PLOS ONE: intratumoral hipóxia promove a tolerância imune pela indução de células T reguladoras via TGF-β1 em Câncer Gástrico

Abstract

células T reguladoras (Treg) mediada por imunossupressão representa um dos mecanismos de evasão imune tumorais crucial e é um obstáculo principal para a imunoterapia tumor bem sucedido. A hipoxia, uma característica comum de tumores sólidos, tem sido associada com imunossupressão potenciada, diminuição da resposta terapêutica, a progressão maligna e invasão local. Infelizmente, a ligação entre hipóxia e Treg mediada tolerância imunológica em câncer gástrico permanece mal compreendido. No nosso estudo, as Tregs e hipoxia-inducible factor 1α foram encontrados estar positivamente correlacionado com o outro e foram aumentados com a progressão do tumor. A in vitro
estudo subsequente indicou que sobrenadantes derivados de células cancerosas gástricas sob condição hipóxica, poderia induzir a expressão de Foxp3 via TGF-β1. Estes resultados confirmam o papel crucial das Tregs como um alvo terapêutico em terapia de câncer gástrico e desde pensamentos votos para o desenho de imunoterapia para o câncer gástrico no futuro

Citation:. Deng B, Zhu JM, Wang Y, Liu TT, Ding YB, Xiao WM, et al. (2013) intratumoral hipóxia promove a tolerância imune pela indução de células T reguladoras via TGF-β1 no câncer gástrico. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10.1371 /journal.pone.0063777

editor: Nupur Gangopadhyay, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Janeiro, 2013; Aceito: 06 de abril de 2013; Publicado em: 27 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Ciência e Tecnologia da Comissão de Xangai (10410709400, 10411950100), National Nature Science Foundation da China (81000968, 81101540, 81101637 e 81172273) e do National Clinical Key Assunto especial da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico representa uma das causas mais comuns de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços significativos em abordagens diagnósticas e terapêuticas durante as últimas décadas, o prognóstico de câncer gástrico permanece sombrio por causa de sua alta recorrência e metástase [2]. Imunócitos têm sido desde há muito reconhecido como um factor de promoção do crescimento do tumor no microambiente tumoral [3], no entanto, a base molecular subjacente permanece em grande parte enigmática. Uma melhor compreensão dos mecanismos de cancro gástrico será benéfico para desenvolver regimes terapêuticos eficazes.

intratumoral hipoxia é uma característica comum de tumores sólidos, que possam influenciar a progressão de tumores, activando vias bioquímicas e celulares chave [4 ], [5], [6]. Os estudos também demonstraram que a hipóxia desempenha um papel crucial na supressão imunitária mediada por tumor, contribuindo para manter o escape imunológica de tumores [7], [8]. Recentemente, confirmou uma ligação entre a hipóxia do tumor e da tolerância imunológica através do recrutamento de células T reguladoras (Treg) foi estabelecida em cancro do ovário [9]. Assim, uma hipótese foi apresentado que a hipóxia pode fornecer obstáculos para intervenções imunes terapêuticas.

Aumento Tregs têm sido relatados na circulação e tumorais tecidos de pacientes com vários tipos de câncer, incluindo câncer gástrico, câncer colorretal, carcinoma hepatocelular e câncer pancreático [10]. Acumulando dados também indicam que a presença de Tregs resultou em um aumento do risco para a progressão do cancro [11], [12], [13]. Além disso, a imunossupressão mediada por Treg é considerado para ser um dos mecanismos de evasão imune cruciais no tumor pelo qual eles são capazes de superar a actividade anti-tumoral de células citotóxicas CD8, células dendríticas e células assassinas naturais [14]. Assim, esclarecimento do mecanismo subjacente de enriquecimento Treg no câncer gástrico será de valor para a segmentação Tregs para um resultado clínico benéfico. Embora os mecanismos não são bem compreendidos, alguns estudos têm indicado que a TGF-β1 está envolvido nela [15].

Neste estudo, a hipótese de que o câncer gástrico pode adquirir uma vantagem seletiva por indução de Tregs sob hipóxia através de via de sinalização TGF-β1 fugindo, assim, a vigilância imunológica. Para demonstrar a nossa hipótese, foi analisada a expressão de hipoxia inducible factor-1α (HIF-1α) e Foxp3 em tecidos de cancro gástrico, avaliou o efeito da hipóxia sobre a produção de TGF-β1 em linhas celulares de cancro, e, finalmente, elucidou o papel de mediador hipoxia enriquecimento Treg no câncer gástrico.

Materiais e Métodos

pacientes e espécimes

parafina-embedded, secções de tumor fixados em formol foram obtidos de 99 pacientes com câncer gástrico submetidos a cirurgia ressecção de dezembro de 2006 a fevereiro de 2008, na segunda Escola de Medicina Clínica da Universidade de Yangzhou. dados de acompanhamento foram resumidas a partir de outubro de 2012, com um período de acompanhamento médio de 53 meses (intervalo de 4-70 meses). A sobrevida global (OS) foi definida a partir do momento da cirurgia para durar acompanhamento ou hora da morte.

Amostras de sangue periférico foram coletados de 20 pacientes com câncer gástrico um dia antes e 10 dias após a cirurgia a partir de julho de 2012 a outubro de 2012. Os soros foram congeladas a -80 ° C imediatamente após a centrifugação para uso futuro. células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas de imediato por um gradiente de Ficoll densidade.

Nenhum dos pacientes tinha recebido imunossupressores ou quimioterapia antes da ressecção cirúrgica. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética (Comitê de Ética da Segunda Escola de Medicina Clínica da Universidade de Yangzhou, Yangzhou), e consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os participantes do estudo.

imuno-histoquímico de coloração

As secções em série (5 uM), de espécimes embebidos em parafina e fixados em formalina foram feitas. Os cortes foram desparafinados e re-hidratadas em álcool graduado. A recuperação de antígenos foi realizada por tratamento das lâminas em tampão de EDTA num microondas durante 10 minutos. Foram utilizados anticorpo de coelho anti-humano de HIF-1α primário (Bioworld, EUA), anticorpo de TGF-β1 de murganho anti-humano (Santa Cruz, EUA) e anticorpo de rato anti-humano Foxp3 (Abcam, EUA) para os anticorpos primários. Diaminobenzidina (DAB) foi utilizado para substrato seguinte contracoloração com hematoxilina para a coloração única. coloração dupla foi realizada com 2 cromógenos diferentes:. DAB cromogénio (cor marrom) para HIF-1α e cromogénio fast-vermelho (cor vermelha) para o TGF-β1 ou Foxp3

Imunoreatividade Scoring

HIF -1α coloração núcleo foi avaliada seguindo o método relatado [16], pontuação = intensidade de coloração de imuno-reactividade (IR) × proporção de células coradas positivamente. intensidade IR foi estratificada em quatro categorias: 0, nenhum IR; 1, IR fraco; 2, IR moderadamente forte; e 3, IR forte. A proporção de células positivas foi classificado em cinco grupos: 0, nenhuma coloração; 1, < 2% de coloração; 2, 2-10% de coloração; 3, 11-29% de coloração; e 4, >. 30% da coloração

Um sistema de pontuação modificado foi utilizado para Foxp3 ^{+ células [17]. Foram contados dez campos de alta potência para Foxp3. O número absoluto de linfócitos por campo de alta potência (HPF 400) foi determinada. Calculou-se o número médio de células coradas positivas por campos de alta potência.}

Cultura celular e hipóxia Indução

linhas celulares de cancro gástrico humano, AGS e BGC823, foram obtidos do Instituto Xangai de celular Biologia, Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas as células foram propagadas em 5% de CO _{2 a 37 ° C em DMEM ou RPMI 1640 (Hyclone Tianjin, China) suplementado com 10% de FBS (Gibco, Austrália), 100 U /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina ( HyClone Tianjin, China). Para as experiências de hipoxia, as células foram semeadas em placas de 6 poços, lavou-se duas vezes com PBS, quando cresceram a 60-80% de confluência, mantidas em meio AIMV isento de soro (Invitrogen, EUA) durante uma incubação de um dia para o outro, e, em seguida, colocado num modular câmara incubadora (Ruskinn Works, YK) durante 24 h sob hipóxica (1,0% S 2) ou condições de normóxia (21% O 2), ambos com 5% de CO 2 a 37 ° C. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80 ° C para determinação mais tarde da concentração de TGF-β1 e para o ensaio de co-cultura. Todos os in vitro
experimentos de validação foram realizados, pelo menos, triplicado.}

Imunofluorescência

As células (1 × 10 ^{5 /poço) foram semeadas em lamelas em um placa de 24 poços para uma cultura de 24 h. Subsequentemente, elas foram fixadas em metanol frio durante 30 min para ser permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 durante mais 30 min. As células foram lavadas três vezes, bloqueada pelo soro de cabra a 10% em PBS durante 30 min, e incubadas com anticorpo de TGF-β1 anti-humano (Santa Cruz, EUA) e anticorpo de HIF-1α anti-humano (Epitomics, EUA) num congelador a 4 ° C durante a noite. O anticorpo primário foi detectado por meio de Alexa488 conjugado segundo anticorpo (Invitrogen, EUA) e Alexa Fluor 594 conjugado com anticorpo secundário (Invitrogen, EUA), respectivamente. As lamelas foram examinadas sob microscopia de fluorescência OLYMPUS.}

RNA Extração e quantitativa PCR em tempo real (qPCR)

Cada uma das duas linhas de células descritas acima foi cultivada em poços em triplicado sob normóxica ou condições de hipóxia , como descrito acima. O ARN total foi imediatamente isolado a partir de células normóxicas ou hipóxicas no final da experiência, utilizando Trizol reagente (Invitrogen, EUA). O RNA total (5 ng) foi transcrito de forma inversa utilizando kits de cDNA de transcrição reversa (Takara, Dalian, China), de acordo com as instruções do fabricante. qPCR foi realizado em um Mix SYBR Green PCR Mestre (Takara, Dalian, China). Fold alterações na expressão de cada ARNm de TGF-β1 em relação ao GAPDH foram calculadas com base no ciclo limiar (Ct) de 2 ^{-Δ (ΔCt), onde ΔCt = Ct _{alvo - Ct GAPDH e Δ (ΔCt) = ΔCt hipóxia - ΔCt normóxia. Os iniciadores de TGF-p 1 foram: para a frente, 5'-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 '; reverso, 5'- AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC-3 ', e os primers GAPDH foram: para a frente, 5'- GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3'; reverso, 5'-GGTGT CGCTG TT gaagt CAGAG-3 '. qPCR foi realizado em triplicado.}}

enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

A concentração de TGF-β1 nos sobrenadantes da cultura e os soros foi determinado utilizando um kit de ELISA (eBioscience, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Isolamento e Cultura de células T

PBMC de dadores foram indirectamente marcado com biotina-anticorpo bocktail e microesferas anti-biotina. CD4 ^{+ células T foram separadas por selecção negativa de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Alemanha). CD4 + células T foram marcadas directamente com CD25 Micro-esferas e CD4 + CD25 - células T foram isoladas por selecção negativa de acordo com as instruções do fabricante (pureza > 95%; Miltenyi Biotec, Alemanha) . Os sobrenadantes recolhidos a partir de células AGS cultivadas sob normóxica ou condições de hipóxia foram diluídas com meio fresco AIMV (1:03), chamado de meio normóxica e médio hipóxica, respectivamente. Um total de 1,0 × 10 6 /ml de CD4 + CD25 - células T foram estimuladas com anti-CD3 /CD28 grânulos revestidos por (01:05; Invitrogen, EUA), ± IL-2 (200 U /mL; Peprotech) durante 72 h em meio (meio de controlo isento de soro AIM-V), forma normóxica ou meio hipóxico. Em algumas experiências, o TGF-β1 recombinante humana (2 ng /mL; R & D Systems, EUA) e TGF-β1 inibidor do receptor cinase de LY-364947. (5}

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