PLOS ONE: Oncogênicos CagA Promove câncer gástrico Risco via Ativadoras ERK vias de sinalização: um estudo caso-controle aninhado Study

Abstract

Fundo

CagA interação celular através da ativação da via de sinalização ERK pode ser um ponto de partida no desenvolvimento do cancro gástrico. Este estudo teve como objetivo avaliar se os genes envolvidos em vias de sinalização a jusante ERK ativados por CagA são marcadores genéticos sensíveis para o câncer gástrico.

Métodos

Na fase de descoberta, um total de 580 SNPs dentro de + /-5 kbp de 30 genes candidatos foram genotipados para examinar uma associação com o risco de câncer gástrico em coreano multi-centro da cancer Cohort (100 incidentes conjuntos de caso-controle de câncer gástrico). Os SNPs mais significativos (crus ou permutados p
valor < 0,02) identificado na análise descoberta foram reavaliados na fase de extensão usando o modelo de regressão logística não condicional (400 conjuntos de caso-controle de câncer gástrico). Combinado análises incluindo pooled- e meta-análise foram conduzidos para resumir todos os resultados.

Resultados

24 SNPs em oito genes (ERK, Dock180, C3G, RAP1, Src, CrkL, Mek e CRK) foram significativamente associados com o risco de câncer gástrico no SNP análises individuais em fase de instrução ( p Art < 0,05). Na extensão análises, rs5999749 ERK, rs4635002 Dock180 e rs7853122 C3G mostraram efeitos marginalmente significativos de doses gene para o câncer gástrico. Consistentemente, análise combinada apresentou o SNPs como significativamente associada com o risco de câncer gástrico (OR = 1,56, [IC 95%: 1,19-2,06], OR = 0,61, [IC 95%: 0,43-0,87], OR = 0,59, [95 CI%: 0,54-0,76], respectivamente)

conclusões

Nossas descobertas sugerem que rs5999749 ERK, rs4635002 Dock180 e rs7853122 C3G são determinantes genéticos na carcinogênese gástrica

Citation.. : Yang JJ, Cho LY, Ma SH, Ko KP, Shin A, Choi BY, et al. (2011) Oncogênicos CagA Promove câncer gástrico Risco via Ativadoras ERK vias de sinalização: Um Estudo de Caso Nested-Control. PLoS ONE 6 (6): e21155. doi: 10.1371 /journal.pone.0021155

editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 22 de julho de 2010; Aceito: 21 de maio de 2011; Publicado: 16 Junho 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa do Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia [KRF-2007-313-E00175] e [NRF-2009-0066258]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori ( H. pylori
) é uma causa comprovada de carcinogênese gástrica [1]. No entanto, o seu efeito absoluta pode ser modificado por factores de risco de susceptibilidade individuais, tais como variantes genéticas e H. pylori
características virulentos [2], [3]. antigénio associado a citotoxina (CagA), um H. pylori
imunoprote�a, é um factor crucial para a susceptibilidade individual e está associado com resultados clínicos graves, incluindo câncer gástrico [4], [5], [6]. Nas células epiteliais gástricas, CagA interfere com diversas vias de transdução de sinal, tal como a sinalização [3 Dock180-Rac1-WAVE-Arp2 /3, C3G-Rap1-BRaf-MEK, SOS1-HRAS-RAF1, e-Raf-MEK-ERK de Ras ], [7], [8], [9]. Sinais modificados por CagA induzir alterações celulares, como apoptose, proliferação e mortalidade celular e estimular a carcinogênese gástrica [10], [11], [12].

Entre os vários percursos a jusante activados por CagA, o sinal extracelular -regulated cascata de quinase (ERK) é uma via de núcleo, uma vez que desempenha um papel importante na carcinogénese gástrica. CagA interações celulares com Src, SHP2, Crk, CrkL ou GRB2 estão significativamente associados com a ativação de ERK, e outras diversas proteínas envolvidas na sinalização CagA estão intimamente ligados a ERK vias de sinalização [10], [11], [12], [13] . As proteínas podem ser regulados pelos genes do hospedeiro; portanto, os genes que codificam proteínas relacionadas ao processo de sinalização CagA e ERK pode ser importante para carcinogênese gástrica, mas poucos estudos têm-se centrado sobre esses polimorfismos genéticos.

CagA oncogenicity pode ser um ponto de partida para o desenvolvimento de câncer gástrico através da activação de a via de sinalização de ERK. Estas transduções de sinal parecem ser modificado por variantes genéticos do hospedeiro. Assim, a hipótese de que genes envolvidos nas vias de sinalização a jusante ERK ativados por CagA podem ser marcadores genéticos sensíveis para o câncer gástrico. Para avaliar esta hipótese, realizamos um estudo de associação genética multi-estágio que incluiu 1) fase de descoberta: a análise do gene candidato que incidiu sobre 30 genes, Crk, CrkL, CSK, Grb2, c-Met, NFATC4, PTPN11, SMS, SOS1 , Src, ERK, FAK, PLCy, KRAS, ARN, BRAF, RAF1, MAP2K1, MAP2K3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K6, p21, Dock180, RAC1, RAP1, WAVE, Arp2, Arp3 e C3G, envolvido no sinal CagA e ERK via de transdução, e 2) fase de extensão que examinou os SNPs mais significativos identificados na análise de descoberta.

Métodos

população do estudo

fase Discovery.

a análise do gene descoberta candidato foi um estudo de caso-controle de base populacional dentro do coreano multi-Cancer Center Cohort (KMCC). De 1993 a 2004, o KMCC recrutados um total de 19,688 participantes de quatro áreas urbanas e rurais na Coréia. Todos os participantes completaram questionários padronizados detalhadas por entrevista pessoal, após consentimento informado. Amostras de sangue e urina foram coletadas. Através de ligações registro para o atestado de óbito nacional, os seguros de saúde médicos bancos de dados de registros e o registro nacional de câncer, todos os participantes foram passivamente seguiu-up, e novos casos diagnosticados foram apurados. Informações detalhadas sobre o KMCC é descrito em outro lugar [14]. Em dezembro de 2005, 249 casos de câncer gástrico definido de acordo com a Classificação Estatística Internacional de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde 10ª Revisão (CID-10, C16) foram identificados. Casos diagnosticados antes do recrutamento (n = 52), sem as amostras de sangue (n = 35), ou nível insuficiente de ADN abaixo de 50 ng /mL (n = 62) foram excluídos. controles sem câncer foram pareados por idade (± 5 anos), sexo, zona residencial, e no ano de inscrição. Finalmente, foram definidas 100 conjuntos de casos de câncer gástrico e controles pareados. Fase

Extensão.

1) Em dezembro de 2008, 95 novos casos de câncer gástrico foram adicionalmente apuradas pela KMCC. Estes casos e 116 casos que foram excluídos da coorte descoberta devido ao status de prevalência ou concentração de DNA inadequada foram incluídos na fase de extensão (n = 211). Usando o mesmo método de correlação como a fase de descoberta, foram seleccionados 211 controlos. 2) casos de câncer gástrico foram obtidos de dois hospitais universitários na Coreia que estavam Hospital Universitário Chungnam e Hanyang University Hospital GURI. De março de 2002 a setembro de 2006, um total de 490 pacientes com câncer gástrico foram recentemente diagnosticados nos hospitais. Seus dados epidemiológicos e amostras de sangue venoso foram coletadas no momento do diagnóstico ou antes da cirurgia de câncer gástrico. Entre eles, 189 casos com amostras de DNA suficientes e consentimentos informados, também foram incluídos no conjunto de extensão. Além disso, 189 controles baseados na comunidade foram pareados por idade (± 5 anos) e sexo dos sujeitos KMCC matriculados depois de 2000.

Ética Declaração

Os protocolos de estudo para o estudo KMCC, o hospital estudo baseado eo estudo caso-controle atual foram aprovados pelos conselhos de revisão institucional (IRB), do Hospital da Universidade Nacional de Seul e do Centro Nacional de Câncer da Coreia (H-0110-084-002 e C-0603-161-170) e pelo conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Hanyang (IRB no. 2003-4).

Gene e SNP selecção

através de revisão da literatura, identificou 30 genes candidatos que podem estar envolvidos na CagA via de transdução de sinal que está ligado a jusante de sinalização de ERK pela interacção directa com CagA ou afecto secundário em sequências genéticas CagA [3], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Os 30 genes candidatos são os seguintes: v-Crk vírus do sarcoma de CT10 oncogene homólogo (
CRK); v-Crk sarcoma vírus CT10 oncogene homólogo (aviária) -como ( CRKL
); c-Src de tirosina quinase ( CSK
); fator de crescimento de proteínas 2 ligado ao receptor ( GRB2
); Met proto-oncogene (c- TEM
); fator nuclear de células T ativadas, citoplasmática, 4 dependente da calcineurina ( NFATC4
); proteína tirosina fosfatase, tipo não-receptor 11 ( PTPN11
); espermina sintase ( SMS
); filho de homólogo Sevenless 1 ( SOS1
); v-Src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) homólogo do oncogene viral (
SRC); ELK-relacionados tirosina quinase ( ERK
); quinase de adesão focal 1 ( FAK
); fosfolipase C-gama ( PLCy
); v-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rato viral homólogo oncogene ( KRAS
); RAS neuroblastoma viral (v-ras) homólogo oncogene ( ARN
); v-raf sarcoma murino oncogene viral homólogo B1 ( BRAF
); v-raf-1 da leucemia murina viral homólogo oncogene 1 ( RAF1
); ativada por mitógeno proteína quinase quinase 1 ( MAP2K1
); ativada por mitógeno proteína quinase quinase 3 ( MAP2K3
); ativada por mitógeno proteína quinase quinase 4 ( MAP2K4
); ativada por mitógeno proteína quinase quinase 5 ( MAP2K5
); ativada por mitógeno proteína quinase quinase 6 ( MAP2K6
); dependente da ciclina quinase inibidor 1A ( p21
); dedicador de citocinese 1 ( Dock180
); ras relacionadas C3 toxina botulínica substrato 1 ( RAC1
); membro do RAP1A de RAS família oncogene ( RAP1
); ERA família de proteínas, membro 1 ( WAVE
); Arp2 relacionados actina proteína-2 homólogo ( Arp2
); ARP3 relacionados actina proteína-3 homólogo ( Arp3
); fator de troca de nucleotídeos Rap guanina (GEF) 1 (
C3G).

A genotipagem

fase Discovery.

A genotipagem foi realizada utilizando o humano do genoma SNP matriz 5.0 de acordo com o protocolo padrão recomendado por instruções do fabricante [15]. Antes de genotipagem, as concentrações de DNA genômico para todos os sujeitos do estudo foram medidas usando um espectrofotômetro (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies). Para cada indivíduo ensaiado, 250 ng de DNA genómico foi digerido com uma enzima de restrição (PEN I ou Sty I). Embora nós analisamos um total de 580 SNPs dentro de +/- 5 kbp dos locais de genes 30-alvo, 103 polimorfismos foram excluídos devido a uma taxa de chamada SNP inferior a 95% ou um valor HWE inferior a 0,0001. Porque o SNP matriz humana do genoma 5.0 foi fabricado com base em uma população caucasiana, 115 SNPs não preenchia os critérios de MAF < 0,05 em asiáticos e também foram excluídos. Além disso, 20 casos e 14 controles foram excluídos devido a DNA genômico insuficiente (< 250 ng), discordância sexo ou pobre genotipagem (< 90%). Finalmente, 362 SNPs em 30 genes (taxa de genotipagem de 99,5%) foram genotipados em 81 casos e 85 controles. As imagens de cluster de intensidade de sinal foram revistos para todos os SNPs

fase de extensão

Sete SNPs com cru ou permutated p
valor <.. 0,02 (rs5999749, rs9418677, rs4635002, rs10901081, rs7853122, rs530801, rs747182) identificado na análise descoberta foram genotipados utilizando o Illumina Veracode GoldenGate Ensaio com BeadXpress de acordo com o protocolo do fabricante (Illumina, San Diego, CA, EUA) [16]. Para assegurar a confiabilidade dos dois métodos de genotipagem, 135 amostras (59 casos e 76 controles) foram genotipados duas vezes tanto pelo SNP matriz de todo o genoma humano 5.0 ea Illumina Veracode GoldenGate Ensaio, ea taxa de concordância foi > 98,2%. Dos 7 SNPs, rs9418677 foi excluído devido a uma taxa de chamada SNP < 95%. Dois casos e 40 controles com baixa disponibilidade de DNA (n = 15) ou taxa de chamada genotipagem < 90% (n = 27) também foram excluídos na análise. Finalmente, seis SNPs em cinco genes (taxa de genotipagem de 99,1%) foram analisados ​​em 398 casos e 360 ​​controles na fase de extensão.

H. pylori
e detecção CagA

H. pylori
estado de infecção e CagA soropositividade foram avaliados utilizando o ensaio de immunoblot, Helico Blot 2.1 ™ (MP Biomedicals Asia Pacific, Singapore). Helico Blot 2.1 ™ kits têm relatado uma sensibilidade de 99% para ambos H.pylori Comprar e soropositividade CagA e uma especificidade de 98% para H. pylori
e 90% para CagA soropositividade [17].

A análise estatística

O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) no grupo controle foi avaliado pelo teste exato de Fisher com um corte- off nível de HWE. < 0,0001

na verificação primária no conjunto de descoberta, a associação entre SNPs individuais e risco de câncer gástrico foi avaliado com base em bruto e permutated p
-Valores usando o LRT com um grau de liberdade no modelo de tendência (aditivo). O teste de tendência assume um efeito dose-resposta com um número crescente de alelos variantes. Permutado p
-Valores foram estimadas em 100.000 testes de permutação. Com base no modelo aditivo, o risco de câncer gástrico foi calculada como odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC), utilizando modelo de regressão logística não condicional o ajuste para fatores de risco que foram fumantes status (nunca vs.
Nunca) , H. pylori
infecção (positiva vs.
negativo) e CagA soropositividade (positivo vs.
negativo). A taxa Benjamini-Hochberg falsa descoberta (BH-FDR) corrigido p
-Valores de cada SNP foi computado para evitar a associação espúria com resultados positivos falsos [18].

Na fase de extensão, os SNPs mais significativos com cru ou permutated p
valor < 0,02 identificados na fase de descoberta foram reavaliadas. Com base no modelo aditivo, o risco de câncer gástrico foi estimada como RUP e ICs de 95% utilizando o modelo de regressão logística não condicional o ajuste para fatores de risco que foram fumantes status (nunca vs.
Nunca), H. pylori
infecção (positiva vs.
negativo) e CagA soropositividade (positivo vs.
negativo). Para resumir os resultados da descoberta e analisa a extensão, data-pooling e meta-análise foram realizadas. As RUP sumárias e ICs de 95% foram calculados usando um modelo de efeito fixo e heterogeneidade foi avaliada pelas estatísticas Cochran Q [19].

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SAS versão 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) e Plink software versão 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink) [20]. Meta-análises foram realizadas usando STATA versão 10 (Stata, College Station, TX).

Resultados

A tabela 1 resume as características básicas dos participantes do estudo em cada fase. casos de câncer gástrico mostrou taxas significativamente maiores de CagA soropositividade ( p = 0,03
na fase de descoberta, p = 0,09
na fase de extensão e p
= 0,02 entre os indivíduos no total) . H. pylori
, VacA soropositividade e tabagismo também foram mais altas entre os casos de câncer gástrico (Tabela 1).
genes

Na verificação primária do conjunto de descoberta, dos 362 SNPs seleccionados de CagA-relacionados no via de transdução de sinal, 24 SNPs em oito genes, ERK, Dock180, C3G, RAP1, Src, CrkL, Mek e Crk, foram significativamente associados com o risco de câncer gástrico na análise SNP única ( p Art < 0,05) . De acordo com o teste de 100.000 permutação, rs5999749 ERK e rs9418677 Dock180 apresentou uma forte associação com o câncer gástrico ( p Art < 0,01). Estes SNPs mostraram efeitos significativos de doses gene no teste de tendência linear e foram significativamente associados com um risco aumentado de câncer gástrico (OR = 2,83, [IC 95%: 1,42-5,65] para rs5999749 ERK; OR = 1,90, [95% CI : 1,18-3,05] para rs9418677 Dock180). Exceto para rs9418677 Dock180 e Rap1 rs17028287, a maioria dos SNPs jusante de CagA-Crk sinalização (Dock180, C3G, Rap1 e Mek) foram significativamente associados com um risco reduzido de câncer gástrico (Tabela 2).

Na fase de extensão , todas as associações entre os SNPs seleccionados e risco de câncer gástrico foram relativamente atenuado. ERK rs5999749, rs4635002 Dock180 e rs7853122 C3G apresentaram efeito dose-gene significativo para câncer gástrico (OR = 1,40, [IC 95%: 1,04-1,89]; OR = 0,65, [IC 95%: 0,44-0,94]; OR = 0,61, [IC 95%: 0,46-0,81], respectivamente). Em última análise combinada, que incluiu a descoberta e extensão análises, as estimativas de risco de rs5999749 ERK foram significativamente associados com câncer gástrico, tanto na análise conjunta e meta-análise (OR = 1,57, [IC 95%: 1,20-2,07]; OR = 1,56, [IC 95%: 1,19-2,06], respectivamente). Além disso, rs4635002 Dock180 e rs7853122 C3G mostrou redução significativa do risco de câncer gástrico em ambas as análises (OR = 0,60, [IC 95%: 0,42-0,84], OR = 0,61, [95% CI: ,43-0,87] para rs4635002 Dock180; OR = [IC 95%: 0,45-0,77] 0,59, OR = 0,59, [IC 95%: 0,45-0,76] para C3G rs7853122). Não houve heterogeneidade entre os estudos (teste de Cochran Q, p Art > 0,05), exceto para rs10901081 ( p
= 0,040) (Tabela 3)

Discussão <. br>

em nossa análise multi-estágio genética, três SNPs, rs5999749 ERK, rs4635002 Dock180 e rs7853122 C3G, mostrou fortes associações com câncer gástrico e podem ser fatores regulatórios importantes na via de transdução de sinal CagA.

quinase regulada por sinal extracelular (ERK), também conhecida como proteína activada por mitogénio quinase (MAPK), é um ponto importante para a integração de vários sinais celulares que regulam várias respostas oncogénicos. A via de sinal de ERK interage com um considerável número de substratos, incluindo a proteína-quinases, fosfatases, componentes do citoesqueleto, reguladores da apoptose, e uma variedade de outras moléculas relacionadas com a sinalização [21]. sinalização CagA é uma das correntes envolvidas na cascata de sinal de ERK. Numerosos estudos têm relatado que CagA-positivas H. pylori
pode ativar ERK em células epiteliais gástricas para promover inadequados funções celulares [11], [21], [22], [23]. Além disso, a interacção entre as proteínas de transdução de sinal e CagA promove a sinalização ERK em conjunto com Ras, Mek e NF-kB, induzir a carcinogénese gástrica. Em mecanismos celulares, ERK parece estar envolvido numa grande variedade de processos celulares. Assim, o gene hospedeiro da proteína ERK pode ser mais importante na determinação da expressão de proteínas e capacidade. Os resultados deste estudo demonstram que rs5999749 ERK é seleccionada principalmente em análise à base de SNP e mantém a sua forte associação com cancro gástrico nas análises finais combinadas. Isto suporta que o seu efeito genética pode desempenhar um papel crítico na carcinogénese gástrica igual ao seu nível de actividade de proteína na fase celular.

Dock180, sinónimo de um dedicador de citocinese 1, é uma proteína de 180 kDa molécula jusante-combinando de Crk e up-regulador da Rac1 [24]. Ele modula várias funções, incluindo a disseminação de células, migração de células, e a organização do citoesqueleto de actina, através da activação de Rac1 [24], [25], [26], [27], [28]. Esta proteína é uma das proteínas a jusante Crk envolvidas na cascata de CagA e Crk sinalização através da via Crk-Codk180-elmo [9]. Da mesma forma, C3G conhecido como factor de permuta de nucleótido de guanina Rap (GEF) 1 (RAPGEF1) também interage com o Crk [29]. Estudos anteriores demonstraram que a sinalização Crk-C3G-Rap1 pode activar a cascata da ERK e induzir a apoptose, o crescimento celular, migração, adesão e mortalidade [30], [31], [32]. Em carcinogénese humana, o gene C3G parece desempenhar um papel crucial por si só. Alteração da actividade genética C3G através da amplificação ou metilação está associada com vários cancros, tais como pulmão, gastrointestinal e cancros ginecológicos [33], [34]. Embora não seja exactamente bem conhecido se as variantes genéticas do gene Dock180 e C3G estão ligados a carcinogénese gástrica, o nosso estudo sugere vários SNPs nestes genes, especialmente rs4635002 e rs7853122, estão significativamente associados com o risco de cancro gástrico, e, assim, podem ser um gene suscetível ao desenvolvimento de câncer gástrico.

com base nos nossos resultados e revisão dos mecanismos celulares [3], [9], [11], [21], [22], [23], [24], [30], CagA oncogenicidade induzida por activação da via de sinalização de ERK pode ser inferido (Figura 1). A interacção com moléculas de ligação CagA tais como Src, Crk, GRB2 e SHP-2 estimula os sinais a jusante na cascata da ERK ligada às funções celulares aberrantes que levam à carcinogénese gástrica. Durante este processo, os efeitos genéticos de ERK, Dock180 C3G e podem desempenhar papéis críticos iguais para as suas actividades de proteína. Estes resultados fornecem suporte para a importância genética e celular dessas moléculas.

A nossa análise genética apresentou evidências plausíveis, tendo em variantes genéticas da via de transdução de sinal ERK ativado pelo CagA, mas várias limitações devem ser observados. Em primeiro lugar, o número de sujeitos do estudo era insuficiente para assegurar poder estatístico para avaliar a associação exata entre SNPs seleccionados e risco de câncer gástrico. Em segundo lugar, devido ao pequeno tamanho da amostra ea falta de pacientes com câncer gástrico cardíacos (menos de 5%), não foi possível realizar a análise estratificada de acordo com o tipo de câncer gástrico, cardíaco vs.
Não cardíaca. Portanto, os resultados devem ser interpretados com cautela.

Este estudo indica que genes envolvidos na via de transdução de sinal de ERK ativado pelo CagA pode modificar o risco de câncer gástrico. ERK, genes Dock180 C3G e podem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento do cancro gástrico. estudos de replicação em outras populações nos permitirá elucidar os mecanismos patológicos câncer gástrico. Mais estudos biológicos focadas nesses genes pode esclarecer seu papel na carcinogênese gástrica.

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