Введение
Как и большинство видов рака, рак желудка (GC) является высокоэффективным. агрессивная злокачественная опухоль, которая имеет тенденцию к вторжению окружающие ткани и метастазировать в отдаленные органы. Хотя пациенты с лимфоузлов раком желудка имеют лучшие результаты, чем те, с узловой метастаз [1, 2], некоторые из которых до сих пор страдал от местных рецидивов или отдаленных метастазов после резекции целебной [3-5]. Определение эффективных факторов или ключевые молекулы, связывающие с прогрессированием заболевания в постановочных лимфоузлов больных раком желудка необходимо, учитывая, что эти пациенты могут извлечь пользу из адъювантной терапии.
<Р> хемотаксиса играет ключевую роль в метастазирование опухоли, направляя моторику метастатические клетки через градиенты хемоаттрактанты. Следует отметить, что рецепторы хемокинов опосредуют органоспецифический метастазирование опухолей путем взаимодействия с их согласующих хемокинов на органы-мишени [6]. Клетки рака желудка может выражать различные рецепторы хемокинов, таких как хемокинов рецептор 4 (CXCR4) и рецептора хемокинов 7 (CCR7) и кооптировать эти молекулы для метастазирования [7.12]. Другие роли рецепторов хемокинов в прогрессии рака для хемотаксиса за исключением того, были редко раскрыты. CCR4, рецептор типа хемокин С-С, ранее была сосредоточена на ее биологической функции в иммунопатогенеза гематологических опухолей [13]. На сегодняшний день относительно мало внимания было уделено роли CCR4 в продвижении метастазирование некоторых солидных опухолей, включая рак желудка [14-17]. Наша группа показала, что лимфоцит богатых ШС, как правило, чаще позитивно для CCR4, и обнаружили новую роль CCR4 в иммуносупрессии индуцированный опухолью [18], что указывает на различные профили экспрессии CCR4 в GC тканях и многофункциональные роли этой молекулы в прогрессии GC.
<р> хорошо известно, что вторжение является первым шагом, ведущим к метастазирования рака. Evidences показали, что некоторые рецепторы хемокинов, такие как CXCR4 [19] и CCR7 [20], продвигать B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз инвазию клеток через повышающей регуляции ММР-9. В последнее время, Ю. и др. показал, что CXCR4 может способствовать клеточной миграции и инвазии через индукции экспрессии ММР-9 и ММР-13 в полости рта плоскоклеточного рака [21]. Ли и его коллеги обнаружили, что CCR7 был вовлечен в вторжения рака толстой кишки человека с помощью повышающей регуляции MMP-9 [22]. Не ясно, однако, может ли CCR4 также способствовать инвазии раковых клеток.
<Р> Учитывая широкое распределение рецепторов хемокинов в опухоли иих потенциальные роли в опухолевой инвазии и метастазирования, мы предположили, что Pn0 больных раком желудка, перевозящих определенные хемокин рецепторы могут быть более склонны испытывать дальнейшее прогрессирование. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы исследовали профили экспрессии CCR4 в желудочном раковых клетках pN0 пациентов и его роль в желудочном раковых клеток вторжения.
Пациенты и образцы
<р> образцы тканей были получены из 108 пациентов (75 мужчин и 33 женщин в возрасте 35-71 лет, средний возраст 62 лет) с pn0 раком желудка, подвергающиеся целебное резекцию первичной опухоли в Qilu больнице университета Шаньдун (Цзинань, Китай). Мы использовали выше соответствием соседних нормальных тканей желудка и тканей от 56 желудка дисплазии больных (36 мужчин и 20 женщин, в возрасте 35-68 лет, средний возраст 48 лет) в качестве контрольной группы. Все гистологические диагнозы и злокачественные классификации были определены старшие патологоанатомами на момент постановки диагноза, согласно данным Всемирной организации здравоохранения Международной гистологической классификации опухолей [23], а также послеоперационный патологический постановка была определена на основе Международного союза по борьбе с раком (UICC) [24 ]. Исследование было одобрено Комитетом по этике Qilu больницы путем, и было получено также письменное информированное согласие от всех пациентов.
для культивирования клеток
человеческого желудка. клеточные линии рака SGC-7901 и КУП-823 были приобретены из коллекции культур китайской академии наук (Шанхай, Китай) и поддерживается в среде RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, США) с добавлением 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) при 37 ℃ в увлажненной атмосфере 5% CO <югу> 2.
Переходная избыточная экспрессия CCR4 в SGC-7901 и клеток BGC-823
<р> скоротечно трансфекция плазмиды EGFP-CCR4 (CCR4) или в вектор экспрессии EGFP (MOCK) в желудочном клеточных линий проводили с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), как сообщалось ранее [18]. И эффективность трансфекции определяли с помощью флуоресцентного микроскопа, в режиме реального времени обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и проточной цитометрии (ТСМ), соответственно.
Матригель нашествие анализы жизнеспособность клеток анализ Сверхэкспрессия CCR4 с различными узорами экспрессии в Pn0 ранней ткани рака желудка Обсуждение
<р> в пробирке
нашествие анализ проводили с использованием вставок 24 клеточных культур, содержащих 8 мкм мембраны (BD Biosciences, San Jose, CA). Каждая мембрана была покрыта Матригель (30 мкг, Becton Dickinson, San Jose, CA), и инкубировали в течение 30 минут. Затем, 0,2 мл, трансфицированные или GC клетки родительских повторно суспендировали в бессывороточной среде RPMI-1640 с концентрацией 1,5 × 10 5 /мл и помещают в верхнюю камеру, и 0,6 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, было добавлены к базолатеральной камере. После 24 часов инкубации при 37 ℃ с 5% CO <суб> 2, клетки фиксировали и окрашивали 0,2% эозином Y. Число клеток, которые мигрировали к базальной стороне мембраны количественно оценивали под световым микроскопом при 200 × увеличение.
<р> клетки высевали в 96-луночные планшеты при 5 × 10 3 клеток /лунку и культивировали в течение указанных временных точках. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием CCK8 (Beyotime, Haimen, Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя. Оптическую плотность измеряли при 450 нм длины волны. Каждая временная точка была повторена в трех лунках, и анализ был independentlyperformed три раза.
Желатин зимографии
<р> Супернатанты собирали центрифугированием после 24 часов после трансфекции, и разделяли на геле SDS-PAGE, содержащую 0,1% (вес /объем) желатин. После электрофореза белки ренатурировали путем промывания гель дважды в течение 40 мин в 2,5% Triton X-100 с последующей инкубацией в течение 18 часов при температуре 37 ° С в смеси, содержащей трис-HCl 50 мМ (рН 7,6), CaCl <суб> 2 5mMm и NaCl 200 мМ. Затем гель был кратко промыть в дистиллированной воде и окрашивают 0,25% кумасси бриллиантовым синим R250 /45% метанола /10% уксусной кислоты в течение 4 часов, а затем обесцвечивают в 45% метаноле, 8% уксусной кислоты. Гели затем сканируется и сфотографировали с системами Kodark.
Статистический анализ
<р> Данные по крайней мере, в трех независимых экспериментах были проанализированы и выражены как среднее ± стандартное отклонение. Взаимосвязь между экспрессией CCR4 и Т стадии анализировали с помощью критерия хи-квадрат тест. Другие данные были проанализированы с помощью теста т Student или ANOVA там, где это необходимо. A значение менее 0,05 P
рассматривалось как статистически значимое. Все анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения (версии 13.0, SPSS, Inc., Chicago, IL).
Результаты
<р> выражение CCR4 в раковых клетках был обнаружен при переменных уровнях. Среди 108 залитых парафином тканей, 29 случаев (26,9%) показали отрицательное выражение (-), 30 случаев (27,8%) показали слабое выражение (+), 35 случаев (32,4%) показали умеренное выражение (++), и 14 случаев (13,0%) показали сильное выражение (+++) (рис. 1A-D). Все соседние нормальные ткани желудка показали отрицательный результат окрашивания для CCR4, и только 2 (3,6%) случаев желудочной дисплазии показали слабую экспрессию мембранного CCR4 (рис. 1E и F).
<Р> Обе мембраны и цитоплазмы экспрессия CCR4 были наиболее часто наблюдаются в хорошо дифференцированных опухолевых гнезд кишечного типа, в то время как менее дифференцированные клетки, как правило, чтобы отобразить цитоплазматический характер экспрессии CCR4 в диффузный типа рака желудка (рис. 2). Интересное явление в том, что клетки с высокой инвазии, такие как мышцы вторжения, проникновения сосудов и нервов вторжения, также отображается цитоплазматический паттерн экспрессии CCR4 (рис. 3).
CCR4 избыточная экспрессия способствует клетку рака желудка вторжение
<р> на типичных участках, было также показано, что уровень экспрессии CCR4 имеет тенденцию к увеличению с глубиной инвазии опухоли (рис. 3). Анализ IHC ясно показали, что избыточная экспрессия CCR4 была положительно связана с Т стадии ( P
= 0,002), сосудистая инвазия ( P
= 0,001) и периневральная инвазия (P = 0,002) в pn0 GC (таблица 1).
<р> Мы сообщали, что уровни белка CCR4 были довольно низкими в некоторых желудочных клеточных линий [18], и, таким образом, чтобы получить более полное представление в опухолевой инвазии CCR4 опосредованную, пере- экспрессия CCR4 в желудочном клеточных линий проводили, как мы ранее описано [18]. Высокие эффективность трансфекции определяли в реальном масштабе времени RT-PCR, ТСМ и флуоресцентной микроскопии, соответственно (рис. 4A-C). EGFP было выражено в ядре, цитоплазме и мембраны контрольных вектор клеток, которые были трансфицированы с ПРОБНОЙ плазмиды; и флуоресцентный слитый белок был локализован на цитоплазму и мембрану плазмиды трансфицировали клетки ccr4. Матригель инвазия анализ показал, что число EGFP-ccr4 трансфецированных клеток рака желудка, проходящих через Матригель были значительно выше, чем у мнимо трансформированных клеток рака желудка (рис. 4D). Анализ показал, что CCK8 избыточная экспрессия CCR4 не оказывал влияния на пролиферацию клеток рака желудка (S1 рис).
CCR4-регулируемых ММР-9 производства в раковых клетках желудка
<р> Чтобы проверить возможные механизмы, лежащие в основе CCR4-опосредованного опухолью вторжения, мы оценивали влияние CCR4 на ММР-9 экспрессии и активности. В реальном масштабе времени анализ ОТ-ПЦР (фиг. 5A) показало, что EGFP-ccr4-трансфецировали Клетки рака желудка выражено более высокие уровни MMP-9 мРНК по сравнению с мнимо трансформированных клеток через 24 ч после трансфекции. Желатин зимографии анализ (рис. 5B) показал, что секреция и активность ММР-9 были значительно повышающей регуляции в супернатантах, EGFP-ccr4-трансфецированных клеток по сравнению с мнимо трансформированных клеток за 48 ч после трансфекции с использованием или без добавления экзогенные CCL22.
<р> взаимодействие между хемокиновых рецепторов раковых клеток и их соответствия хемокинов представляют собой важные шаги в метастазирование опухоли. Тем не менее, результаты нашего текущего studyshowed, что определенное количество больных раком желудка без метастазов лимфатического также были положительными для CCR4 окрашивания. В отличие от большинства предыдущих исследований функций хемотаксиса, опосредованного некоторых рецепторов хемокинов, это исследование показало, роман, инвазивное поведение CCR4.
<Р> Хемокиновые рецепторы принадлежат к семейству семи трансмембранных G-белком рецепторов, которые являются мембраны белки, а также функциональные последствия активности рецепторов хемокинов, как правило, полагают, зависит от стимуляции внеклеточных лигандов [27]. Однако гистологические образцы настоящего исследования показали, что существуют различные паттерны экспрессии для CCR4. CCR4 в неопухолевых клетках показали отрицательный результат окрашивания, только слабым мембранным окрашиванием в желудочном дисплазии поражений. Мембранные и цитоплазматический экспрессия CCR4 наиболее часто появлялись в умеренной и хорошо дифференцированных опухолевых гнезд, тогда как экспрессия в менее дифференцированных клеток, как правило, ограничивается в основном в цитоплазме. И еще интригующе, как показано на типичных участках, опухолевые клетки, проявляющие высокие инвазивные способности, такие как мышцы вторжения, проникновения сосудов и нервов вторжения, часто показали повышенную цитоплазматическую экспрессию CCR4. Наши данные свидетельствуют о тесной связи между цитоплазматической характера экспрессии CCR4 и агрессивное поведение желудочных раковых клеток. Это открытие противоречит здравому предположению о том, что внеклеточный домен рецептора хемокинов необходимо применять в метастазировании опухолей путем взаимодействия с его лигандом. Подобные явления наблюдались с рецептора хемокинов CXCR4, чья ядерная локализация была связана с прогрессированием различных опухолей [28-30]. Эти данные indictate, что желудочные раковые клетки могли бы вторгнуться в соседние ткани с помощью CCR4 в лиганд-независимым способом. Другая гипотеза заключалась в том, что CCR4 интернализации, вызванное его лигандом может представлять собой механизм, который эволюционировал в цитоплазматической экспрессии рисунка CCR4. CCL22, то CCR4 лиганда получают путем желудочной ткани рака человека [31], также известно, causeCCR4 интернализации из мембраны в цитоплазму [32, 33], что указывает окрашивание цитоплазмы может показать активированную сигнализацию следующую CCR4-CCL22 лигирования. Необходимы дополнительные исследования, чтобы выявить точные механизмы, лежащие в основе этих ненормальных паттерны экспрессии хемокиновых рецепторов, участвующих в опухолевой прогрессии. Кроме того, медленно усиливается экспрессия CCR4 в предраковых тканях, хотя и статистически недостоверно выше, чем в опухолеподобных прилегающих нормальных тканях, предположил, что CCR4 могут также участвовать в самых предраковых стадиях развития ранней опухоли.
<Р> В нашей предыдущей исследование, мы обнаружили, что CCR4 был избыточно экспрессируется в GC ткани, но мы не нашли существенных различий между пациентами с и без метастазов в лимфатических узлах [18]. Поэтому мы предположили, что рецепторы хемокинов, возможно, также играют важную роль в развитии рака у pN0 пациентов. В настоящем исследовании, наши результаты показали положительную корреляцию между экспрессией CCR4 и Т-стадии, которые должны были в соответствии с нашими данными иммуногистохимических, что экспрессия CCR4 имеет тенденцию к увеличению, как глубина инвазии опухоли прогрессировали. Эффект CCR4 на желудочную раковых клеток вторжения была частично подтверждена Transwell инвазии клеток анализы. Эти анализы проводили в условиях, когда не добавляли экзогенный лиганд рецептора CCR4. Вполне возможно, что различные механизмы могут существовать, чтобы регулировать вторжение опухолевых клеток, опосредованного CCR4 в лиганд-независимым способом, в соответствии с явлением цитоплазматической картины CCR4, что было связано с весьма инвазивного поведения опухолевых клеток в ткани GC. Мы подтвердили, что избыточная экспрессия CCR4 была тесно связана с более высокой степенью опухоли инвазивности, тем самым указывая, что CCR4 сверхэкспрессии могут давать метастатический потенциал в GC клетки и далее способствовать прогрессии опухоли. Мы также предположили, что аутокринные ccr4 лиганды также были вовлечены в подвижности клеток в пробирке
. Концентрации CCL22 в культурных линий надосадочную GC клеток, трансфицированных или без CCR4 были достаточно низкими, как мы оценивали (данные не показаны). Однако возможность нельзя исключать, что аутокринная или паракринная производство CCL22 может способствовать инвазии опухоли через CCL22 /ось ccr4 в естественных условиях
. CCL17 и CCL22, так как высокие ccr4 лиганды сродством, получают с помощью газовой хроматографии и других раковых тканей. В частности, CCL22, который вырабатывается либо раковых клеток или ассоциированных с опухолью макрофаги, сообщается, участвует в метастазировании нескольких видов рака [15-17]. Это наводит на мысль о возможном аутокринную /паракринной цикл с участием CCL22 и ccr4 между различными типами клеток.
<Р> ММР-2 и ММР-9 являются наиболее заинтересованными и хорошо охарактеризованные ММР с сильной протеолитической активностью в внеклеточного матрикса (ECM). Консистенция между режиме реального времени ОТ-ПЦР испытаний и экспериментов желатин зимографии ясно показали, что избыточная экспрессия CCR4 в желудочном раковых клеток значительно усиливается MMP-9 экспрессии и активности. Эти эксперименты также подчеркнул, и указал его действительную роль в опухолевой инвазии при определенных условиях, с или без стимуляции экзогенным CCL22. Считается, что матрица ММР-9 деградирует типа IV коллаген, который является основным компонентом базальной мембраны и связана с вторжением и метастазирование раковых клеток у пациентов с раком желудка [34]. Здесь, мы предоставили новые ключи на базовый механизм, который мог бы способствовать CCR4 желудка вторжение раковых клеток за счет позитивной регуляции MMP-9. Аналогичные наблюдения также были сделаны по отношению к опухолевой инвазии через некоторых рецепторов хемокинов, таких как CXCR4 и CCR7 [19, 20, 22]. И ММР-2, структура которого была похожа на MMP-9, как сообщалось, также связаны с раком желудка [35]. Тем не менее, мы обнаружили, MMP-9, но не ММР-2, был ключевой молекулы, вовлеченной в опухолевой инвазии CCR4 опосредованную, которое может быть связано с различными со-регуляторов, которые взаимодействуют с CCR4 в различных микросреды. Хотя экспрессия ММР-2 в ccr4 трансфецированных клеток рака желудка также, казалось, выше, чем в мнимо трансформированных клеток, разница была статистически незначимой (данные не показаны). Жизнеспособность клеток Анализ показал, что избыточная экспрессия CCR4 не оказывает влияния на рост клеток рака желудка в пробирке
, что согласуется с предыдущими исследованиями, в которых раскрывалось ccr4 лигандов не может индуцировать пролиферацию клеток [14], таким образом, избегая возможно которые могут повлиять на индекс вторжения или ММР-9 количество. Эти анализы проводили с использованием или без экзогенного CCL22, со значительными различиями в экспрессии ММР-9 между CCR4 и напускной трансфицированных клеток. Мы предполагаем возможные механизмы усиления экспрессии ММР-9 по CCR4-избыточная экспрессия может быть частично связано с аутокринном или паракринной выражение CCL22 в естественных условиях
. Тем не менее другие ММР, которые могут быть привлечены к участию в этом процессе и точные сигнальные пути оставались дальнейшего изучения в будущем.
<Р> В заключение, мы уже сообщали, в первый раз, что CCR4 был аберрантно чрезмерно выраженное в Pn0 рака желудка и может способствовать опухолевой инвазии. Кроме того, наши данные показывают, что CCR4-индуцированной ММР-9 производства, возможно, по меньшей мере, частично в основу нового механизма опухолевой инвазии CCR4-опосредованной. Таким образом, антагонисты CCR4 могут быть полезными кандидатами для контроля ранних событий в опухолевой прогрессии.
Поддержка Информация
S1 Рис. Сверхэкспрессия CCR4 не оказывает влияния на рост клеток рака желудка в пробирке
.
После трансфекции с CCR4 или ПРОБНОЙ плазмиды и стимуляции или без экзогенного CCL22, SGC-7901 и КУП-823 клетки пересевали в 96-луночного планшета. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CCK8 в указанные моменты времени
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0120059.s001
(TIF)
Ученые разрабатывают подход к вакцинации от воспаления кишечника
Открытие узкого пищевода
Рыбная слизь может быть потенциальным источником антибиотиков, результаты исследования
Наличие определенных кишечных бактерий у матери может защитить ребенка от пищевой аллергии
Если вам больше 50,
Верхняя эндоскопия
Микробиота кишечника может предсказать тяжесть COVID-19
Пандемия COVID-19 распространяется во все уголки мира. Но не все заболевают одинаково. Новое исследование опубликовано на сервере препринтов medRxiv в апреле 2020 года предполагает, что состав микро
Использование FLUOstar Omega для изучения новых кишечных бактерий, которые могут влиять на наше здоровье
Группа микробной биологии и метагеномики Института диамантина Квинслендского университета использует микропланшетный ридер BMG LABTECH FLUOstar Omega для разработки новых методов изучения микробиома к
Первоначальные результаты проекта «Микробиом человека» вызвали «сотни последующих исследований».
Проект микробиома человека (HMP) - это инициатива, разработанная Национальными институтами здравоохранения для характеристики микробиома человека как у здоровых взрослых, так и у людей с определенными