PLoS ONE: Онкогенный CagA Способствует риск рака желудка с помощью активирующего ERK сигнальных путей: вложенном исследование случай-контроль

Абстрактный

Фон
<р> CagA клеточного взаимодействия посредством активации сигнального пути ERK может стать отправной точкой в ​​развитии рака желудка. Целью данного исследования являлась оценка генов, вовлеченных в ERK вниз по течению сигнальных путей, активируемых CagA, являются ли восприимчивые генетические маркеры рака желудка.

Методы
<р> В стадии открытия, в общей сложности 580 ОНП в пределах + /-5 т.п.н. 30 генов-кандидатов были генотипированы исследовать ассоциацию с риском развития рака желудка в корейском многоцентровое Рак когорты (100 падающих наборов рака желудка случай-контроль). Наиболее значимые ОНП (сырые или перестановкой р
значение &л; 0,02) выявлены в ходе анализа обнаружения были переоценены в фазе расширения с использованием безусловной модели логистической регрессии (400 желудка наборы рака случай-контроль). Комбинированный анализ, включая pooled- и мета-анализ были проведены, чтобы суммировать все результаты.

Результаты
<р> 24 ОНП в восьми генов (ЭРК, Dock180, C3G, Rap1, Src, CrkL, Мек и Crk) были значительно связаны с риском развития рака желудка в индивидуальной SNP анализа на этапе обнаружения ( р
&л; 0,05). В расширении анализа, ERK rs5999749, rs4635002 Dock180 и C3G rs7853122 показал незначительно значительное влияние генно-дозы для рака желудка. Последовательно, окончательный комбинированный анализ представлен ОНП в значительной степени связано с риском развития рака желудка (OR = 1,56, [95% ДИ: 1.19-2.06], OR = 0,61, [95% ДИ: 0.43-0.87], OR = 0,59, [95 % ДИ: 0.54-0.76], соответственно)

выводы
<р> Наши результаты показывают, что ERK rs5999749, rs4635002 Dock180 и C3G rs7853122 генетические детерминанты в желудочном канцерогенезе
<р> Цитирование.. : Ян JJ, чо LY, Ма SH, Ко КП, Шин A, Choi BY, и др. (2011) Онкогенный CagA Содействует Желудочный риск рака с помощью активирующего ERK сигнальных путей: вложенном исследование случай-контроль. PLoS ONE 6 (6): e21155. DOI: 10.1371 /journal.pone.0021155
<р> Редактор: Патрик Тан, Duke-Национальный университет Сингапура Высшей медицинской школы, Сингапур
<р> Поступило: 22 июля 2010 года; Принято: 21 мая 2011 года; Опубликовано: 16 июня, 2011
<р> Copyright: © 2011 Ян и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была поддержана грантом программы научных исследований фундаментальной науки в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники [KRF-2007-313-E00175] и [СРН-2009-0066258]. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> хеликобактер пилори ( H. пилори
) является проверенным причиной рака желудка [1]. Тем не менее, ее абсолютный эффект может быть изменен с помощью индивидуальных факторов риска, таких, восприимчивость, как генетические варианты и H. Pylori
вирулентные характеристики [2], [3]. Цитотоксин-ассоциированный антиген (CagA), а H. Pylori
иммуноглобулин, является решающим фактором для индивидуальной восприимчивости и ассоциируется с тяжелыми клиническими результатами, включая рак желудка [4], [5], [6]. В эпителиальных клеток желудка, CagA препятствует разнообразных путей передачи сигнала, таких как Dock180-Rac1-WAVE-Arp2 /3, C3G-Rap1-BRAF-MEK, Sos1-HRAs-Raf1 и Ras-Raf-MEK-ERK сигнализации [3 ], [7], [8], [9]. Сигналы, модифицированные CagA вызывают клеточные изменения, такие как апоптоз, пролиферации и клеточной смертности, а также стимулировать желудка канцерогенез [10], [11], [12].
<Р> Среди нескольких последующих путей, активируемых CagA, внеклеточный сигнал -regulated киназы (ERK) каскад является основной путь, как он играет важную роль в желудочном канцерогенезе. CagA клеточные взаимодействия с Src, SHP2, Crk, CrkL или GRB2 значительно связаны с активацией ERK, а также другие разнообразные белки, участвующие в передаче сигналов CagA тесно связаны с ERK сигнальных путей [10], [11], [12], [13] , Белки можно регулировать их генов-хозяев; Таким образом, гены, кодирующие белки, связанные с процессом передачи сигналов CagA и ERK может быть важным для желудка канцерогенеза, но несколько исследований были сосредоточены на этих генетических полиморфизмов.
<р> CagA онкогенности может стать отправной точкой в ​​развитии рака желудка путем активации Эрк сигнального пути. Эти сигнальных каскадов по всей видимости, быть модифицированы генетическими вариантами хозяина. Таким образом, мы предположили, что гены, участвующие в нисходящем сигнальные пути ERK, активируемых CagA могут быть подвержены генетические маркеры для рака желудка. Чтобы оценить эту гипотезу, мы провели многоступенчатую генетическая связь изучают, которая включала 1) этап обнаружения: анализ генов-кандидатов, которые сосредоточены на 30 генов, ЦРК, CrkL, CSK, Grb2, с-Met, NFATC4, PTPN11, SMS, SOS1 , Src, ERK, ФСП, PLCγ, KRAS, NRAS, BRAF, RAF1, MAP2K1, MAP2K3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K6, p21, Dock180, RAC1, RAP1, WAVE, Arp2, Arp3 и C3G, участвующих в сигнале CagA и ERK сигнальному пути, и 2) фазы расширения, которые были рассмотрены наиболее значимые ОНП, выявленных в ходе анализа обнаружения.

Методы

Исследуемая популяция

Обнаружение фазы.
<р> анализ ген-кандидат открытие было популяционное исследование случай-контроль в рамках корейского многоцентровое рака когорты (KMCC). С 1993 по 2004 г. KMCC набраны в общей сложности 19,688 участников из четырех городских и сельских районов в Корее. Все участники заполняли подробные стандартизированные анкеты по личному интервью после информированного согласия. Образцы крови и мочи отбирали также. Благодаря рекордными связей с национальной свидетельства о смерти, медицинского страхования медицинских баз данных записей и национального ракового регистра, все участники были пассивно прослежены вверх, и вновь диагностированных случаев было установлено. Более подробная информация о KMCC описана в другом месте [14]. В декабре 2005 года, 249 случаев рака желудка определяется в соответствии с Международной статистической классификации болезней и связанных со здоровьем проблем 10-го пересмотра (МКБ-10, С16) были идентифицированы. Диагностированных случаев до того набора (п = 52), без каких-либо образцов крови (п = 35) или недостаточный уровень ДНК при 50 нг /мкл (п = 62) были исключены. управления без рака были сопоставимы по возрасту (± 5 лет), пол, жилой район, и зачисление в год. И, наконец, были определены 100 комплектов желудка случаев рака и контрольных группах. Фаза

Extension.
<Р> 1) В декабре 2008 года 95 новых случаев рака желудка дополнительно установлено от KMCC. Эти случаи и 116 случаев, которые были исключены в когорте обнаружения из-за статуса распространенности или недостаточной концентрации ДНК были включены в фазе расширения (n = 211). Используя тот же метод, что и соответствующий стадии открытия, были выбраны 211 управления. 2) Желудочный случаев заболевания раком были получены от двух университетских больниц в Корее, которые были University Hospital CHUNGNAM и Ханьян университета Гурий больницы. С марта 2002 по сентябрь 2006 года в общей сложности 490 больных раком желудка были вновь диагностированных в больницах. Их эпидемиологические данные и венозные целые образцы крови были собраны на момент постановки диагноза или до желудочной хирургии рака. Среди них, 189 случаев с достаточным образцов ДНК и осознанного согласия были также включены в набор расширений. Кроме того, 189 управления на базе общин были сопоставимы по возрасту (± 5 лет) и пола из субъектов, зарегистрированных после KMCC 2000.

Этика Заявление

В исследовании протоколов для исследования KMCC, больница основанное исследование и текущее исследование случай-контроль вложенная были одобрены советами институциональных (IRB) из Сеульского национального университета и больницы Национальный онкологический центр Кореи (H-0110-084-002 и C-0603-161-170) и этическими комитетами больницы Ханьянг университета (IRB нет. 2003-4).

Джин и SNP выбор

с помощью обзора литературы, мы идентифицировал 30 генов-кандидатов, которые могут быть вовлечены в CagA пути передачи сигнала связан с ERK вниз по течению сигнализации путем прямого взаимодействия с CagA или вторичным поражением в генетических последовательностей CagA [3], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. 30 генов-кандидатов следующим образом: V-Crk вируса саркомы CT10 онкоген гомолога ( ЦРК
); v-Crk вируса саркомы CT10 онкоген гомолога (птичий) -как ( CRKL
); с-Src тирозинкиназы ( CSK
); рецептор фактора роста связанный белок 2 ( Grb2
); Met протоонкогена (C- MET
); Ядерный фактор активированных Т-клеток, цитоплазматических, кальцийнейрина-зависимый 4 ( NFATC4
); протеинтирозинфосфатазы, тип не-рецептор 11 ( PTPN11
); спермин-синтазы ( SMS
); сын sevenless гомолога 1 ( SOS1
); v-Src саркомы (Шмидт-Руппин А-2) вирусный онкоген гомолога ( SRC
); лосей, связанных с тирозин-киназы ( ERK
); фокусного адгезионная киназа 1 ( ФСП
); фосфолипазы С-гамма ( PLCγ
); v-Ki-ras2 Кирстен крысы саркома вирусный онкоген гомолога ( KRAS
); нейробластома РАН вирусные (v-РАС) онкоген гомолога ( NRAS
); v-Raf мышиный саркома вирусных онкогенов гомолога B1 ( BRAF
); v-Raf-1 мышиного лейкоза вирусный онкоген гомолога 1 ( RAF1
); митоген-активируемая протеинкиназа киназы 1 ( MAP2K1
); митоген-активируемая протеинкиназа киназа 3 ( MAP2K3
); митоген-активируемая протеинкиназа киназа 4 ( MAP2K4
); митоген-активируемая протеинкиназа киназа 5 ( MAP2K5
); митоген-активируемая протеинкиназа киназа 6 ( MAP2K6
); циклин-зависимой киназы 1A ингибитора ( p21
); посвящающий цитокинеза 1 ( Dock180
); RAS-связанные C3 ботулотоксин субстрат 1 ( RAC1
); член RAP1A РАН онкоген семьи ( RAP1
); WAS семейство белков, член 1 ( ВОЛНА
); ARP2 актин-белок, связанный с 2 ​​гомолог ( Arp2
); ARP3 актина белок, связанный с 3 гомолог ( Arp3
); Rap гуанин фактор нуклеотид обмена (ГЭФ) 1 ( C3G
).

генотипирование

фаза Discovery.
<Р> генотипирование проводили с использованием генома человека SNP массив 5.0 в соответствии со стандартным протоколом, рекомендованным инструкциями изготовителя [15]. До генотипирования концентрации геномной ДНК для всех испытуемых измеряли с помощью спектрофотометра (NanoDrop ND-1000, NanoDrop технологии). Для каждого отдельного анализировали, 250 нг геномной ДНК переваривают ферментом рестрикции (NSP I или Sty I). Хотя мы протестировали в общей сложности 580 ОНП в пределах +/- 5 т.п.н. местоположений гена 30-мишеней, 103 полиморфизмы были исключены из-за скорости СНП вызова, менее 95% или значение Hwe менее 0,0001. Поскольку генома человеческого SNP массива 5.0 был изготовлен на основе кавказского населения, 115 ОНП не отвечают критериям MAF < 0,05 в азиатов и были также исключены. Кроме того, 20 случаев и 14 управления были исключены из-за недостаточной геномной ДНК (&250; ЛТ нг), пол несогласованности или плохой генотипирования (&Лт; 90%). И, наконец, 362 ОНП в 30 генов (скорость генотипирование 99,5%) были генотипированы в 81 случаях и 85 управления. Кластерные изображения интенсивности сигнала были рассмотрены для всех ОНП

фаза Extension
<р> Семь ОНП с сыром или перестановкой р
значение &л;.. 0,02 (rs5999749, rs9418677, rs4635002, rs10901081, rs7853122, rs530801, rs747182) определены в ходе анализа обнаружения генотипирования с использованием Illumina Veracode GoldenGate анализа с BeadXpress в соответствии с протоколом производителя (Illumina, Сан-Диего, штат Калифорния, США) [16]. Для обеспечения надежности двух методов генотипирования, 135 образцов (59 случаев и 76 контроля) генотипирования дважды как генома человека SNP массива 5.0 и Illumina Veracode GoldenGate Assay, и скорость конкордации была > 98,2%. Из 7 ОНП, rs9418677 был исключен из-за скорости SNP вызова и ЛТ; 95%. Два случая и 40 управления с низкой доступностью ДНК (п = 15) или скорости соединения при вызове генотипирования &ЛТ; 90% (п = 27) были также исключены при анализе. И, наконец, шесть ОНП в пяти генов (скорость генотипирование 99,1%) были проанализированы в 398 случаях и 360 управления в фазе расширения.

H. пилори
и обнаружение CagA

H. Pylori
серологического статуса и CagA сероположительность оценивали с использованием иммуноблота, Helico Blot 2.1 ™ (MP Biomedicals Asia Pacific, Singapore). Helico Клякса 2.1 ™ комплекты сообщили чувствительность 99% для обоих H.pylori
и CagA сероположительность и специфичность 98% для H. пилори
и 90% для CagA серопозитивностью [17].

Статистический анализ
<р> Равновесие Харди-Вайнберга (HWE) в контрольной группе оценивали с помощью точного критерия Фишера с Cut- от уровня HWE &Лт;. 0.0001
<р> При первичном сканировании в наборе обнаружения, связь между отдельными полиморфизмов и риском развития рака желудка оценивали на основании сырые и перестановкой р
-значения с помощью LRT с 1 степенью свободы в тренде (аддитивной) модели. Тест тенденция предполагает эффект доза-реакция с увеличением числа вариантов аллелей. Перестановкой р
-значения были оценены 100000 перестановок тестов. На основе аддитивной модели, риск развития рака желудка не рассчитывали как отношения шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ) с использованием безусловной модели логистической регрессии с поправкой на факторы риска, которые были курительных статус (когда-либо против.
Никогда) , H. Pylori
инфекция (положительная против.
отрицательные) и CagA сероположительность (положительный против.
отрицательный). Benjamini-Хехберга ложных обнаружения (BH-FDR) исправил р
-значения каждого SNP была вычислена, чтобы избежать паразитных связи с ложными положительными результатами [18].
<Р> В фазе расширения, наиболее значимые ОНП с сырым или перестановкой значение р
< 0,02, идентифицированные в стадии открытия были переоценены. На основе аддитивной модели, риск развития рака желудка был оценен как ОШ и 95% ДИ с использованием безусловной логистической регрессии с поправкой на факторы риска, которые были курительных статус (когда-либо против.
Никогда), H. Pylori
инфекция (положительная против.
отрицательные) и CagA сероположительность (положительный против.
отрицательный). Суммируя результаты открытия и расширение анализа, были проведены данные пулов и мета-анализ. Итоговые ОШ и 95% ДИ были рассчитаны с использованием модели фиксированного эффекта и гетерогенности оценивали с помощью статистики Cochran Q [19].
<Р> Все статистические анализы были проведены с использованием SAS версии программного обеспечения 9.1 (SAS Institute, Cary, Северная Каролина) и Plink версия программного обеспечения 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink) [20]. Мета-анализ проводили с использованием STATA версии 10 (Stata, College Station, TX).

Результаты
<р> В таблице 1 приведены основные характеристики участников исследования в каждой фазе. Желудочный случаев рака показали значительно более высокие показатели CagA серопозитивностью ( р
= 0,03 в стадии открытия, р
= 0,09 в фазе расширения и р = 0,02
среди общего числа испытуемых) , H. Pylori
инфекции, VacA сероположительность и статус курения были также выше среди больных раком желудка (таблица 1).

В первичном сканировании множества открытий, из 362 ОНП выбранных из CagA связанных генов в трансдукции сигнала пути, 24 ОНП в восьми генах, ERK, Dock180, C3G, Rap1, Src, CrkL, MEK и Crk, были значительно связаны с риском развития рака желудка в одном анализе SNP ( р
&л; 0,05) , Согласно тесту на 100000 перестановок, ERK rs5999749 и rs9418677 Dock180 более сильный ассоциацию с раком желудка ( P
≪ 0,01). Эти ОНП показали значительные эффекты гена-дозы в тесте линейного тренда и были в значительной степени связано с повышенным риском развития рака желудка (OR = 2,83, [95% ДИ: 1.42-5.65] для ERK rs5999749; OR = 1,90, [95% ДИ : 1.18-3.05] для Dock180 rs9418677). для Dock180 rs9418677 и Rap1 rs17028287 За исключением случаев, большинство ОНП вниз по течению от CagA-Crk сигнализации (Dock180, C3G, Rap1 и МЕК) были в значительной степени связано со снижением риска рака желудка (таблица 2).
<р> В фазе расширения , все ассоциации между выбранными полиморфизмов и риском развития рака желудка были относительно ослаблены. ЭРК rs5999749, rs4635002 Dock180 и C3G rs7853122 показали значительный эффект генной дозы для рака желудка (OR = 1,40, [95% ДИ: 1.04-1.89], OR = 0,65, [95% ДИ: 0.44-0.94]; OR = 0,61, [95% ДИ: 0.46-0.81], соответственно). В окончательном комбинированном анализе, который включал открытие и расширение анализов, оценки риска Эрк rs5999749 были связаны с раком желудка в обоих Обобщенный анализ и мета-анализ (OR = 1,57, [95% ДИ: 1.20-2.07]; ИЛИ = 1,56, [95% ДИ: 1.19-2.06], соответственно). Кроме того, Dock180 rs4635002 и rs7853122 C3G показали значительно снижает риск развития рака желудка в обоих анализах (OR = 0,60, [95% ДИ: 0.42-0.84], OR = 0,61, [95% ДИ: 0.43-0.87] для Dock180 rs4635002; ИЛИ = 0,59, [95% ДИ: 0.45-0.77], OR = 0,59, [95% ДИ: 0.45-0.76] для C3G rs7853122). Там не было гетерогенность во всех исследованиях (тест Cochran Q, р
> 0,05) для rs10901081 ( р
= 0,040) (таблица 3)

Обсуждение <исключением. BR>

В нашем многоступенчатой ​​генетического анализа, три ОНП, ERK rs5999749, rs4635002 Dock180 и C3G rs7853122, показали сильные ассоциации с раком желудка и могут быть важными регуляторные факторы в сигнальному пути CagA сигнала.
<р> внеклеточной регулируемой киназы (ERK), также известный как митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК), является важной точкой интеграции для нескольких клеточных сигналов, которые регулируют различные онкогенные ответы. Путь ЭРК сигнал взаимодействует с большим количеством субстратов, в том числе протеинкиназ, фосфатазы, цитоскелета компонентов, регуляторов апоптоза, а также ряд других сигнальных молекул, связанных с [21]. сигнализации CagA является одним из потоков, участвующих в каскаде ЭРК сигнала. Многочисленные исследования показали, что CagA-позитивных H. пилори
может активировать ERK в эпителиальных клеток желудка, чтобы способствовать неуместные клеточные функции [11], [21], [22], [23]. Кроме того, взаимодействие между CagA и сигнальной трансдукции белков способствует сигналов ERK в сочетании с Ras, Мек и NF-кБ, вызывая желудочный канцерогенез. В клеточных механизмов, ЭРК-видимому, участвует в самых разнообразных клеточных процессов. Таким образом, хозяин ген белка ERK может быть более важным фактором в определении экспрессии белка и способности. Результаты этого исследования показывают, что ERK rs5999749 в первую очередь выбирают в SNP на основе анализа и сохраняет свою сильную ассоциацию с раком желудка в финальных комбинированных анализов. Это подтверждает, что его генетический эффект может играть решающую роль в желудочном канцерогенезе равным уровню активности белка на клеточном этапе.
<Р> Dock180, синонимом посвящающий цитокинеза 1, является 180 кДа белок вниз по течению, комбинируя молекулы из Crk и повышающего регулятора Rac1 [24]. Он модулирует различные функции, в том числе распространения клеток, миграцию клеток и актина цитоскелета организации через активацию Rac1 [24], [25], [26], [27], [28]. Этот белок является одним из белков Crk-вниз по течению, участвующих в каскаде CagA и Crk сигнализации с помощью изофермента Crk-Codk180-Elmo [9]. Точно так же, C3G известный как Rap гуанин нуклеотид обменный фактор (ГЭФ) 1 (RAPGEF1) также взаимодействует с Crk [29]. Предыдущие исследования показали, что передача сигналов Crk-C3G-Rap1 может активировать каскад ERK и индуцирует апоптоз, клеточный рост, миграцию, адгезию и смертности [30], [31], [32]. В человеческом канцерогенеза, ген C3G-видимому, играет решающую роль сама по себе. Внесение изменений в генетической активности C3G через усиление или метилирования связано с несколькими видов рака, таких как рак легких, желудочно-кишечных и гинекологических раковых заболеваний [33], [34]. Несмотря на то, что это не совсем хорошо известно ли генетические варианты гена Dock180 и C3G связаны с желудка канцерогенеза, наше исследование показывает несколько ОНП в этих генах, особенно rs4635002 и rs7853122, которые в значительной степени связано с риском развития рака желудка, и, таким образом, может быть восприимчивый ген в развитии рака желудка.
<р> на основании представленных результатов и обзор клеточных механизмов [3], [9], [11], [21], [22], [23], [24], [30], CagA онкогенности индуцируется активации пути ЭРК сигнала может быть infered (рисунок 1). CagA взаимодействие с связывающими молекулами, такими как Src, Crk, GRB2 и SHP-2 стимулирует вниз по течению сигналы в ERK каскада связаны с аномальным клеточных функций, что приводит к действию желудочного канцерогенеза. В ходе этого процесса, генетические эффекты ЭРК, Dock180 и C3G могут играть решающую роль, равные их белковых деятельности. Эти результаты обеспечивают поддержку генетической и клеточной важности этих молекул.
<Р> Наш генетический анализ представил правдоподобные данные о генетических вариантов сигнальному пути ERK сигнала, активированного CagA, но несколько ограничений следует отметить. Во-первых, число субъектов исследования было недостаточно для обеспечения статистической мощности для оценки точной связи между выбранными полиморфизмов и риском развития рака желудка. Во-вторых, из-за небольшого размера выборки и отсутствия кардиологических больных раком желудка (менее 5%), мы не могли проводить слоистую анализ в соответствии с желудочной типа рака, сердечных против.
Несердечная. Таким образом, полученные результаты следует интерпретировать с осторожностью.
<Р> Это исследование показывает, что гены, участвующие в пути передачи сигнала ERK активированного CagA может изменить риск развития рака желудка. ЭРК, гены Dock180 и C3G могут играть важную роль в развитии рака желудка. исследования репликации в других популяциях позволит нам выяснить рака желудка патологические механизмы. Дальнейшие биологические исследования были сосредоточены на этих генов может прояснить свою роль в желудочном канцерогенезе.

• PLoS ONE: геномная Профилирование подслизистых-инвазивным рака желудка на основе массивов сравнительная геномн…
• PLoS ONE: микроРНК Let-7F Тормозит Опухоль инвазии и метастазированию Нацеливаясь MYH9 в человека рака желудка