulheres na maioria das populações estudadas [3]. taxa de incidência anual de câncer gástrico na Índia é de 10,6 por 100 000 habitantes. A taxa de incidência de câncer gástrico é quatro vezes maior no sul da Índia em comparação com o norte da Índia. O câncer gástrico é o terceiro câncer mais comum no sul da Índia [4].

Como a maioria dos outros tipos de câncer, GC tem uma etiologia multifatorial e de várias etapas que envolve interação complexa entre os Helicobacter pylori
infecção (HP) , fatores genéticos e ambientais endógenas exógenas [5]. Persistente Helicobacter pylori
infecção, levando a inflamação crónica, desempenha um papel importante na carcinogênese gástrica e é precedida por um processo de pré-cancerosa longa, desenvolvendo através de múltiplos passos sequenciais [6].

interleucinas (IL ) ajudar a mediar muitas das fases efetoras da resposta imunológica e inflamatória [7]. IL4 é um importante anti-inflamatória prototípico tipo de citocina Th2 e desempenha um papel chave na activação e diferenciação de células B e mastócitos, a produção de anticorpos e o desenvolvimento dos subconjuntos de linfócitos Th2 [8]. IL4 é segregada por uma variedade de células, tais como: células T, mastócitos, células apresentadoras de antigénios e células NK, etc. É um regulador potente para baixo da função de macrófagos, inibe a secreção de citoquinas pró-inflamatórias, tais como interferão-γ, IL1 , IL6, e α factor de necrose tumoral (TNFa) [9].

o gene de IL4 está localizado no braço longo do cromossoma 5 (q31.1), juntamente com outros genes de citocinas Th2 e está presente em um cluster de genes de citocinas (IL-3, -5, -9, -13 e -15, granulócitos fator estimulante de colônias, e factor regulador de interferão) [10]. gene IL4 tem 4 exons e é de aproximadamente 10 kb de tamanho. polimorfismos comuns em IL4 relatadas por vários estudos são: -590C T (rs2243250) na região promotora, -33C /T (rs2070874), -168G /C (rs2070874) em 5ꞌ região não traduzida e VNTR polimorfismo /in intron3. Um número variável de repetição tandem (VNTR) de 70 pares de bases de repetição está situado na terceira região intrônica do gene IL4. Três repeat (3R) alelo é mais comum e dois de repetição (2R) alelo é relativamente rara. Há um outro alelo mais raro de quatro repeat, que é relatado em apenas algumas populações [11]. Dois repeat (2R) alelo foi encontrado para ser um alto produtor de IL4 [12].

Tendo em vista a importância de IL4 em efeitos anti-inflamatórias locais e sistêmicas, o presente estudo tem como objetivo avaliar a associação de polimorfismo IL4 VNTR com GC em nossa população. Nós também examinou se o potencial associação desse polimorfismo com o risco de câncer gástrico é diferente no que diz respeito às características demográficas.

Materiais e Métodos

Estudo da População

Um total de 508 indivíduos foram matriculados no presente estudo, 182 pacientes com GC e 326 indivíduos de controle saudáveis. pacientes com câncer gástrico foram recrutados a partir do Departamento de Gastroenterologia, Osmania Hospital Geral, Hyderabad. pacientes com câncer gástrico, que foram diagnóstico confirmado através de endoscopia gastrointestinal (EDA) e exame histopatológico, durante o período de estudo entre novembro 2009 e outubro 2013, foram considerados para o presente estudo. controles pareados etnicidade saudáveis ​​foram seleccionados de forma aleatória a partir de uma região geográfica semelhante à dos pacientes. Os critérios de selecção para os controles incluídos sem história individual de câncer e os critérios de exclusão foram úlcera gástrica passado ou presente, doenças imunossupressoras e outras doenças sistêmicas importantes. Um questionário estruturado foi usado para extrair informações sobre os fatores epidemiológicos, como idade, sexo, hábitos alimentares, vícios, história familiar de câncer etc. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Genética e Hospital de Doenças Genéticas (Universidade Osmania, Hyderabad) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos recrutados. A investigação científica apresentada neste trabalho foi realizado em conformidade com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsínquia) para experimentos envolvendo seres humanos.

Amostra coleção

Cerca de 5 ml do sangue periférico de cada indivíduo foi coletado em VACUTAINERS EDTA revestido para extração de DNA posterior e H
. pylori
sorologia. Uma vez processado, amostras de sangue total e plasma foram divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C até à análise. O DNA genômico foi extraído de leucócitos do sangue periférico, utilizando o método de salga-out, como descrito anteriormente [13].

Detecção de Helicobacter pylori
Infecção

H
. Status pylori
foi avaliada através da análise sorológica. O antiH. pylori IgG título de anticorpo foi determinada por ELISA de acordo com o protocolo do fabricante (IBL International, GMBH, Alemanha).

A genotipagem do polimorfismo VNTR IL4

IL-4 número variável de repetições em tandem (VNTR) foi amplificado através de ensaio baseado em PCR, utilizando iniciadores para a frente, 5'-TAGGCTGAAAGGGGGAAAGC-3ꞌ e iniciador inverso, 5'-CTGTTCACCTCAACTGCTCC-3 '[14]. A PCR foi realizada num volume de 10 ul contendo 2 ul (20-40 ng) de ADN genómico, 1x tampão de reacção, 0,125 mM de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), MgCl 1,5 mM _{2, 0,60 uM de cada iniciador e 0,3 unidades de Taq DNA polimerase (Bangalore Genei). O protocolo de PCR foi: desnaturação inicial a 95 ° C durante 7 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 45 segundos, 56 ° C durante 45 segundos, e 72 ° C durante 45 segundos e uma extensão final a 72 ° C durante 7 minutos. Os produtos de PCR foram resolvidos por electroforese em gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio. O tamanho dos produtos amplificados foi directamente diagnóstico do número de repetições da sequência interveniente. Alelos foram nomeados da seguinte forma: alelo 3R = três repetições (253 pb), e alelo 2R = duas repetições (183 pb). Os alelos foram nomeados como 3R e 2R para minimizar a confusão como outros trabalhos têm chamado os mesmos alelos como 1 e 2 ou B1 e B2 ou RP1 e RP2. Para controle de qualidade, 10% das amostras selecionadas aleatoriamente contendo ambos os casos e controles foram analisadas pela segunda vez sem encontrar quaisquer discrepâncias.}

A análise estatística

Para analisar as características demográficas, foi utilizado o Mann Whitney U test e regressão logística univariada para dados contínuas e categóricas, respectivamente. A idade foi categorizada em três grupos (i.e.≤45 anos, 46-60 anos e > 60yrs). Para os fumantes, foi calculado o número de maços-anos fumados para indicar a dose cumulativa de fumar [maços-anos = (cigarros por dia /20) * (anos fumado)]. Moderado e crónicas fumantes foram classificados, utilizando o valor pack-ano médio (25 anos de bloco) como os pontos de corte. As informações coletadas sobre a freqüência do uso de álcool por semana e a duração total (em anos) de consumo de álcool foi usado para derivar frequência anos beber [(tempos de beber-per semana) * (anos beber)]. Alcoólicos foram divididos em grupos moderados e crônicas usando os anos-frequência mediana como os pontos de corte. Os desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) foram testados usando o x ^{test 2 goodness-of-fit. modelo de regressão logística múltipla incondicional foi utilizada para calcular as odds ratio ajustada (RUP) e correspondentes intervalos de confiança de 95% (IC) após o controle para idade, sexo, tabagismo, mastigar tabaco e consumo de álcool. Análise para os genótipos foi feito sob os modelos de co-dominante, recessivo, dominante e log-aditivo de herança. O critério de informação de Akaike (AIC) foi utilizado para determinar o modelo de melhor ajuste. Todos os testes estatísticos foram dois lados, e foram considerados significativos pelo valor P ≤0.05. A análise estatística foi realizada por R versão 3.1.2 [15] e um pacote de R "SNPassoc" [16].}

Resultados

Características dos pacientes e controles

características epidemiológicas dos pacientes e controles são apresentados na Tabela 1. A média de idade dos pacientes do GC e que os controles, de 52,66 ± 12,15 (intervalo = 23-83; mediana = 55) e 50,15 ± 12,77 (intervalo = 23-80; mediana = 52) anos, respectivamente, com diferença significativa entre os dois grupos (p-valor = 0,026). Havia cerca de 1,65 e 1,67 vezes maior risco de GC para os grupos etários médio e superior, respectivamente, em comparação com a faixa etária mais baixa. preponderância do sexo masculino foi encontrado com cerca de 1,8 vezes maior risco de GC nos machos. Os fumantes nos controles e grupos GC foram 36,5% e 59,3%, respectivamente, e houve 2,5 vezes maior risco para os fumantes em comparação com não fumantes (OR = 2,54 P Art < 0,000). Quando divididos em fumantes moderados e crónicas havia 2 e 3.7- vezes maior risco de GC, respectivamente, com referência aos não-fumantes. chewers tabaco estavam em cerca de 4 risco vezes maior do GC quando comparado com nonchewers. Da mesma forma com relação ao consumo de álcool, encontramos diferença significativa com o grupo geral alcoólica (~ 2.2fold), bem como com moderada (1,9 vezes) e grupos alcoólica crónica (2,9 vezes) quando comparado com o grupo não-alcoólica.

Análise polimorfismo de IL4 VNTR

o genotípica e frequências alélicas da IL-4 intrão 3 VNTR polimorfismo em pacientes com CG e controles são apresentados na Tabela 2. a análise de genótipos não revelaram qualquer desvio significativo da HWE nos pacientes e controle Grupos (valores p: 0,320 em casos, em controlos de 0,141, 0,489 e em ambos). A frequência de 3R /3R, 3R /2R, e 2R /2R genótipo foi contra 53,30 69,02%, 36,36% contra 26,69 e 9,18 contra 4,29%, no grupo de pacientes GC, em comparação com o grupo de controlo, respectivamente. Para determinar a associação entre o polimorfismo genético e GC, foi aplicada a análise de regressão logística múltipla. A análise de regressão logística multivariada revelou que indivíduos com 3R /2R e 2R /2R genótipos polimórficos teve um risco significativamente maior de 1,9 vezes (IC 95% = 1,23-2,95; p-valor = 0,004) e 2,96 vezes (IC 95% = 1.29- 6,81;. p-valor = 0,011) risco de ter GC, quando comparado com o 3R /3R i
e
.
grande genótipo. Da mesma forma, houve aumento significativo na frequência de alelos 2R [OR (IC 95%) = 1,82 (1,34-2,47); p-value = 0,00015] no grupo de pacientes GC em comparação com o grupo controle. Quando combinado 3R /2R 2R e /2R genótipos, assumindo um efeito alelo dominante, a (3R /2R + 2R /2R) genótipos variantes combinadas foram associados com 2,04 vezes (IC 95% = 1,35-3,10; p = < 0,000) aumento do risco de GC para portadores do alelo 2R. Com base nos valores de critério de informação de Akaike (AIC), o modelo dominante, com menos valor de AIC foi encontrado para ser melhor genotípica modelo indicando cerca de 2 vezes maior risco de portadores do alelo 2R.

Associação de genótipos com características epidemiológicas

foi examinado se as associações deste polimorfismo com o risco de câncer gástrico foram modificadas pela interação com outros fatores de risco, incluindo idade, sexo, tabagismo, mastigar tabaco e consumo de álcool. Para maximizar a potência na análise classificação cruzada /interacção, indivíduos com heterozigoto (3R /2R) e homozigóticos (2R /2R) genótipos variantes foram combinadas e RUP foram expressos com referência ao genótipo não variante (3R /3R) e o primeiro categoria dos co-variáveis. análise classificação cruzada de IL4 VNTR polimorfismo com variáveis ​​demográficas são apresentadas na Tabela 3. Análise de Cross-classificação de IL4 VNTR polimorfismo com faixas etárias apresentou marginalmente maior risco de GC para assuntos transportadora 2R que estavam de meia-idade e mais velhos (4,08 vs 3,38 vezes vezes) quando comparado com o grupo de idade inferior /assuntos principais portadoras de genótipos. análise classificação cruzada com o sexo mostrou marginalmente maior risco de GC no 2R portadoras do alelo indivíduos do sexo feminino do que do sexo masculino (2,87 vezes contra 2,52 vezes). Da mesma forma não foi mais o aumento do risco de 2R portadoras do alelo fumantes crônicos do que fumantes moderados e não fumantes em comparação com os principais fumantes portadoras de genótipos. Crónicas alcoólicas assuntos transportadora 2R estavam em risco mais pronunciada do que alcoólicos moderados (3,54 vezes vs. 2,53 vezes) comparado com os principais assuntos não alcoólicas portadoras de genótipos. No entanto, todos os valores p-interação foram estatisticamente insignificante indicando falta de interação.

A associação entre o polimorfismo e câncer gástrico estratificada em características demográficas como idade, sexo, mascar tabaco, tabagismo e uso de álcool são apresentados na Tabela 4. análise de estratificação das características demográficas em relação a genótipos revelou que o risco de GC foi mais pronunciada em indivíduos que realizaram 3R /2R ou 2R /2R genótipos e eram de meia-idade (OR = 2,99 (1,53-5,86)), do sexo feminino (OR = 2,87 (1,41-5,87)), chewers tabaco (OR = 2,30 (1,24-4,28)) e alcoólatras (OR = 2,89 (1,50-5,55)).

Discussão

no presente estudo, foi investigada a associação entre polimorfismo do gene IL4 VNTR e risco de câncer gástrico em uma população do sul da Índia. O resultado mais importante do nosso estudo foi a associação significativa do alelo 2R e genótipos transportadora 2R (ou seja, 3R /2R ou 2R /2R) com aumento do risco de GC, indicando a possível associação do polimorfismo VNTR IL4 com GC. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo de associação que tentou avaliar a associação de IL-4 gene VNTR polimorfismo no GC em uma população do sul da Índia.

GC é um exemplo clássico de inflamação induzida malignidade. IL4 é uma importante citocina anti inflamatório que inibe a H
.
pylori da mucosa gástrica induzida por inflamação e atrofia, diminuindo γ interferão (IFN-y) e outras citocinas de tipo Th1 [17]. IL4 induz células efectoras imaturas a assumir um fenótipo de Th2 e também reprime a sinais de indução de Th1. Um equilíbrio entre Th1 e citocinas Th2 por IL-4, portanto, crucialmente influencia o resultado da H
. pylori
. resposta de células T de Th2, representado por IL4, desempenha um papel protector no desenvolvimento de cancro gástrico. Além disso IL-4
ratos -deficient infectado com H
. pylori
show de inflamação gástrica grave, em comparação com camundongos selvagens [18]. Em linhas celulares de cancro, variações na actividade de IL4 e o seu receptor foram mostrados para modular a proliferação de células e de afectar vias de transdução de sinal [19]. IL-4 é supostamente associada com o desenvolvimento do cancro através
sua supressão de inflamação e angiogénese e inibe directamente o crescimento de melanoma humano, carcinoma de células renais e as células de cancro gástrico [20]. IL4 foi ainda descrita para causar uma redução dependente da dose da proliferação de [21] e para inibir metaloproteinases da matriz (MMP-1, -2 e -9), invasão da matriz celular e migração das células [22]. IL-4 pode também inibir a resposta imunitária mediada por células por regulação negativa da expressão de citocinas Th1, tais como γ IFN- e IL-2, e pela diminuição da quantidade e da qualidade da resposta de células T CD8 + no tumor microenvironment.2R alelo foi mostrado para aumentar a produção ou a actividade de IL-4 pelas células T [12]. Assim, é possível que a maior produção de IL4 pode resultar na fuga de células tumorais de vigilância imunológica devido à célula diminuída mediada resposta imune.

Vários estudos epidemiológicos examinaram a associação entre o polimorfismo VNTR IL4 e o risco de câncer , incluindo próstata, urotelial, mama, colo-rectal, e cancros gástricos, mas os resultados são inconsistentes. Em um estudo realizado por Yang et al (2014) IL-4 intron 3 polimorfismo VNTR foi encontrado para ser associado (2R /2R vs. 3R /3R + 3R /2R, AOR = 1,46, 95% CI: 1,05-2,04), com início encenar risco de carcinoma de boca e faringe (OPSCC), que também interagiu com o consumo de álcool (p = 0,024) [23]. genótipos transportadora 2R (.. i e 3R /2R e 2R /2R) foram relatados para ser associado com câncer de bexiga fase tardia em uma população do norte da Índia [24] (Ahirwar et al; 2008). Em um estudo caso-controle, envolvendo 138 pacientes com carcinoma de células transicionais (TCC) da bexiga urinária e 105 controles saudáveis ​​de população de Taiwan, 2R /2R (RP1 /RP1) foi encontrado para ser significativamente associada (OR = 8,88 (1,02-77,16); P
= 0,018) com câncer de bexiga e capacidade de invasão do tumor [25]. Shekari et al (2012) não encontraram um risco significativo de desenvolver cancro do colo do útero com genótipos em mulheres indígenas do norte [26] 2R /3R (RP1 /RP2). Não houve associação do polimorfismo IL4VNTR com o risco de câncer de próstata em uma população do norte indiano, mas dois risco vezes com progressão para metástase óssea no câncer de próstata foi relatada [27]. Nenhuma associação desse polimorfismo foi encontrado com o risco de cancro da mama em uma população indígena do norte [28]. Não foram observadas diferenças significativas nas distribuições de genótipos ou freqüências alélicas do polimorfismo intron3 gene IL-4, entre os pacientes com câncer bucal e controles em um estudo da população de Taiwan [29]. Da mesma forma, em um estudo de caso-controle, envolvendo 123 pacientes do GC e 103 controles, Lai et al (2005) não encontraram nenhuma associação desse polimorfismo com o risco de GC na população de Taiwan [30]. Em contraste, o presente estudo revelou uma associação entre câncer gástrico e polimorfismo IL4 VNTR. Para o melhor de nosso conhecimento do presente estudo é o primeiro relatório sobre a associação positiva de interleucina-4 intron 3 polimorfismo VNTR com o aumento do risco de GC.

fatores relacionados estilo epidemiológica /vida de um sujeito pode também desempenhar um papel importante na etiologia de GC e estes factores podem actuar em sinergia com o polimorfismo genético de IL4. Como esperado, vícios, tais como mascar tabaco, tabagismo e uso de álcool, foram correlacionados com significativamente maior susceptibilidade a GC. Além disso, os genótipos transportadora variante 2R foram encontrados para exibir risco mais acentuado em relação ao sexo feminino, médio (45-60 anos), faixa etária, tabagismo crônico, mastigar tabaco e alcoolismo crônico indicando modulação do risco por estes factores epidemiológicos. No entanto, os números dentro de cada sub-grupo foram muito baixos e estudos maiores são necessários para expor interação significativa.

Nosso estudo tem algumas limitações que precisam ser considerados na interpretação de nossos resultados. Os controles de base comunitária não foram pareados por idade e sexo. Embora MLR foi aplicado, o efeito de confusão residual não pode ser completamente descartada. Nosso tamanho da amostra foi relativamente pequeno, o que pode influenciar o poder estatístico do estudo, especialmente para a interação e análise estratificada. Nós não temos informações detalhadas clínico-patológico de todos os pacientes que não nos permitem analisar nossos dados no contexto de subtipos histológicos, graus e fases do cancro gástrico. Além disso, tendo em conta o grande repertório de SNPs em genes de citoquinas pró-inflamatórias e anti com interacções complexas de uma doença multifactorial complexa, como o cancro gástrico, os resultados deste estudo podem ser insuficientes para clarificar as interplays complexos entre um número de diferentes genes no GC, mas pode representar uma hipótese gerando dados para futuras investigações.

conclusão

em conclusão os nossos resultados sugerem que os genótipos variantes e alelos de IL 4 polimorfismo VNTR podem aumentar significativamente a susceptibilidade à GC e implica o alelo 2R como um dos potenciais marcadores genéticos na etiologia da doença na nossa população. No entanto, um grande estudo confirmatório envolvendo outras populações é justificada para compreender a população de especificidade e a contribuição relativa desse polimorfismo na etiologia do câncer gástrico.

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